CN111544357A - 一种积雪草发酵原浆及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种积雪草发酵原浆的制备方法，将积雪草粉末、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为积雪草发酵原浆。本发明所采用的发酵法，在对积雪草有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性。

Description

一种积雪草发酵原浆及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种发酵产品，具体涉及一种具有护肤功能的发酵产品。

背景技术

积雪草是积雪草(拉丁学名：Centella asiatica(L.)Urban)，又称雷公根、铜钱草、马蹄草，为伞形科植物积雪草的全草。积雪草原产于印度，现广泛分布于世界热带、亚热带区，在我国主要分布于长江以南各省。积雪草全草的主要活性成分有积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸。积雪草长久以来被作为健脑药、利尿药和麻风病、溃疡的辅助药以及皮肤病用药。

迄今为止，在护肤品行业中，很多产品会加入积雪草提取物。但绝大多数的护肤品不是发酵护肤品，主要为传统工艺制备，而传统工艺则受限于古人思维，难有突破，甚至当前发现许多护肤品中的植物提取物运用传统的工艺提取，不仅严重耗费药材，非可持续发展，甚至获取物只有很有限的种类与数量，还往往会有一些未知的刺激性，所以应当考虑用新技术。当前许多的发酵宣称护肤品，实际商品往往是仅往护肤品配方中加入一点点的发酵来源成分，导致在配方中，该发酵产物的含量往往只有1-2％，其他都是传统的化工物质，而许多的植物提取物，当中所含的物质本来就已经少量，在配方中继续以这种低比例添加，自然得到很差的功效，虽然外观状态透明清澈，但对消费者来说，根本毫无意义。

背景技术部分的内容仅仅是发明人所知晓的技术，并不当然代表本领域的现有技术。

发明内容

本发明目的是针对现有技术存在问题中的一个或多个，提供一种用积雪草发酵原浆；

本发明的另一目的是提供上述方法制得的发酵原浆的制备方法；

本发明的又一目的是提供上述发酵原浆的应用。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

一种积雪草发酵原浆，由积雪草发酵而成。

根据本发明的一个方面，所述积雪草发酵原浆中含有蛋白质2-8mg/ml、粗多糖2-8mg/ml、总黄酮1-5mg/ml、总酚0.1-1.5mg/ml。

根据本发明的一个方面，积雪草发酵原浆的pH值为4.5-6.8。

根据本发明的一个方面，所述发酵采用酵母菌进行。

根据本发明的一个方面，所述发酵采用黄酒酵母菌；

一种护肤用产品，包括上述的积雪草发酵原浆。

上述的积雪草发酵原浆作为护肤化妆水的应用。

一种积雪草发酵原浆的制备方法，将积雪草粉末、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为积雪草发酵原浆。

根据本发明的一个方面，所述积雪草粉末的目数40-100目，优选为70目。

根据本发明的一个方面，所述积雪草粉末：水的比例为(10-30)g:(100-300)mL。

优选地，所述积雪草粉末：水的质量比为15g:200mL；

根据本发明的一个方面，所述发酵菌液的浓度为10⁵-10⁸CFU/ml；

根据本发明的一个方面，所述发酵菌液与所述积雪草粉末的比例关系为(15-50)ml：(10-30)g。优选地，所述发酵菌液与所述积雪草的混合粉末的比例关系为15ml：10g。

根据本发明的一个方面，所述发酵的发酵温度为30-45℃，优选为37℃；

根据本发明的一个方面，所述发酵的发酵时间为10-50h，优选为38h。

根据本发明的一个方面，所述离心在4000-12000r/min下离心15-30min。

根据本发明的一个方面，所述离心在4500r/min下离心20min；

根据本发明的一个方面，所述离心的离心半径为9-12cm。

根据本发明的一个方面，所述发酵菌为酵母菌；优选地，所述发酵菌为黄酒酵母菌。

根据本发明的一个方面，所述发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：

菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；

菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；

菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度10⁵-10⁸CFU/ml；优选地，所述培养基为PDA培养基。

本发明提供的积雪草发酵原浆可作为护肤品中的有效成分，也可单独作为护肤品应用，具有抗氧化功能和美白的功能。

本发明提供的利用积雪草发酵原浆的制备方法，具有以下优点：

(1)本发明采用酵母菌对积雪草进行发酵，保留了积雪草的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。

(2)本发明所采用的发酵法，在对积雪草有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性。

(3)本发明方法中发酵完成后，发酵原浆中不添加香精等对化学成分，确保产品对人体的安全性。

(4)本发明提供的积雪草发酵原浆中富含具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性物质，从而对皮肤具有较强的美白功能，同时与发酵滤液中的成分具有协同作用。

附图说明

图1为本发明具体实施例中积雪草发酵原浆对DPPH自由基的清除作用曲线；

图2为本发明具体实施例中积雪草发酵原浆对超氧阴离子自由基清除作用曲线；

图3为发明具体实施例中积雪草发酵原浆对酪氨酸酶活性和熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率柱型图；

图4为志愿者1未使用本明产品前用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像；

图5为志愿者1使用本发明产品28天前后用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像；

图6为志原者2未使用本明产品前用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像；

图7为志愿者2使用本发明产品28天前后用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像；

图8为志愿者3未使用本明产品前用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像；

图9为志愿者3使用本发明产品14天前后用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像；

图10为志愿者3使用本发明产品28天前后用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像；

图11为30位受试的志愿者的血红素数据平均后得到的红血丝趋势图。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同结构。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本发明提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所用发酵菌为黄酒酵母菌。

发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：

菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；

菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；和

菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度10⁵-10⁸CFU/ml；优选地，所述培养基为PDA培养基。

菌种活化和菌种纯化是本领域技术人员根据常规手段即可以实现。

实施例1：

将扩培培养基里的发酵菌浓度为10⁵-10⁸CFU/ml的发酵菌菌液22.5mL接种到70目15g的积雪草粉和200ml的水中，并且在37℃培养箱中进行培养24小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在4500r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，收集上清液，即为本发明提供的积雪草发酵原浆，可用于护肤的化妆品，如化妆水、精华液。本实施例的积雪草发酵原浆可直接作为化妆水。

该实施例制备所得的积雪草发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。

对该积雪草发酵原浆化妆品进行成分分析：本发明制得的积雪草发酵原浆化妆品含蛋白质2-8mg/ml、粗多糖2-8mg/ml、总黄酮1-5mg/ml、总酚0.1-1.5mg/ml。

积雪草发酵原浆的抗氧化功效分析：

实验方法(DPPH自由基的清除能力的实验)：

阳性对照用95％乙醇溶解稀释成：0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL、0.01mg/mL系列浓度梯度用以验证试验系统。

受试物处理：水溶性受试物用水稀释为多级浓度样品，油溶性受试物用95％乙醇稀释为多级浓度样品。

表1：样品加液要求

	T-样品管	T0-样品本底	C-DPPH管	C0-溶剂本底
					样品溶液(mL)	1	1	--	--
水或95％乙醇溶剂(mL)	2	2	3	3
					DPPH乙醇溶液(mL)	1	--	1	--
95％乙醇(mL)	--	1	--	1
					平行次数	3/样	1/样	3/实验	1/实验

参考表1，使用10mL试管，设立样品管(T)、样品本底(T0)、DPPH管(C)和溶剂本底(C0),每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管。

在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入1mL相同浓度的样品溶液。

在所有试管中(T、T0、C、C0)补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性样品用95％乙醇，补足3mL，混匀。

在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL,样品本底(T0)和溶剂本底(C0)

方法编号：QL-SOP-YF-3-06

用95％乙醇代替，轻轻摇匀，室温下静置5分钟。

将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。

参见图1，横坐标为积雪草发酵原浆的质量浓度，纵坐标为DPPH自由基清除率。由图1可知，积雪草发酵原浆对DPPH自由基的清除作用明显。随积雪草发酵原浆浓度升高，其对DPPH自由基的清除能力不断增强。15％浓度的积雪草发酵原浆可清除53.8％左右的DPPH自由基，IC50为12.599％。

实验方法(羟自由基的清除能力的实验)：

参考表1，使用10mL，试管设立样品管(T)、样品本底(T0)、空白管(C)、对照管(C0)每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管。

精密移取3mL硫酸亚铁溶液置试管中，依次加入3mL双氧水溶液和3mL水杨酸溶液混匀，于37℃水浴中加热15min；分别加入1mL不同浓度的样品溶液为T，继续加热15min；方法同上，空白管(C)和对照管(C0)以同体积的蒸馏水代替样品，样品本底(T0)和对照管(C0)以同体积蒸馏水代替双氧水反应体系。在510nm处测其吸光度。

由图2可知，积雪草发酵原浆对羟自由基的清除作用明显。随积雪草发酵原浆浓度升高，其对羟自由基的清除能力不断增强。30％浓度的积雪草发酵原浆可清除65.8.7％左右羟自由基，IC50为19.616％。

积雪草发酵原浆的美白功效分析：

酪氨酸酶是黑素生成的关键酶,它控制着黑素的形成过程,其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用,故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。

通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：

按表2配置溶液：

表2、溶液配制列表

单位(mL)	C<sub>1</sub>	C<sub>2</sub>	T<sub>1</sub>	T<sub>2</sub>
					L-酪氨酸	2	2	2	2
样品	0	0	2	2
					PBS	4	5	2	3
酪氨酸酶	1	0	1	0
					总体积	7	7	7	7

注：C₁和T₁加入1mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL。

实验方法：

(1)C₂管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。

(2)C₁管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定C₁吸光度值。

(3)按(1)(2)同样方法，以T₂调零测定T₁吸光度值。

(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)。T(％)＝(C₁-T₁)/C₁×100％

实验证明30％积雪草发酵原浆对酪氨酸酶活性的抑制率为56.40％，1％的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率75％，见附图3。即30％积雪草发酵原浆的美白效果相当于75.2％的1％熊果苷的效果，具有一定的美白功效。

积雪草发酵原浆的淡化红血丝功效分析：

测试前的准备：受试部位测试前2天-3天不能使用任何产品(化妆品或外用药品)，志愿者首先清洁面部，用纸巾轻轻擦干面部皮肤，在室温(22±1)℃，相对湿度40％-60％的条件下休息15分钟后，进行初始测定。同一个受试者的测试必须使用同一个仪器由同一个测量人员完成。

测试方法：测试样品按(2.0±0.1)mg/cm²的用量进行单次涂布，用Antera3D皮肤测试仪拍摄安静状态下受试者脸颊部位图像。调整成血红素模式，测得每个受试者血红素的定量数据。分析区域应尽量避免反光区域黑痣和头发的干扰。同一个受试者的测试必须使用同一个仪器由同一个测量人员完成。

产品使用期间如志愿者皮肤出现不良反应，应立即终止测试，对不良反应应予以记录。

志愿者1：参见图4、5，未使用时红色素指数的平均值为1.212，使用本发明产品28天后的红色素指数的平均值0.8964。

志愿者2：参见图6、7，未使用时红色素指数的平均值为1.559，使用本发明产品28天后的红色素指数的平均值1.27。

志愿者3：参见图8、9、10，未使用时红色素指数的平均值为1.389，使用本发明产品14天后的红色素指数平均值的1.386，使用本发明产品28天后的红色素指数的平均值1.176。

如图11所示，将全部共30位受试的志愿者的血红素数据平均后得到的红血丝趋势图，其中，纵坐标为红色素指数的变化率。

如图11所示，受试者使用积雪草原浆28天后，红血丝水平降低了19.8％。通过实验数据分析，积雪草原浆对皮肤红血丝的改善有效果。

积雪草发酵原浆的安全性评价：

斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对积雪草发酵原浆化妆品进行人体封闭式斑贴试验，对其潜在皮肤刺激性进行评估。

选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。称取0.020g-0.025g将固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。

试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续38h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。

38h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后38h和48h分别再观察一次。

斑贴试验结果如表3：

表3、斑贴试验结果

*"-"＝阴性反应；

"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；

"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；

"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；

"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。

由表3可知，实施例1提供的积雪草发酵原浆在试验中均产生2级反应的不超过1例。经判定，积雪草发酵原浆具有安全性，不会给人体带来不良反应。

实施例2：

将扩培培养基里的发酵菌浓度为10⁵-10⁸CFU/ml的发酵菌菌液50mL接种到40目10g的积雪草粉和300ml的水中，并且在45℃培养箱中进行培养10小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在4000r/min、离心半径为12cm的条件下离心30min，收集上清液，即为本发明提供的积雪草发酵原浆，可用于护肤的化妆品，如化妆水、精华液。本实施例的积雪草发酵原浆可直接作为化妆水。

该实施例制备所得的积雪草发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。

对该积雪草发酵原浆化妆品进行成分分析：本发明制得的积雪草发酵原浆化妆品含蛋白质2-8mg/ml、粗多糖2-8mg/ml、总黄酮1-5mg/ml、总酚0.1-1.5mg/ml。

对本实施例产品积雪草发酵原浆分别进行了如实施例1中的各项分析，结果基本与实施例1相同，在此不做赘述。

实施例3：

将扩培培养基里的发酵菌浓度为10⁵-10⁸CFU/ml的发酵菌菌液15mL接种到100目30g的积雪草粉和100ml的水中，并且在30℃培养箱中进行培养50小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在12000r/min、离心半径为10cm的条件下离心15min，收集上清液，即为本发明提供的积雪草发酵原浆，可用于护肤的化妆品，如化妆水、精华液。本实施例的积雪草发酵原浆可直接作为化妆水。

该实施例制备所得的积雪草发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。

对该积雪草发酵原浆化妆品进行成分分析：本发明制得的积雪草发酵原浆化妆品含蛋白质2-8mg/ml、粗多糖2-8mg/ml、总黄酮1-5mg/ml、总酚0.1-1.5mg/ml。

对本实施例产品积雪草发酵原浆分别进行了如实施例1中的各项分析，结果基本与实施例1相同，在此不做赘述。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种积雪草发酵原浆，其特征在于，由积雪草发酵而成。

2.根据权利要求1所述的积雪草发酵原浆，其特征在于，所述积雪草发酵原浆中含有蛋白质2-8mg/ml、粗多糖2-8mg/ml、总黄酮1-5mg/ml、总酚0.1-1.5mg/ml；

优选地，积雪草发酵原浆的pH值为4.5-6.8。

3.根据权利要求1或2所述的积雪草发酵原浆，其特征在于，所述发酵采用酵母菌进行；

优选地，所述发酵采用黄酒酵母菌。

4.一种护肤用产品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的积雪草发酵原浆。

5.根据权利要求1-3任一项所述的积雪草发酵原浆作为护肤化妆水的应用。

6.一种积雪草发酵原浆的制备方法，其特征在于：将积雪草粉末、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为积雪草发酵原浆。

7.根据权利要求6所述的积雪草发酵原浆的制备方法，其特征在于：其特征在于，

所述积雪草粉末的目数为40-100目，进一步优选为70目；

优选地，积雪草粉末：水的比例为(10-30)g:(100-300)mL；进一步优选地，所述积雪草粉末：水的质量比为15g:200mL；

优选地，所述发酵菌液的浓度为10⁵-10⁸CFU/ml；

优选地，所述发酵菌液与所述积雪草粉末的比例关系为(15-50)ml：(10-30)g；进一步优选地，所述发酵菌液与所述积雪草的混合粉末的比例关系为15ml：10g。

8.根据权利要求6所述的积雪草发酵原浆的制备方法，其特征在于：所述发酵的发酵温度为30-45℃，优选为37℃；

优选地，所述发酵的发酵时间为10-50h，优选为38h。

9.根据权利要求6所述的积雪草发酵原浆的制备方法，其特征在于：所述离心在4000-12000r/min下离心15-30min；

优选地，所述离心在4500r/min下离心20min；

优选地，所述离心的离心半径为9-12cm。

10.根据权利要求6所述的积雪草发酵原浆的制备方法，其特征在于：所述发酵菌为酵母菌；

优选地，所述发酵菌为黄酒酵母菌；

优选地，所述发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：

菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；

菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；

菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度10⁵-10⁸CFU/ml；优选地，所述培养基为PDA培养基。

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