CN113499295A - 一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法和应用 - Google Patents
一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法和应用。本发明的制备方法是：以益生菌布氏乳杆菌为发酵菌种，对中药菟丝子进行生物发酵，再经过过滤、微滤等步骤获得菟丝子发酵活性提取液。在布氏乳杆菌的生物作用下，菟丝子多糖被降解，多糖分子量显著降低。所制备的菟丝子发酵活性提取液中的总糖、黄酮及氨基酸含量相比普通水提法有明显提升。本发明采用天然植物原料辅以益生菌发酵，充分利用菌体代谢过程对大分子化合物的降解作用，发酵制备的活性提取液具有美白保湿、抗氧化损伤、调节皮肤微生态等功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法和应用，属于化妆品技术领域。
背景技术
菟丝子为旋花科植物，寄生在其他植物之上，其干燥的成熟种子常被用于中药复配。菟丝子作为一味中药，所含化学物质种类繁多，主要包括黄酮、多糖、甾醇类、香豆素、蛋白质、氨基酸、脂肪酸等天然护肤因子，具有较强的抗氧化、抗衰老的功效。
基于天然化妆品原料在市场中的需求日益上升，目前用于提取菟丝子中活性成分的方法为水提法或有机溶剂提取法，极少有涉及利用发酵的方法制备菟丝子活性提取物的研究与报道。采用水提法或有机溶剂提取法提取菟丝子活性物质时，原料长时间处于70℃以上的较高温状态，破坏菟丝子主活性成分，同时存在着耗能高、提取率低、废水排放量大、提取液气味不佳、颜色稳定性差等一系列问题。现有技术急需一种耗能低、提取率高、无污染，稳定并且不破坏菟丝子生物活性成分的方法来满足现有技术的不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：目前提取菟丝子活性物质的方法存在耗能高、提取率低、废水排放量大且提取液活性成分含量低、气味不佳、颜色稳定性差等问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将布氏乳杆菌接入种子培养基中进行活化培养，得到种子培养液；
步骤2：将菟丝子粉配制成发酵培养基；
步骤3：在发酵培养基中接入种子培养液，进行发酵培养，得到发酵混合液；
步骤4：将发酵混合液经过滤除渣除菌后，收集滤液，在所述滤液中加入多元醇并调节pH值，即得菟丝子发酵活性提取液。
优选地，所述步骤1中的布氏乳杆菌为布氏乳杆菌MF060，其保藏编号为：CGMCCNo.19125，分类命名为：布氏乳杆菌MF060，拉丁文名称为：Lactobacillus buchneri，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2019年12月12日。
优选地，所述步骤1中种子培养基的配方为：葡萄糖0.4wt％，酪蛋白0.4wt％，磷酸氢二钾0.04wt％，磷酸二氢钾0.04wt％，硫酸镁0.01wt％，硫酸锰0.005wt％，以及余量的水，pH值为6.2±0.2；所述种子培养基在使用前进行灭菌处理。
优选地，所述步骤1中活化培养的方式为静置培养，温度为37℃，时间为12～24h。
优选地，所述步骤2中配制的发酵培养基的成分包括：菟丝子粉0.1-2.0wt％，葡萄糖0.1-2.0wt％，酪蛋白0.001-0.04wt％，维生素C 0.001-0.01wt％，以及余量的水；所述菟丝子粉的粒径为60～100目；所述发酵培养基在使用前进行灭菌处理。
优选地，所述步骤3中种子培养液的接入量为发酵培养基质量的0.5～3％；所述种子培养液中的布氏乳杆菌菌种的浓度为1×109cfu/mL；
优选地，所述步骤3中发酵培养的温度为30～40℃，时间为12～72h。
优选地，所述步骤4中的过滤为：依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤；所述多元醇的加入量为滤液质量的5.1～5.6％；所述的多元醇为丁二醇、丙三醇、丙二醇、己二醇和戊二醇中的一种。
本发明还提供了上述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法制备所得的菟丝子发酵活性提取液在化妆品中的应用。
优选地，所述应用中，菟丝子发酵活性提取液在化妆品中添加的质量百分比为10～20％。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明的制备方法采用天然植物原料辅助益生菌发酵，充分利用菌体代谢，对大分子化合物进行降解并增加其他活性物质的溶出，总糖、氨基酸、黄酮组分较水提取法提取得到的相应活性组分分别高出约1.5倍、1.7倍、1.6倍，发酵法获得的活性提取液中菟丝子多糖分子量相比水提法明显降低，菟丝子多糖分子量由23万左右变到2万左右。
2.本发明采用过滤方法除菌，较采用高温除菌工艺具有保留菟丝子中的活性成分，更贴近皮肤微生态的优点；
3.本发明的制备方法基本可实现无废弃物排放的绿色生产，制备过程所涉及的发酵滤液及滤渣均能作为化妆品原料得到应用；
4.本发明所制备的菟丝子发酵活性提取液，具有保湿、抗氧化、美白、修复的功效，同时，由于常温发酵与过滤工艺的应用，最大程度上保留了菟丝子天然的香甜与草本香气，更有益于促进皮肤微生态的平衡，贴近天然绿色的护肤理念，可广泛用于保湿水、护肤霜、精华液中，起到长效保湿、抗炎抗敏、修复基底、平衡表皮菌群微生态的天然护肤效果。
保藏说明
布氏乳杆菌MF060的保藏编号为：CGMCC No.19125，分类命名为：布氏乳杆菌，拉丁文名称为：Lactobacillus buchneri，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2019年12月12日。
附图说明
图1为实施例1中所得菟丝子多糖凝胶色谱测菟丝子多糖分子量图谱；
图2为实施例2中所得菟丝子多糖凝胶色谱测菟丝子多糖分子量图谱；
图3为实施例3中所得菟丝子多糖凝胶色谱测菟丝子多糖分子量图谱；
图4为对比例1中所得菟丝子多糖凝胶色谱测菟丝子多糖分子量图谱。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
下列各实施例中采用的布氏乳杆菌为布氏乳杆菌MF060，于2019年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.19125，分类名：布氏乳杆菌，拉丁名：Lactobacillus buchneri。
实施例1
一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
1)种子培养基的制备
按照质量分数，分别称取葡萄糖0.4％，酪蛋白0.4％，磷酸氢二钾0.04％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.005％，其余用水补足，将pH值调节至6.2±0.2，高压蒸汽灭菌15min后，冷却至室温。
2)布氏乳杆菌种子液的制备
向1)得到的培养基中接入保藏菌种布氏乳杆菌CGMCC No.19125在37℃下活化培养24h，制得活化后的种子培养液。
3)发酵培养基的制备
将菟丝子粉碎过100目筛，获得菟丝子粉。本发酵体系包含0.1wt％菟丝子粉、2wt％葡萄糖、0.04wt％酪蛋白、0.01wt％维生素C，其余用水补足，充分摇匀后于121℃、15min灭菌。
4)发酵
将布氏乳杆菌种子培养基活化后稀释定量为1×109cfu/mL的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的0.5wt％的种子菌液，30℃发酵72h。
5)提取
将步骤4)获得的发酵物依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤除渣除菌获得发酵滤液和滤渣，在滤液中加入滤液质量5.1％的丙三醇，并调节pH值至5.0-6.0，即得菟丝子发酵活性提取液。滤渣可采用超声波剪切破碎菌体、均质后制成泥膜。
实施例2
一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
1)种子培养基的制备
方法如实施例1。
2)布氏乳杆菌种子液的制备
向1)得到的培养基中接入保藏菌种布氏乳杆菌CGMCC No.19125在37℃下活化培养24h，制得活化后的种子培养液。
3)发酵培养基的制备
将菟丝子粉碎过80目筛，获得菟丝子粉。本发酵体系包含1wt％菟丝子粉、1wt％葡萄糖、0.002wt％酪蛋白、0.005wt％维生素C，其余用水补足，充分摇匀后于121℃、15min灭菌。
4)发酵
将布氏乳杆菌种子培养基活化后稀释定量为1×109cfu/mL的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的1.5wt％的种子菌液，37℃发酵24h。
5)提取
将步骤4)获得的发酵物依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤除渣除菌获得发酵滤液和滤渣，在滤液中加入滤液质量5.3％的丁二醇，并调节pH值至5.0-6.0，即得菟丝子发酵活性提取液。滤渣可采用超声波剪切破碎菌体、均质后制成泥膜。
实施例3
一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
1)种子培养基的制备
方法如实施例1。
2)布氏乳杆菌种子液的制备
向1)得到的培养基中接入保藏菌种布氏乳杆菌CGMCC No.19125在37℃下活化培养24h，制得活化后的种子培养液。
3)发酵培养基的制备
将菟丝子粉碎过60目筛，获得菟丝子粉。本发酵体系包含2wt％菟丝子粉、0.1wt％葡萄糖、0.001wt％酪蛋白、0.001wt％维生素C，其余用水补足，充分摇匀后于121℃、15min灭菌。
4)发酵
将布氏乳杆菌种子培养基活化后稀释定量为1×109cfu/mL的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的3wt％的种子菌液，40℃发酵12h。
5)提取
将步骤4)获得的发酵物依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤除渣除菌获得发酵滤液和滤渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的丙二醇，并调节pH值至5.0-6.0，即得菟丝子发酵活性提取液。滤渣可采用超声波剪切破碎菌体、均质后制成泥膜。
对比例1
水提法制备菟丝子提取液：
将菟丝子粉碎后过100目筛，获得100目的菟丝子粉末。称取水提体系质量的0.1wt％菟丝子粉末，其余用水补足，100℃回流3h。提取结束后，上清液用孔径为0.22μm滤膜除去植物残渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的己二醇，并调节pH值至5.0-6.0，制成菟丝子提取液。
对比例2
水提法制备菟丝子提取液：
将菟丝子粉碎后过80目筛，获得80目的菟丝子粉末。称取水提体系质量的1wt％菟丝子粉末，其余用水补足，100℃回流3h。提取结束后，上清液采用孔径为0.22μm滤膜除去植物残渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的丙三醇，并调节pH值至5.0-6.0，制成菟丝子提取液。
对比例3
水提法制备菟丝子提取液：
将菟丝子粉碎后过60目筛，获得60目的菟丝子粉末。称取水提体系质量的2wt％菟丝子粉末，其余用水补足，100℃回流3h。提取结束后，上清液采用孔径为0.22μm滤膜除去植物残渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的丙二醇，并调节pH值至5.0-6.0，制成菟丝子提取液。
将实施例1-3制备的菟丝子发酵提取液和对比例1-3制备的菟丝子水提液分别进行多糖含量、多糖分子量大小、黄酮含量、氨基酸含量和蛋白质含量的测定。
检测方法如下：
1、多糖含量的测定：
参考标准：SN/T 2409-1998。
2、多糖分子量大小的测定：
采用凝胶渗透色谱进行菟丝子多糖分子量大小的测定。采用乙酸-乙酸钠为流动相，流速0.8mL/min，温度25℃。分别采用分子量为400kDa、200kDa、100kDa、80kDa、40kDa及10kDa的葡聚糖进行标准曲线的制作，并测定实施例1-3的菟丝子发酵提取液与对比例1的菟丝子水提液中菟丝子多糖分子量的大小。测得多糖分子量标准曲线为：Y＝10(0.8t+9.762)。其中Y为相应多糖样品分子量大小，t为相应多糖出峰时间。
3、黄酮含量的测定：
1)标准溶液配制
精密称取芦丁对照品0.06g，加60％甲醇适量，置于超声锅中超声溶解，静置至室温，以60％甲醇定容于100mL容量瓶中，摇匀备用，配成芦丁含量为0.06wt％的标准溶液，备用。
2)标准曲线的制作
加2.5mL不同稀释倍数的标准液，加400μL 5wt％NaNO2，静置5min，加400μL10wt％Al(NO3)3，静置6min，加600μL 10wt％NaOH，静置6min，30％乙醇定容至10mL，静置10min，510nm处测吸光度。
3)待测样的检测
将2)中标准液改成待测液即可。
4、氨基酸含量的测定：
参考标准：QB/T 2409-1998。
5、蛋白质含量的测定：
参考标准：GB/T 6432-2018。
对实施例1-3与对比例1-3进行上述测试，其具体数据如表1所示。
表1实施例1-3与对比例1-3的测试结果
实施例1-3与对比例1凝胶色谱图如图1～4所示。
实施例4
一种保湿修复抗氧化护肤水，成分包括以质量分数计的水80％、菟丝子发酵提取液10％、甘油5％、丙二醇2％、戊二醇2％、水溶性维生素E 0.5％、透明质酸钠0.1％、乙基己基甘油0.1％和柠檬酸钠0.3％。
上述的保湿修复抗氧化护肤水的制备方法为：
将水、甘油、丙二醇、戊二醇、水溶性维生素E、透明质酸钠、乙基己基甘油、柠檬酸钠加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入菟丝子发酵提取液搅拌均匀，获得保湿修复抗氧化护肤水。
实施例5
一种保湿美白抗氧化护肤水，成分包括以质量分数计的水70％、菟丝子发酵提取液20％、甘油5％、丙二醇2％、戊二醇2％、白藜芦醇0.5％、透明质酸钠0.1％、乙基己基甘油0.1％和柠檬酸钠0.3％。
上述的保湿美白抗氧化护肤水制备方法为：
将水、甘油、丙二醇、戊二醇、白藜芦醇、透明质酸钠、乙基己基甘油、柠檬酸钠加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入菟丝子发酵提取液搅拌均匀，获得保湿美白抗氧化护肤水。
对比例4
一种植物保湿护肤水，成分包括以质量分数计的水70％、菟丝子发酵提取液20％、甘油5％、丙二醇2％、戊二醇2％、白藜芦醇0.5％、水溶性纤维素E 0.5％、透明质酸钠0.1％、乙基己基甘油0.1％和柠檬酸钠0.3％。
上述的植物保湿护肤水的制备方法为：
将水、甘油、丙二醇、戊二醇、白藜芦醇、水溶性微生物E、透明质酸钠、乙基己基甘油、柠檬酸钠加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入菟丝子发酵提取液搅拌均匀，获得植物保湿护肤水。
将实施例4-5和对比例4制备的护肤水进行如下测试：
1、脂肪氧化酶检测：
试剂配制：
LOX酶：1体积5-LOX酶加50体积蒸馏水。
底物：将吐温20以0.5mL/L浓度分散于0.2mol/L硼酸缓冲液中，再以0.54mL/L浓度加入亚油酸(亚油酸纯度＞99％)，混匀后用1mol/L氢氧化钠调节缓冲液pH为9.0。
采用以下公式计算脂氧合酶抑制率：
2、酪氨酸酶抑制率检测：
试剂配制：
1)pH6.8 PBS溶液的配制：
取0.2moL/L Na2HPO4·12H2O 154.5mL加入0.1moL/L一水柠檬酸45.5mL，配制成200mL pH为6.8的PBS溶液；
2)酪氨酸酶溶液：用pH6.8 PBS配制浓度为100U/mL的酪氨酸酶溶液，现配现用。
3)左旋多巴溶液：用pH6.8 PBS配制浓度为1mg/mL的左旋多巴溶液，避光保存。
依次加入样品溶液、PBS溶液与酪氨酸酶溶液后于37℃水域中孵育10min；添加左旋多巴溶液，反应5min后快速于475nm波长下测定吸光值，采用以下公式计算酪氨酸酶抑制率：
3、HaCat细胞毒试验：
步骤1：将HaCaT细胞以105cell/mL的浓度接种于96孔板中，每孔加入100μL(104cell/孔)细胞悬液。
步骤2：将96孔板放在培养箱中孵育24小时(37℃，5％CO2)使细胞贴壁生长。加入10μL不同浓度(0.025、0.05、0.1、0.15、0.2mg/mL)的混合样品溶液，对照组加入10μL空白细胞培养液，每个组做3-6个重复，结果取平均值。
步骤3：继续将96孔板放在培养箱(37℃，5％CO2)中孵育48小时后取出。向每孔加入10μL CCK-8溶液。
步骤4：再将96孔板放在培养箱(37℃，5％CO2)中孵育2小时后取出。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
根据下列公式计算细胞活性：
上述测试结果如表2所示：
表2实施例4-5和对比例4制备的护肤水的测试结果
| 样品 | 脂肪氧化酶抑制率(％) | 酪氨酸酶抑制率(％) | 细胞活性(％) |
| 实施例4 | 18.24 | 57.48 | 98.4 |
| 实施例5 | 19.36 | 67.39 | 97.8 |
| 对比例4 | 9.46 | 34.25 | 95.3 |
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将布氏乳杆菌接入种子培养基中进行活化培养，得到种子培养液；
步骤2：将菟丝子粉配制成发酵培养基；
步骤3：在发酵培养基中接入种子培养液，进行发酵培养，得到发酵混合液；
步骤4：将发酵混合液经过滤除渣除菌后，收集滤液，在所述滤液中加入多元醇并调节pH值，即得菟丝子发酵活性提取液。
2.如权利要求1所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的布氏乳杆菌为布氏乳杆菌MF060，其保藏编号为：CGMCC No.19125，分类命名为：布氏乳杆菌MF060，拉丁文名称为：Lactobacillus buchneri，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2019年12月12日。
3.如权利要求1所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤1中种子培养基的配方为：葡萄糖0.4wt％，酪蛋白0.4wt％，磷酸氢二钾0.04wt％，磷酸二氢钾0.04wt％，硫酸镁0.01wt％，硫酸锰0.005wt％，以及余量的水，pH值为6.2±0.2；所述种子培养基在使用前进行灭菌处理。
4.如权利要求1所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤1中活化培养的方式为静置培养，温度为37℃，时间为12～24h。
5.如权利要求1所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤2中配制的发酵培养基的成分包括：菟丝子粉0.1-2.0wt％，葡萄糖0.1-2.0wt％，酪蛋白0.001-0.04wt％，维生素C 0.001-0.01wt％，以及余量的水；所述菟丝子粉的粒径为60～100目；所述发酵培养基在使用前进行灭菌处理。
6.如权利要求1所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤3中种子培养液的接入量为发酵培养基质量的0.5～3％；所述种子培养液中的布氏乳杆菌菌种的浓度为1×109cfu/mL。
7.如权利要求1所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤3中发酵培养的温度为30～40℃，时间为12～72h。
8.如权利要求1所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的过滤为：依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤；所述多元醇的加入量为滤液质量的5.1～5.6％；所述的多元醇为丁二醇、丙三醇、丙二醇、己二醇和戊二醇中的至少一种。
9.权利要求1～8中任意一项所述的菟丝子发酵活性提取液的制备方法制备所得的菟丝子发酵活性提取液在化妆品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用中，菟丝子发酵活性提取液在化妆品中添加的质量百分比为10～20％。
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