CN117925731A - 一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于日化新材料领域，具体涉及一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，采用半乳糖酵母样菌对积雪草发酵培养液进行发酵制备得到半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物；所述积雪草发酵培养液包括如下成分：积雪草粉末0.01wt%‑5wt%、糖0.1wt%‑10wt%、银耳提取物0.1wt%‑20wt%、酵母抽提物0.1wt%‑5wt%，余量为水。通过该方法制备得到的积雪草发酵产物安全温和无刺激性，同时具有美白、紧致、舒缓、抗皱的护肤功能。本发明的第二个目的在于提供上述提取物的应用。

Description

一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于日化新材料领域，具体涉及一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物及其制备方法和用途。
背景技术
近年来随着时代的发展和消费者日益增长的需求，不断推动着化妆品行业的创新变革。化妆品行业经历了从过去的原生时代的天然植物和香料直接应用于护肤，再到水油乳化技术的广泛应用，推动和诞生了一系列合成糖类、有机酸、酯醇等精细化工原料，这也构成了今天丰富的化学品体系，现在随着纯净美妆、功效型化妆品等概念的兴起，也反映整个化妆品行业对天然纯净的功效原料的日益需求。为了满足消费者对化妆品更高安全性和功效性的追求，不添加任何化学制剂，只通过发酵做出化妆品已经成为发酵类化妆品发展的必然趋势。植物发酵类化妆品的制备由植物原料粉碎或植物汁液经过益生菌发酵后过滤、提纯而得，相较于传统的植物萃取技术，发酵在较温和的条件进行，同时避免传统植物提取中应用的酒精、酸碱等成分，能够更全面、更高程度地保留植物活性成分的功效。
植物发酵的技术流程可以概括为以丰富的植物资源作为原料，利用特定的微生物菌种或益生菌，并结合现代生物技术包括酶工程、分离提取等，实现微生物对植物成分的有效提取和转化。植物发酵技术在化妆品研发方面的优势应用主要体现在两个方面：一方面是利用植物发酵技术可以破除底物里面的屏障物质，使更多的活性物溶出，实现对植物活性成分的有效提取；植物发酵技术还可以降解和转化植物中的毒性物质，使之可以比传统植物提取安全性更高的原料；另外在微生物发酵过程中可以使植物中的功效成分小分子化，并产生新的功效物质获得吸收性更好的原料；在植物发酵的过程中，发酵所用的益生菌也会分泌一系列活性成分对原料具有增强功效的作用。另一方面，植物发酵类化妆品符合化妆品的四大特性——高度的安全性、相对的稳定性、良好的使用性与一定的功效性，通过灭菌活性成分分离提取去除菌体残片和杂质后，可以作为终端化妆品或原料使用。植物发酵化妆品所具有的安全性也是符合纯净美妆的理念，由于采用的是全天然的成分，对消费者的皮肤是安全的，在很大程度上，由于生产工艺的绿色环保，对自然环境也是洁净天然。在功效方面，植物发酵化妆品是通过逐渐调理改善皮肤状态来实现的，而并不是按照现在的观念，在美白、抗皱等方面进行单一位点的改变，植物发酵化妆品强调的是整体的观念。
积雪草（拉丁学名：Centella asiatica (L .) Urban），又称雷公根、铜钱草、马蹄草，为伞形科积雪草属多年生草本植物。积雪草产地较广，在中国诸多省份均有分布，印度、斯里兰卡、马来西亚、印度尼西亚等国家也有分布。积雪草全草的主要活性成分有积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸。积雪草长久以来被作为健脑药、利尿药和麻风病、溃疡的辅助药以及皮肤病用药。
发酵酵母中本身含有很多酵素和微量元素，而发酵过程中又再生丰富的营养产物如小分子肽、氨基酸和小分子多糖，功效就会更全面。酵母发酵物因含有丰富的活性成分（游离氨基酸、小分子肽、维生素等）被广泛应用于化妆品领域中，它们的主要功效有美白、保湿、延缓肌肤老化、调理皮肤的酸碱度和修复受损皮肤等。半乳糖酵母样菌是一种名为覆膜孢酵母属的特殊酵母，在发酵过程中能分泌维他命B群、矿物质、氨基酸、有机酸、无机酸等有益护肤的小分子，将其应用在发酵中，发酵产物具有优异的护肤效果，是一种优异的皮肤调理剂。
目前，半乳糖酵母样菌主要应用在半乳糖、乳糖等糖类的发酵中，产品主要为半乳糖酵母样菌发酵产物滤液等酵母样菌发酵产物，而将其应用在植物发酵生产中尚属空白，利用半乳糖酵母样菌对积雪草进行植物发酵研发的探索以及其制备的化妆品功效测试分析尚未见报道。
现有技术1：CN113509415B公开了一种积雪草发酵滤液的制备方法，包括，取积雪草叶片，粉碎过60~100目筛，按照50~75g/L的添加量加入去离子水中，同时加入10g/L的葡萄糖，调节体系pH为4.5~5.0，制得发酵培养基；将发酵培养基在121℃、0.1MPa的条件下灭菌20min，制得灭菌后的发酵培养基；将植物乳杆菌接种于MRS培养基中，于37℃，200rpm培养18~24h，待菌体浓度达到106~107 CFU/mL时，以5%~10%的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中，将接种植物乳杆菌后的培养基于35±2℃，200rpm培养48~72h，待残糖为0时，终止发酵；发酵结束后的发酵液在121℃、0.1MPa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液先由200~300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经陶瓷膜过滤，得到积雪草发酵滤液；其中，积雪草发酵滤液中，羟基积雪草苷含量为1.5~5g/L，羟基积雪草二糖苷和羟基积雪草单糖苷含量分别为0.5~4g/L、0.5~3g/L。
现有技术2：CN116549356A公开了一种积雪草发酵液及其制备方法和应用，属于化妆品技术领域，所述积雪草发酵液的制备方法，包括以下步骤：1)新鲜的积雪草花/叶/茎与水混合打浆获得积雪草浆；2)向所述积雪草浆中添加葡萄糖后进行高温灭菌获得灭菌后的积雪草浆；3)向所述灭菌后的积雪草浆中接种植物乳杆菌和酵母菌进行第一发酵；4)对第一发酵液进行固液分离，收集液相组分获得第一清液；5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌进行第二发酵；6)对第二发酵液进行固液分离，收集上清液为积雪草发酵液。
现有技术3：CN111544357B公开了一种积雪草发酵原浆及其制备方法、应用，所述积雪草发酵原浆的制备方法为：将积雪草粉末、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为积雪草发酵原浆；所述发酵采用黄酒酵母菌。
由此可见，积雪草发酵液的工艺较为成熟，现有工艺的区别在于发酵菌种的区别以及发酵工艺点的区别；发酵菌种较为惯常采用植物乳杆菌、酵母菌、黄酒酵母菌中一种或多种组合。
在研究中发现，影响积雪草发酵液性能的并不仅仅限于以上因素。
所以，本案解决的技术问题是：如何改善积雪草发酵液在酪氨酸酶抑制率、弹性蛋白酶抑制率、透明质酸酶抑制率、DPPH自由基清除率等方面的功效。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物及其制备方法，通过该方法制备得到的积雪草发酵产物安全温和无刺激性，同时具有美白、紧致、舒缓、抗皱的护肤功能。
本发明的第二个目的在于提供上述提取物的应用。
为达到第一个发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，采用半乳糖酵母样菌对积雪草发酵培养液进行发酵制备得到半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物；
所述积雪草发酵培养液包括如下成分：积雪草粉末0.01wt%-5wt%、糖0.1wt%-10wt%、银耳提取物0.1wt%-20wt%、酵母抽提物0.1wt%-5wt%，余量为水；
所述半乳糖酵母样菌的分类学名称为：Geotrichum candidum；所述半乳糖酵母样菌的拉丁文学名为：Geotrichum candidum 白地霉；所述半乳糖酵母样菌的保藏编号：GDMCC No： 64235；保藏日期：2024年1月2日；保藏单位：广东微生物菌种保藏中心（GDMCC）；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
在上述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法中，所述半乳糖酵母样菌预先经过活化处理得到半乳糖酵母样菌种子液，将半乳糖酵母样菌种子液加入到积雪草发酵培养液进行发酵制备得到半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物；
所述活化处理的工艺为：
向灭菌后的活化培养基中加入半乳糖酵母样菌液，一级培养得到半乳糖酵母样菌活化液。
向灭菌后的种子培养基中加入半乳糖酵母样菌活化液，二级培养得到半乳糖酵母样菌种子液；
所述活化培养基、种子培养基均包含如下成分：糖0.1wt%-10wt%、银耳提取物0.1wt%-20wt%、酵母抽提物0.1wt%-5wt%，余量为水。
在上述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法中，所述积雪草发酵培养液、活化培养基、种子培养基中的糖各自独立为葡萄糖、乳糖、半乳糖中的一种或多种组合。
在上述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法中，所述半乳糖酵母样菌和积雪草发酵培养液的质量比为0.01-5：100；每克半乳糖酵母样菌中活菌含量为1x106～1x107CFU/g。
在上述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法中，所述发酵温度为25℃-45℃；所述发酵时间为6h-72h。
在上述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法中，所述发酵温度为28℃；所述发酵时间为24h。
在上述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法中，所述发酵操作在发酵罐中进行，发酵罐设定溶氧含量数值为10-50%，发酵罐根据溶氧数值自动调节发酵罐搅拌转速。
在上述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法中，所述积雪草发酵培养液包括如下成分：积雪草粉末0.1wt%-0.5wt%、糖0.3wt%-5wt%、银耳提取物0.3wt%-5wt%、酵母抽提物0.1wt%-2wt%，余量为水。
同时，本发明还公开了一种积雪草发酵产物，采用如上任一所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法制备得到。
在上述的积雪草发酵产物中，含有蛋白质3.0-6.0mg/mL、总多糖1.0-3.0mg/mL、总黄酮含量0.3-0.6mg/mL。
最后，本发明还公开了如上所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物制备化妆品的用途。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明选用半乳糖酵母样菌对积雪草发酵培养液进行发酵，积雪草发酵培养液中引入了银耳提取物，银耳提取物主要成分为多糖类化合物，最具代表性的是银耳酸性异多糖,其结构是以α-甘露聚糖为主链，以β-(1,2)L-木糖、β-(1,2)葡萄糖醛酸和少量的岩藻为侧链。其他几种多糖体是中性杂多糖，由木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄醛酸组成。银耳酸性异多糖在培养液中所起到的作用是其能够提高菌体的活性，促进菌体快速生长，进而达到提高发酵产物的护肤功效的目的。
本发明在积雪草发酵培养液中引入了酵母抽提物，酵母抽提物中富含氨基酸、肽、核苷酸等酵母细胞中的可溶性成分，在培养液中所起到的作用是供给菌体生长所需的营养物，进而一方面实现高密度半乳糖酵母样菌细胞扩大培养的目的，另一方面达到提高发酵产物的护肤功效的目的。
本发明利用液态高密度发酵技术，实现高密度半乳糖酵母样菌细胞扩大培养，半乳糖酵母样菌在自身代谢过程中一方面对积雪草活性成分进行高效提取，同时降解天然植物的毒性，另一方面分泌自身酵母性活性成分，从而使该半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物具有良好的安全温和无刺激性，同时具有美白、紧致、舒缓、抗皱的护肤功能。
作为本发明的进一步优化，通过对半乳糖酵母样菌进行二次活化培养，采用银耳提取物、酵母抽提物作为活化培养基的活性成分之一，其可提高半乳糖酵母样菌的活性，使其对积雪草发酵培养液适应性更高，进一步实现高密度半乳糖酵母样菌细胞扩大培养的目的。
附图说明
图1为实施例1的安全性测试结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
供应商信息和/或商品信息
积雪草粉末：南昌考拉丁丁食品有限公司，500g/袋；
银耳提取物：河南龙腾生物工程有限公司，多糖含量50%，500g/袋；
酵母抽提物：广州鼎国生物技术有限公司，500g/瓶，品牌OXOID，型号LP0021B，来源：进口；
半乳糖酵母样菌的保藏信息如下：
半乳糖酵母样菌的分类学名称为：Geotrichum candidum；半乳糖酵母样菌的拉丁文学名为：Geotrichum candidum 白地霉；
半乳糖酵母样菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号：GDMCCNO：64235，保藏日期：2024年1月2日；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例1
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
步骤1：按照每1kg含银耳提取物10g、葡萄糖20g、酵母抽提物5g，余量为水的比例混合配制活化培养基和种子培养基，调节溶液pH值为6.0，并将上述培养基进行121℃，20min高温高压灭菌，待其冷却后加入1g冷冻保藏的半乳糖酵母样菌液（浓度为1x106CFU/g）于活化培养基中进行一级培养。设置恒温培养温度28℃，培养24h得到半乳糖酵母样菌活化液，经检测，半乳糖酵母样菌活化液中活菌浓度为0.9x108CFU/g。
步骤2：一级培养结束后，向种子培养基中接种新鲜的半乳糖酵母样菌活化液，28℃恒温培养24h得到半乳糖酵母样菌种子液，经检测，半乳糖酵母样菌种子液中活菌浓度为1.5x109CFU/g。
每1kg种子培养基中加入的半乳糖酵母样菌活化液的重量为2g。
步骤3：按照每1kg含银耳提取物20g、葡萄糖20g、乳糖10g、积雪草粉末5g、酵母抽提物10g，余量为水的比例混合配制发酵培养基。二级培养结束后，向发酵培养基中接种新鲜半乳糖酵母样菌种子液，每1kg发酵培养基中接种半乳糖酵母样菌种子液2g，并设置发酵罐溶氧含量数值为30%，搅拌转速关联溶氧含量，自动补偿调节转速，28℃发酵培养时间24h。
发酵培养结束后，将发酵液进行121℃，20min高温高压灭菌，随后使用15000rpm对菌体和发酵培养液进行分离，收集离心后的发酵上清液。对灭菌后的发酵上清液过滤得到半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物。
实施例2
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，按照每1kg含银耳提取物10g、葡萄糖25g、乳糖12.5g、积雪草粉末2.5g、酵母抽提物20g，余量为水的比例混合配制发酵培养基。
按照每1kg含银耳提取物10g、葡萄糖25g、乳糖12.5g、酵母抽提物20g，余量为水的比例混合配制活化培养基和种子培养基。
实施例3
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，按照每1kg含银耳提取物30g、葡萄糖10g、乳糖10g、积雪草粉末1.25g、酵母抽提物2g，余量为水的比例混合配制发酵培养基。
按照每1kg含银耳提取物30g、葡萄糖10g、乳糖10g、酵母抽提物2g，余量为水的比例混合配制活化培养基和种子培养基。
实施例4
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，按照每1kg含银耳提取物2g、葡萄糖40g、乳糖5g、积雪草粉末0.625g、酵母抽提物15g，余量为水的比例混合配制发酵培养基。
按照每1kg含银耳提取物2g、葡萄糖40g、乳糖5g、酵母抽提物15g，余量为水的比例混合配制活化培养基和种子培养基。
实施例5
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，每1kg发酵培养基中接种半乳糖酵母样菌种子液5g。
实施例6
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，每1kg发酵培养基中接种半乳糖酵母样菌种子液10g。
实施例7
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，按照每1kg含葡萄糖20g，余量为水的比例混合配制活化培养基和种子培养基。
对比例1
一种酿酒酵母菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，将发酵菌种替换为酿酒酵母菌。
对比例2
一种植物乳杆菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，将发酵菌种替换为植物乳杆菌。
对比例3
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，发酵培养基中不含银耳提取物，其具体组成为：葡萄糖20g、乳糖10g、积雪草粉末5g、酵母抽提物10g，余量为水。
对比例4
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，发酵培养基中不含酵母抽提物，其具体组成为：葡萄糖20g、乳糖10g、银耳提取物20g、积雪草粉末5g，余量为水。
对比例5
一种半乳糖酵母样菌雪莲花发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，将积雪草粉末替换为雪莲花粉末。
对比例6
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，将银耳提取物替换为含葡聚糖的燕麦提取物。
性能测试
测试例1：半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的安全性测试
一、测试方法
（1）斑马鱼急性毒性测试
试验组别处理与试剂
样品：实施例1所制备的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物用鱼胚胎培养液分别稀释20倍、50倍、100倍、200倍。
空白对照：鱼胚胎培养液。
阳性对照：4.0 mg/L 3,4-二氯苯胺溶液。
试验步骤
精密称取7.000g氯化钠，0.400g碳酸氢钠，0.100g氯化钾，0.235g无水氯化钙，用蒸馏水或去离子水溶解并定容至2000mL。灭菌，0.2μL过滤备用即得鱼胚胎培养液。在96孔板中，样品组加入0.2 mL测试溶液，空白对照组加入等量的鱼胚胎培养液、阳性对照组加入等量的4.0 mg/L 3,4-二氯苯胺溶液。每个浓度均设12个平行孔，每孔加入1 粒斑马鱼胚胎。将96孔板置于28.5±0.5℃恒温箱中暴露48±2小时。暴露结束后，在显微镜下观察每粒鱼胚胎。
结果计算
计算半数致死浓度（LC50）：采用常用统计方法（如概率单位法）对鱼胚胎死亡率和样本测试浓度之间进行剂量反应曲线拟合计算半数致死浓度（LC50）和95%置信区间。
结果判定标准
LC50＞1000mg/L，实际无毒；
1000mg/L≥LC50≥101mg/L，低毒；
100mg/L≥LC50≥10mg/L，中毒；
LC50＜10mg/L：高毒。
（2）鸡胚绒毛尿囊膜试验
试验组别处理与试剂
样品：实施例1及对比例1所制备的积雪草发酵产物。
阴性对照：生理盐水。
阳性对照：0.1mol/L NaOH溶液。
试验步骤
参考图1，本次测试每组选用6只鸡胚，用拍照设备记录绒毛尿囊膜的情况，将聚四氟乙烯树脂环置于鸡胚的绒毛尿囊膜上并拍照记录。把待测样品加至聚四氟乙烯树脂环内，记录加样品的时间并用润湿的保鲜膜盖在气室上，把鸡胚移至恒温恒湿箱内培养，观察每种毒性效应变化的程度。
结果计算
采用终点评价法进行试验，计算终点评价（ES），结果保留小数点后两位；每只鸡胚记分为每只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度的和；ES-6鸡胚得到的数学总和的平均值。
按照以下公式计算ES平均分值：
。
结果判定标准
ES≤4，无刺激性；
4＜ES≤12，轻刺激性；
12＜ES＜16，中度刺激性；
ES≥16，强刺激性/腐蚀性。
二、测试结果
斑马鱼急性毒性测试结果如表1所示：
表1
LC50值 结果
实施例1 41233 无刺激性
由表1可知，实施例1所制备得到的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的斑马鱼半数致死浓度（LC50）值为41233mg/L，远超过无毒标准LC50＞1000mg/L。此外，实施例2～7与实施例1区别之一为添加更少量或等量的积雪草粉末，因此可说明实施例1～7所制备的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物通过斑马鱼急性毒性测试，对肌肤具有良好的安全温和无刺激性。
鸡胚绒毛尿囊膜试验测试结果如表2所示：
表2
分值 结果
阴性对照 0.00 无刺激性
实施例1 3.67 无刺激性
对比例1 2.33 无刺激性
由表2可知，实施例1及对比例1所制备的积雪草发酵产物对鸡胚绒毛尿囊膜均无刺激性，实施例2～7和对比例2～4以及对比例6分别与实施例1和对比例1所制备的发酵产物区别仅为添加更少量或等量的积雪草粉末，因此可说明实施例1～7所制备的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物和对比例1～4以及对比例6所制备的积雪草发酵产物对鸡胚绒毛尿囊膜均无刺激性。
测试例2：积雪草或雪莲花发酵产物的功效测试
一、测试方法
（1）酪氨酸酶抑制率测试
试验组别处理与试剂
样品：实施例1～7和对比例1～6所制备的积雪草或雪莲花发酵产物。
阳性对照：1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.04 mg/mL、0.008 mg/mL的曲酸溶液（用pH6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液）。
阴性对照：纯水。
试剂：酪氨酸酶溶液：用pH6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制，100u/mL；左旋多巴溶液：用pH6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制，1mg/mL。
试验步骤
依据标准T/SHRH 015-2018《化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法》进行检测。参照表3，使用10mL试管设立样品管（T）、样品本底（T0）、酶反应管（C）和溶剂本底（C0），每一样品的每个受试浓度的样品管（T）需设立3支平行管，同时酶反应管（C）也需设立3支平行管。
表3 样品加液要求
T-样品管 T0-样品本底 C-DPPH 管 C0-溶剂本底
样品溶液（mL） 1 1 — —
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（mL） — 0.5 1 1.5
酪氨酸酶溶液（mL） 0.5 — 0.5 —
左旋多巴溶液（mL） 2 2 2 2
平行次数 3/样 1/样 3/试验 1/试验
在样品管（T）和样品本底（T0）中各加入 1mL 相同浓度的样品溶液，酶反应管（C）和溶剂本底（C0）则分别加入1mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。在样品管（T）和酶反应管（C）中各加入0.5 mL酪氨酸酶溶液，样品本底（T0）与溶剂本底（C0）以0.5mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液代替，将样品和酪氨酸酶充分混匀，置 37℃水浴槽孵育10min。依次在各管中加入2mL的左旋多巴溶液，控制每管反应时间为5min，即刻将各管反应溶液移入比色皿中，在475nm处测定吸光值。
结果计算
按照以下公式计算酪氨酸酶抑制率%：
；
式中
T—为样品管吸光度，即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值；
T0—为样品本底吸光值；
C—为酶反应管吸光值3次平均值，即未加样品时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值；
C0—为溶剂本底吸光值。
结果判定标准
阳性对照酪氨酸酶抑制率＞50%，反应体系有效。当样品酪氨酸酶抑制率与阴性对照相比具有显著性差异（P＜0.05），则可认为试验样品具有一定的美白功效。
（2）弹性蛋白酶抑制率测试
试验组别处理与试剂
样品：实施例1～7和对比例1～6所制备的积雪草或雪莲花发酵产物。
阳性对照：0.1% 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，98%）水溶液。
阴性对照：纯水。
试剂：弹性蛋白酶（猪胰），BR；N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸，98%；EGCG，98%。
试验步骤
设立样品组、样品本底组、溶剂组和溶剂本底组，每个组别需设立3个平行，在96孔板中分别加入不同试剂溶液，轻轻摇匀，25℃孵育15min后，将其放在酶标仪中，在410nm处测定吸光值。
结果计算
按照以下公式计算弹性蛋白酶抑制率%：
；
式中：
A—为不含样品的反应溶液的吸光度；
B—为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；
C—为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；
D—为含有样品和不含酶的反应溶液的吸光度。
数据分析
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物弹性蛋白酶抑制率之间的比较采用独立样本t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为a=0.05。P≥0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
结果判定标准
样品弹性蛋白酶抑制率高于阴性对照且具有显著性差异（P＜0.05），则可认为试验样品具有一定的紧致功效。
（3）透明质酸酶抑制率测试
试验组别处理与试剂
样品组：实施例1～7和对比例1～6所制备的积雪草或雪莲花发酵产物。
阳性对照组：3%甘草酸二钾水溶液（甘草酸二钾，纯度≥98%）。
阴性对照组：纯水。
试剂：透明质酸酶，BR；透明质酸钠，BR。
试验步骤
设立样品组、样品本底组、溶剂组和溶剂本底组，每个组别需设立3个平行，分别在四组中加入不同试剂溶液，摇匀，室温放置30min显色，用紫外分光光度计测定波长为528nm处吸光度值。
结果计算：按照以下公式计算透明质酸酶抑制率%：
；
式中：
A—为不含样品的反应溶液的吸光度；
B—为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；
C—为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；
D—为含有样品和不含酶的反应溶液的吸光度。
数据分析
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物透明质酸酶抑制率之间的比较采用独立样本t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为a=0.05。P≥0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
结果判定标准
样品透明质酸酶抑制率高于阴性对照且具有显著性差异（P＜0.05），则可认为试验样品具有一定的舒缓功效。
（4）DPPH自由基清除率测试
试验组别处理与试剂
样品：实施例1～7和对比例1～6所制备的积雪草或雪莲花发酵产物。
阳性对照：0.1%维生素E（纯度≥95%）的乙醇（95%）溶液。
阴性对照：纯水。
试验步骤
设立样品管、样品本底管、DPPH管和溶剂本底管，每个组别需设立3个平行管，分别在四个组别中加入不同试剂溶液，轻轻摇匀，室温下静置5min。将各组反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。
结果计算
按照以下公式计算DPPH自由基清除率%：
；
式中：
T—为样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0—为样品本底吸光值；
C—为DPPH管吸光值3次平行值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0—为含溶液本底吸光值。
数据分析
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物DPPH自由基清除率之间的比较采用独立样本t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为a=0.05。P≥0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
结果判定标准
样品DPPH自由基清除率高于阴性对照且具有显著性差异（P＜0.05），则可认为试验样品具有一定的抗皱功效。
二、测试结果：
（1）酪氨酸酶抑制率的测试结果如表4所示：
表4
名称 试验结果 P值
实施例1 83.773±0.781 ＜0.05
实施例2 76.059±0.747 ＜0.05
实施例3 56.910±0.166 ＜0.05
实施例4 3.239±1.481 ＜0.05
实施例5 73.762±0.857 ＜0.05
实施例6 67.121±0.761 ＜0.05
实施例7 19.262±0.750 ＜0.05
对比例1 -32.804±0.672 /
对比例2 -8.345±1.015 /
对比例3 27.688±2.406 ＜0.05
对比例4 62.546±0.689 ＜0.05
对比例5 61.756±0.825 ＜0.05
对比例6 56.165±0.454 ＜0.05
阴性对照 -1.467±0.130 /
阳性对照 96.314±0.672 ＜0.05
结果分析：
1.由表4可知，实施例1～3所制备的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物对酪氨酸酶都有显著的抑制效果。
2.通过实施例1（2g）、实施例5（5g）和实施例6（10g）的对比可知，种子液的接种量的不同，对酪氨酸酶的抑制效果有所不同，但是三者均具有显著抑制效果。
3.通过实施例1和实施例7的对比可知，半乳糖酵母样菌的活化手段不同，在不采用银耳提取物、酵母抽提物进行活化时，半乳糖酵母样菌的活性略差，导致相比实施例1，实施例7酪氨酸酶的抑制效果有所降低。
4.通过实施例1和对比例1、2的对比可知，不同的发酵菌种得到的发酵产物的效果是不同的，其中普通酿酒酵母发酵所制备得到的积雪草发酵产物对酪氨酸酶完全没有抑制作用，一方面这种美白效果的产生可能是由半乳糖酵母样菌在代谢过程中产生的自分泌成分引起的。另一方面，也可能由于半乳糖酵母样菌在对积雪草发酵过程中，产生了新的美白功效成分。这都表明半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物具有优异的美白护肤效果；
用植物乳杆菌对积雪草进行发酵能够起到一定的效果，但其有效性不及实施例1；
通过实施例1和对比例1、2的对比可以证实，不同的发酵菌由于发酵机理不同，其发酵产物存在一定的差异性，导致美白效果也有所差异。
5.通过实施例1和对比例3、6的对比可知，银耳多糖对于发酵产物的酪氨酸酶抑制效果的发挥具有决定性的作用。参考对比例3，当银耳提取物消失时，对酪氨酸酶的抑制效果显著降低；参考对比例6，不同多糖对酪氨酸酶的抑制效果具有一定的促进作用，但其促进效果明显不及实施例1；
同时，通过实施例1和对比例5的对比可知，对其他植物成分如雪莲花进行发酵，酪氨酸酶的抑制效果虽存在略微不足，但是从另外一个角度来看，其他本领域常用的植物护肤成分用半乳糖酵母样菌进行发酵，同样能表现出非常优异的效果。
6.通过实施例1和对比例4的对比可知，酵母抽提物对发酵产物的影响为提升护肤功效，产生该效果的原因在于：酵母抽提物中富含氨基酸、肽、核苷酸等存在于酵母细胞中的可溶性成分，这些成分在培养液中主要起供给菌体生长所需的营养物的作用，进而一方面实现高密度半乳糖酵母样菌细胞扩大培养的目的，另一方面提升菌体活性，更有利于菌体转化和代谢植物成分，提升发酵产物的护肤功效。
（2）弹性蛋白酶抑制率的测试结果如表5所示：
表5
名称 试验结果 P值
实施例1 57.724±2.439 ＜0.05
实施例2 54.795±6.278 ＜0.05
实施例3 45.528±2.816 ＜0.05
实施例4 14.634±1.408 ＜0.05
实施例5 42.017±2.521 ＜0.05
实施例6 37.815±1.456 ＜0.05
实施例7 40.336±2.911 ＜0.05
对比例1 46.465±3.499 ＜0.05
对比例2 53.274±3.896 ＜0.05
对比例3 47.899±5.248 ＜0.05
对比例4 36.975±2.521 ＜0.05
对比例5 39.496±1.456 ＜0.05
对比例6 41.176±1.456 ＜0.05
阴性对照 -4.762±2.425 /
阳性对照 87.831±1.587 ＜0.05
结果分析：
1.由表5可知，实施例1～3所制备的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物对弹性蛋白酶都有显著的抑制效果。
2.通过实施例1（2g）、实施例5（5g）和实施例6（10g）的对比可知，种子液的接种量的不同，对弹性蛋白酶的抑制效果有所不同，但是三者均具有显著抑制效果。
3.通过实施例1和实施例7的对比可知，半乳糖酵母样菌的活化手段不同，在不采用银耳提取物、酵母抽提物进行活化时，半乳糖酵母样菌的活性略差，导致相比实施例1，实施例7弹性蛋白酶的抑制效果有所降低。
4.通过实施例1和对比例1、2的对比可知，不同的发酵菌种得到的发酵产物的效果不同，即采用相同制备方法处理，半乳糖酵母样菌比普通酿酒酵母、植物乳杆菌发酵所制备得到的积雪草发酵产物对弹性蛋白酶抑制率更高，表明半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物具有更优异的紧致功效；
通过实施例1和对比例1、2的对比可以证实，不同的发酵菌由于发酵机理不同，其发酵产物存在一定的差异性，导致紧致效果也有所差异。
5.通过实施例1和对比例3、6的对比可知，银耳多糖对于发酵产物的活性发挥具有决定性的作用，但是在该性能的决定性方面不及酪氨酸酶的抑制效果。参考对比例3，当银耳提取物消失时，其对弹性蛋白酶的抑制效果显著降低；参考对比例6，其他多糖会有一定的促进效果，但是其对于弹性蛋白酶的抑制效果的促进效果明显不及实施例1；结合对比例4看，在弹性蛋白酶的抑制效果方面，酵母抽提物对活化半乳糖酵母样菌进而所起到的作用或许更明显；参考实施例1和对比例5，其结果和酪氨酸酶的抑制效果存在一致性。
6.通过实施例1和对比例4的对比可知，酵母抽提物对于发酵产物的弹性蛋白酶抑制率具有一定的影响。
（3）透明质酸酶抑制率的测试结果如表6所示：
表6
名称 试验结果 P值
实施例1 53.793±0.517 ＜0.05
实施例2 68.033±0.710 ＜0.05
实施例3 31.897±1.663 ＜0.05
实施例4 11.379±0.597 ＜0.05
实施例5 35.913±1.575 ＜0.05
实施例6 46.032±0.687 ＜0.05
实施例7 37.698±1.718 ＜0.05
对比例1 56.338±1.291 ＜0.05
对比例2 40.084±0.967 ＜0.05
对比例3 57.143±0.344 ＜0.05
对比例4 36.905±0.595 ＜0.05
对比例5 41.667±1.913 ＜0.05
对比例6 59.524±0.909 ＜0.05
阴性对照组 -3.131±1.356 /
阳性对照组 57.730±0.587 ＜0.05
结果分析：
1.由表6可知，实施例1～3所制备的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物对透明质酸酶都有显著的抑制效果。
2.通过实施例1（2g）、实施例5（5g）和实施例6（10g）的对比可知，种子液的接种量的不同，对透明质酸酶的抑制效果有所不同，但是三者均具有显著抑制效果。
3.通过实施例1和实施例7的对比可知，半乳糖酵母样菌的活化手段不同，在不采用银耳提取物、酵母抽提物进行活化时，半乳糖酵母样菌的活性略差，导致相比实施例1，实施例7弹性蛋白酶的抑制效果有所降低。
4.通过实施例1和对比例1、2的对比可知，不同的发酵菌种得到的发酵产物的效果不同，半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物、植物乳杆菌积雪草发酵产物的透明质酸酶抑制率稍弱于普通酿酒酵母积雪草发酵产物，这可能与普通酿酒酵母自分泌成分有关。
5.通过实施例1和对比例3、6可见，在之前的案例中虽然已经证实了银耳多糖可能对发酵产物的活性发挥具有决定性的作用，但是在透明质酸酶抑制率方面，银耳多糖并无决定性的影响，可能的推测为：透明质酸酶抑制率的决定性因素并不在发酵，而是在植物有效成分的用量大小，如实施例4；并且有很多植物成分都能够决定透明质酸酶抑制率，如对比例5。
6.通过实施例1和对比例4的对比可见，酵母抽提物对于发酵产物的透明质酸酶抑制率具有一定的影响。
（4）DPPH自由基清除率的测试结果如表7所示：
表7
名称 试验结果 P值
实施例1 63.030±5.533 ＜0.05
实施例2 45.288±1.139 ＜0.05
实施例3 36.438±1.792 ＜0.05
实施例4 29.424±1.212 ＜0.05
实施例5 39.257±2.088 ＜0.05
实施例6 37.701±0.310 ＜0.05
实施例7 37.225±2.124 ＜0.05
对比例1 39.079±0.730 ＜0.05
对比例2 54.637±0.660 ＜0.05
对比例3 42.640±0.879 ＜0.05
对比例4 35.707±0.057 ＜0.05
对比例5 36.968±0.118 ＜0.05
对比例6 37.627±0.241 ＜0.05
阴性对照组 -0.547±0.215 /
阳性对照组 92.555±0.109 ＜0.05
结果分析：
1.由表7可知，实施例1～3所制备的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物对DPPH自由基清除率都有显著的提升效果。
2.通过实施例1和实施例5、6的对比可知，种子液的接种量的不同，对DPPH自由基清除率的提升效果有所不同，但是三者均具有显著抑制效果。
3.通过实施例1和实施例7的对比可知，半乳糖酵母样菌的活化手段不同，在不采用银耳提取物、酵母抽提物进行活化时，半乳糖酵母样菌的活性略差，导致相比实施例1，实施例7的DPPH自由基清除率的提升效果有所降低。
4.通过实施例1和对比例1、2的对比可知，不同的发酵菌种得到的发酵产物的效果是不同的，半乳糖酵母样菌比普通酿酒酵母、植物乳杆菌发酵所制备得到的积雪草发酵产物对DPPH自由基清除率更高，表明半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物具有更优异的抗皱功效。
5.通过实施例1和对比例3、6的对比可知，银耳多糖对于发酵产物的活性发挥具有决定性的作用。参考对比例3，当银耳提取物消失时，其对DPPH自由基清除率的提升效果显著降低；参考对比例6，其他多糖对DPPH自由基清除率的提升效果会有一定的促进效果，但是其促进效果明显不及实施例1；参考实施例1和对比例5，两者结果和酪氨酸酶的抑制效果存在一致性。
对实施例1～7制得的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物进行成分分析：本发明制得的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物含蛋白质3.0-6.0mg/mL、总多糖1.0-3.0mg/mL、总黄酮0.3-0.6mg/mL。
对对比例1～4以及对比例6制得积雪草发酵产物进行成分分析：其中，蛋白质3.0-6.0mg/mL、总多糖1.0-3.0mg/mL、总黄酮0.3-0.6mg/mL。
从产品成分角度来说，不同发酵手段，在主要成分上并不会表现出非常显著的差异，由于发酵菌种、工艺条件、培养基等不同，会导致有效成分的组成有主要变化，最终导致产品性能出现显著性差异。
应用例：一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物精华液，由A相和B相组成。
A相包含以下质量百分比的各组分：80g半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物、8g1,3-丙二醇、2g甘油、0.5gPEG/PPG-14/7 二甲基醚、0.2g黄原胶、0.08g透明质酸钠、0.05gEDTA二钠，8.32g水。
B相包含以下质量百分比的各组分：0.6g1,2-己二醇、0.2g苯氧乙醇和0.05g辛酰羟肟酸。
一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物精华液，B相先预先加热溶解完全，将A相加入至乳化锅中，加热至85℃，搅拌均匀，接着降温至45℃，加入预溶的B相，30r/min搅拌10min，得到半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物精华液。

Claims (11)

1.一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，采用半乳糖酵母样菌对积雪草发酵培养液进行发酵制备得到半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物；
所述积雪草发酵培养液包括如下成分：积雪草粉末0.01wt%-5wt%、糖0.1wt%-10wt%、银耳提取物0.1wt%-20wt%、酵母抽提物0.1wt%-5wt%，余量为水；
所述半乳糖酵母样菌的保藏编号：GDMCC No： 64235；保藏日期：2024年1月2日；保藏单位：广东微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.根据权利要求1所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，所述半乳糖酵母样菌预先经过活化处理得到半乳糖酵母样菌种子液，将半乳糖酵母样菌种子液加入到积雪草发酵培养液进行发酵制备得到半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物；
所述活化处理的工艺为：
向灭菌后的活化培养基中加入半乳糖酵母样菌液，一级培养得到半乳糖酵母样菌活化液；
向灭菌后的种子培养基中加入半乳糖酵母样菌活化液，二级培养得到半乳糖酵母样菌种子液；
所述活化培养基、种子培养基均包含如下成分：糖0.1wt%-10wt%、银耳提取物0.1wt%-20wt%、酵母抽提物0.1wt%-5wt%，余量为水。
3.根据权利要求1或2所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，所述积雪草发酵培养液、活化培养基、种子培养基中的糖各自独立为葡萄糖、乳糖、半乳糖中的一种或多种组合。
4.根据权利要求2所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，所述半乳糖酵母样菌种子液和积雪草发酵培养液的质量比为0.01-5：100；每克半乳糖酵母样菌液中活菌含量为1x106 ～1x107CFU/g。
5.根据权利要求1所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为25℃-45℃；所述发酵时间为6h-72h。
6.根据权利要求5所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为28℃；所述发酵时间为24h。
7.根据权利要求1所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，所述发酵操作在发酵罐中进行，发酵罐设定溶氧含量数值为10-50%，发酵罐根据溶氧数值自动调节发酵罐搅拌转速。
8.根据权利要求1所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法，其特征在于，所述积雪草发酵培养液包括如下成分：积雪草粉末0.1wt%-0.5wt%、糖0.3wt%-5wt%、银耳提取物0.3wt%-5wt%、酵母抽提物0.1wt%-2wt%，余量为水。
9.一种半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物，其特征在于，采用如权利要求1-8任一所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物的制备方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物，其特征在于，含有蛋白质3.0-6.0mg/mL、总多糖1.0-3.0mg/mL、总黄酮含量0.3-0.6mg/mL。
11.如权利要求9或10所述的半乳糖酵母样菌积雪草发酵产物制备化妆品的用途。
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