CN114763565B - 一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物 - Google Patents

一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物 Download PDF

Info

Publication number
CN114763565B
CN114763565B CN202210499903.3A CN202210499903A CN114763565B CN 114763565 B CN114763565 B CN 114763565B CN 202210499903 A CN202210499903 A CN 202210499903A CN 114763565 B CN114763565 B CN 114763565B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
asiatic acid
water solubility
extraction
improving
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210499903.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114763565A (zh
Inventor
鲁阳辉
颜贵卉
张明洲
吴雪昌
王旻子
姚雨辰
魏建良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Youmada Biological Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Youmada Biological Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Youmada Biological Co ltd filed Critical Hangzhou Youmada Biological Co ltd
Priority to CN202210499903.3A priority Critical patent/CN114763565B/zh
Publication of CN114763565A publication Critical patent/CN114763565A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114763565B publication Critical patent/CN114763565B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/005—Preparations for sensitive skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine

Abstract

本申请涉及微生物发酵提取技术领域，具体公开了一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该转化方法制得的发酵混合产物，包括以下步骤：S1:将积雪草液进行预处理，得到处理后的积雪草液；S2:制备嗜热栖热菌的种子液；S3:将透明质酸和步骤S1中的处理后的积雪草加入到发酵培养基中，接着将步骤S2中的嗜热栖热菌的种子液接种到发酵培养基中，然后在设定的温度下进行发酵提取，得到初级发酵产物；S4:将步骤S3中的初级发酵产物进一步进行后处理除杂，得到混合发酵产物。本申请采用积雪草和透明质酸共同作为发酵底物，通过嗜热栖热菌的发酵作用，促进了积雪草酸的溶出，同时改善了积雪草酸的水溶性，提高了积雪草酸的生物利用率。

Description

一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发 酵混合产物
技术领域
本申请涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该转化方法制得的发酵混合产物。
背景技术
积雪草，属于伞形科积雪草属植物，它作为传统药物，在治疗皮肤炎症和促进创面愈合方面已有千年历史。在积雪草提取物中，主要组分包括有积雪草苷(Asiaticoside)、羟基积雪草苷(Madecassoside)、积雪草酸(Asiatic acid)和羟基积雪草酸(Madecassicacid)等五环三萜烯类有机物，其结构式如图1所示，这类五环三萜烯有机物具有修护、抗炎等优异功效。在这些物质中，积雪草苷、羟基积雪草苷和羟基积雪草酸因携带大量羟基(-OH)等亲水基团，使得其水溶解性较为突出，在化妆品领域和医药领域中应用范围较广；但是，积雪草酸(Asiatic acid)亲水基团较少，水溶性不佳，因而其很难到达生物膜的表面，所以皮肤对积雪草酸的吸收性差，从而导致使用效果不佳，生物利用度低，使得积雪草酸在化妆品领域和医药领域应用中，受到了限制。
为了改善积雪草酸的水溶性，往往需要对其进行改性。在积雪草酸的C28羧基位上(如图2所示)具有一个活性较大的羧基，其可与有机碱(如钠、钾等)、环糊精、氨基酸、稀土金属(如铈、铋等)形成配合物；因而该处是最常见的改性位点。在公开号为CN101337984A的专利中，就是利用积雪草酸的C28的活性位点，制备了一系列的积雪草酸的氨基酸类衍生物，从而提高积雪草酸对肌糖原磷酸化酶的抑制活性。在提高积雪草酸亲水性的问题上，目前的研究已有公开号为CN103059166 A的专利，其是利用积雪草酸与环糊精进行共混改性，使积雪草酸的晶形发生改变，从而使其水溶性增大；根据环糊精对有机活性分子的改性方法上来看，主要是因为积雪草酸的脂溶性基团插入了环糊精的空腔结构中，使得其晶型结构发生改变，并与环糊精形成包合物，而环糊精的亲水性是比较强的，因而积雪草酸的水溶性得到了很大的改善。但是目前针对改善积雪草酸的水溶性的方法相对较少，因而进一步拓展新的改性方法是很有必要的。
目前，提取植物提取物常用的方法，有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超声波提取法、超临界萃取法和酶解法等技术。其中，溶剂法，包括浸渍法、回流提取法等，但存在提取效率低、资源浪费等缺点；水蒸气蒸馏法，适用于挥发性，且难溶或不溶于水的成分的提取，但也有提取不完全、产率低的弊端；超声提取法，可以利用超声波空化作用，加速植物有效成分的浸出。不过它对于容器要求较高、噪声大，且存在设备放大等问题；酶解法，可以降解细胞壁，利于植物内容物溶出，提取率高，但温度过高时易导致酶失活；超临界萃取法，是以超临界流体代替常规有机溶剂进行萃取和分离，常用于挥发性成分、脂溶性物质及高热敏性物质；但存在高压设备，运行成本高等缺点。微生物发酵提取是近年来一种的新兴的提取工艺，具有提取效率高，提取的产物纯度高的优势，但是针对不同的待提取物质需要筛选不同的微生物。关于积雪草的活性物质微生物发酵提取也是已有研究的，在公开号为CN113025680A的专利中，采用了多菌组合物提取积雪草中的羟基积雪草苷的，其结果显示其提取效率得到明显的提高。但是由于积雪草酸的水溶性较低，采用上述发酵提取方法，其效果并不理想，因而开发一种针对积雪草酸的发酵提取工艺也是十分紧迫的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本申请提供了一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物，该方法中将积雪草和透明质酸共同作为发酵底物，采用嗜热栖热菌对发酵底物进行高温发酵提取，使积雪草中的积雪草酸与透明质酸发生反应，不仅可以提高积雪草酸的水溶性，而且可以提高积雪草酸的提取率。
第一个方面，本申请提供了一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法，包括以下步骤：
S1:将积雪草叶进行预处理，得到处理后的积雪草叶；
S2:制备嗜热栖热菌的种子液；
S3:将透明质酸和步骤S1中的处理后的积雪草加入到发酵培养基中，接着将步骤S2中的嗜热栖热菌的种子液接种到发酵培养基中，然后在设定的温度下进行发酵提取，得到初级发酵产物；
S4:将步骤S3中的初级发酵产物进一步进行后处理除杂，得到混合发酵产物。
积雪草酸作为积雪草的主要组分之一，具有可对抗UVA照射引起的ROS的增多、脂质过氧化，并可明显地抑制UVA引起的MMP-2和p53的表达，从而减少胶原蛋自的分解、角化细胞的凋亡，保护皮肤对抗紫外线的损伤，而且还可以显著促进成纤维细胞中I型胶原蛋白的合成，比较对鼠伤口愈合作用时，发现积雪草酸是最有效的促进伤口愈合的成分之一；但是由于积雪草酸的水溶性差的原因，其生物利用度低且微生物发酵提取效率低。
通过采用上述的技术方案，利用透明质酸和积雪草进行共同发酵，透明质酸的N-乙酰葡糖胺结构中，远离中心C原子的羟基，分子作用力较弱，结合不稳定易断开；而积雪草酸C28羧基位上，化学能大，较为活泼；在嗜热栖热菌的发酵作用下，积雪草酸和透明质酸的部分化学官能团趋于活泼，使得积雪草酸C28位羧基与透明质酸钠中的羟基基团，发生生物修饰作用，由于透明质酸的强亲水性，很大程度改善积雪草酸理化性质，增强其水溶性；更进一步而言，因为积雪草酸与透明质酸的修饰作用，可以促进积雪草酸的溶出，因而提高积雪草酸的提取率。
步骤S1中，预处理为粉碎和过筛处理，筛孔的尺寸为10-100目。
通过采用上述的技术方案，将积雪草进行粉碎处理，增大积雪草与发酵液和发酵均的接触，更有利于提取积雪草的活性物质。
步骤S2中，嗜热栖热菌的购买的菌种保存号为CICC 10647的菌种。
通过采用上述技术方案，利用嗜热栖热菌作为发酵提取的微生物，可以提高积雪草酸的有效成分提取效率，而且其代谢过程中会产生一些活性物质，可以使积雪草酸和透明质酸中一些不稳定基团的化学键发生活化，从而促使两者发生作用，增大积雪草酸的水溶性，提高积雪草酸的提取率。更进一步而言，嗜热栖热菌在发酵过程中，会产生热稳定性的超氧化物歧化酶(SOD)和B族维生素；超氧化物歧化酶可以将O2 －氧化成H2O2，避免生物体被氧化损伤，起到皮肤抵抗自由基侵害，延缓衰老的功效。B族维生素可以减轻皮肤炎症反应，抵抗日光的损害，促进细胞再生，B族维生素还是很多酶和辅助酶分子结构的一部分，可促进氨基酸的代谢以保持皮肤健康；这些物质的存在可以进一步提高混合发酵产物的生物活性，提高其使用效果。
步骤S2中，制备嗜热栖热菌的种子液的具体步骤为：将嗜热栖热菌接种于种子培养基中摇床培养，得到嗜热栖热菌的种子液；其中：种子培养基的组成为：酵母粉2-10g/L，聚蛋白胨2-20g/L，NaCl 1-5g/L，pH 7.0-7.2；摇床的转速为100-150rpm，摇床培养温度为45-85℃，摇床培养时间为12-30h。
采用上述的技术方案，可以制备出活性较高的嗜热栖热菌的种子液。
步骤S3中，预处理后的积雪草叶在发酵培养基中的浓度为500-800g/L，透明质酸在发酵培养基中的浓度为1-10g/L；嗜热栖热菌的种子液与发酵培养基的接种体积比1-10％。
采用上述技术方案，可以更好的控制发酵过程。在发酵过程中，积雪草叶在培养基中的浓度不宜过高，浓度超过800g/L，积雪草叶含量过高，会影响嗜热栖热菌的活性不利于发酵，而低于500g/L，发酵效率过低。透明质酸浓度过低，低于1g/L不利于积雪草酸浸出，对积雪草酸的改性也有限；而浓度过高，高于10g/L，会使发酵培养基的粘度增大，不利于后续的后处理分离。
步骤S3中，发酵培养基的组成为：酵母粉5-15g/L，聚蛋白胨5-25g/L，FeCl3 0.05-0.2g/L，CaSO4·2H2O 0.1-0.5g/L，MgSO4·2H2O 0.1-0.5g/L，KNO3 0.1-0.5g/L，MnSO4 1-3g/L，ZnSO4·7H2O 0.3-1g/L，pH 7.0-7.2；设定温度为45-85℃，发酵提取转速200-250rpm，发酵提取时间为10-30h。
采用上述技术方案，可以保证嗜热栖热菌保持在较高的活性。发酵培养基相较于种子液培养基，加入了多种无机盐，可以进一步保证菌种所需的营养物质，促进菌种的活性；采用上述的设定温度，是可嗜热栖热菌生长需要的最适宜的温度，因而可以提高其发酵活性，从而提高发酵提取效果；而且在上述设定温度下，也有利于提高积雪草酸和透明质酸的化学键的活性，从而提高积雪草酸的提取效果。
步骤S4中，后处理除杂具体为：首先采用离心去除菌体和积雪草残渣，接着采用活性炭进行脱色，再接着进行过滤，即得混合发酵产物；其中：离心的转速为2000-20000rpm；活性炭的添加量为离心后的产物重量的0.1-1％。
采用上述的技术方案，可以有效去除产物中的杂质，提高产品的质量。
第二个方面，本申请根据上述的生物转化方法获得混合发酵产物。
本申请中获得的混合发酵产物中包含有水溶性的积雪草酸、透明质酸、嗜热栖热菌代谢产物以及其它种类积雪草的提取物。水溶性的积雪草酸具有更好的透过生物膜的能力，使得积雪草酸的生物利用度得到提升。透明质酸是由单位“D-葡萄糖醛酸”及“N-乙酰葡糖胺”组成的高级多糖(如图3所示)；D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。它可吸收其本身重量1000倍水分，补水的同时，阻止水分经表皮流失，还可起到一定的屏障修复功效；在提高积雪草酸的水溶性和提取效果之外，还可以增加混合发酵产物的功效。嗜热栖热菌代谢产物中含有对皮肤有益的活性成分，因而处理发酵提取作用外，还可增加混合发酵产物的活性组分。其它种类积雪草的提取物可以刺激成纤维细胞增殖并激活SMAD信号传导途径，因此可增加I型胶原蛋白的产生以及减少妊娠纹和炎症反应的形成；提取物中的萜类化合物可显著提高胶原蛋白和细胞层纤连蛋白(纤连蛋白广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及皮肤组织修复等过程)的含量，而且能够刺激促成瘢痕成熟的I型胶原的生产，减少炎症反应的产生。
第三个方面，本申请中的混合发酵产物在制备化妆品和皮肤类药剂中的应用。
综上所述，本申请具有如下有益效果：
1.本申请采用积雪草和透明质酸共同作为发酵底物，通过嗜热栖热菌的发酵作用，促进了积雪草酸的溶出，同时改善了积雪草酸的水溶性，提高了积雪草酸的生物利用。
2.本申请中采用热栖热菌作为发酵提取的微生物，嗜热栖热菌具有独特的“生物加工”作用，一方面可将积雪草定向转化生成高效活性物质，另一方面，可降解有害物质，达到变相除杂的目的，副作用更小，最大限度提高有效成分含量；而且其代谢产物中也含有有益于皮肤修复的组分，可以提高混合发酵物的活性。更重要的是，积雪草提取物中的多糖、氨基酸、维生素等物质，被嗜热菌利用后，可进入自身分解代谢途径，供应细胞合成所需的碳源和能源，促进菌体生长，达到双向促进的作用。
3)本申请中的混合发酵产物含有多种有益于皮肤的活性物质(尤其是水溶性的积雪草酸)，其能够抑制角质形成细胞(Hacat)分泌炎症因子，从而改善肌肤状态；同时，混合发酵产物还能显著提高角质层水合能力，改善经皮失水率，使皮肤屏障得到修护，解决皮肤敏感脆弱等问题。
4)本申请中的工艺流程简单高效，提取效率高，更易实现工业化的生产。
附图说明
图1为背景技术中五环三萜烯类有机物结构式。
图2为积雪草酸的结构式。
图3为透明质酸的结构式。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请实施例和对比例中的积雪草来自于安徽省亳州市鹿娇娇中药材有限公司。
采用的嗜热栖热菌购买的菌种保存号为CICC 10647的菌种。
对比例4采用的酿酒酵母购买的菌种保存号为CICC 1042的菌种。
实施例
实施例1
1.积雪草叶的预处理：将积雪草叶进行粉碎，然后过50目筛，得到积雪草叶粉。
2.制备嗜热栖热菌的种子液：按照酵母粉6g/L，聚蛋白胨11g/L，NaCl 3g/L，向去离子水中加入上述组分，溶解后，调节pH为7.0～7.2，得到种子培养基。取嗜热栖热菌菌种加入到含有种子培养基的培养瓶中，然后将培养瓶置于摇床上，设置温度为60℃和摇床转速为100rpm，进行培养18h，得到嗜热栖热菌的种子液。
3.发酵提取：按照积雪草叶粉600g/L，透明质酸钠5g/L，酵母粉10g/L，聚蛋白胨15g/L，FeCl3 0.1g/L，CaSO4·2H2O 0.3g/L，MgSO4·2H2O 0.3g/L，KNO3 0.3g/L，MnSO4 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.6g/L，向去离子水中加入上述组分，混匀后，调节pH为7.0～7.2，得到发酵培养基；将发酵培养基加入到5L的发酵罐中，然后向发酵罐中加入相对于发酵培养基体积0.5％的嗜热栖热菌的种子液，调节发酵罐的温度为60℃，搅拌速度为200rpm，进行发酵提取20h，得到初级的发酵产物。
4.纯化：将初级发酵产物以10000rpm的转速进行离心，去除菌体和积雪草残渣，然后向离心后的发酵产物中加入相对于其质量0.5％的活性碳进行脱色，脱色完毕后，过滤，即得混合发酵产物。
实施例2
1)积雪草叶的预处理：将积雪草叶进行粉碎，然后过10目筛，得到积雪草叶粉。
2)制备嗜热栖热菌的种子液：按照酵母粉2g/L，聚蛋白胨20g/L，NaCl 1g/L，向去离子水中加入上述组分，溶解后，调节pH为7.0～7.2，得到种子培养基。取嗜热栖热菌菌种加入到含有种子培养基的培养瓶中，然后将培养瓶置于摇床上，设置温度45℃和摇床转速为150rpm，进行培养25h，得到嗜热栖热菌的种子液。
3)发酵提取：按照积雪草叶粉500g/L，透明质酸钠2g/L，酵母粉15g/L，聚蛋白胨8g/L，FeCl3 0.05g/L，CaSO4·2H2O 0.5g/L，MgSO4·2H2O 0.1g/L，KNO3 0.5g/L，MnSO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，向去离子水中加入上述组分，混匀后，调节pH为7.0～7.2，得到发酵培养基；将发酵培养基加入到5L的发酵罐中，然后向发酵罐中加入相对于发酵培养基体积0.1％的嗜热栖热菌的种子液，调节发酵罐的温度为45℃，搅拌速度为250rpm，进行发酵提取30h，得到初级的发酵产物。
4)纯化：将初级发酵产物以15000rpm的转速进行离心，去除菌体和积雪草残渣，然后向离心后的发酵产物中加入相对于其质量0.1％的活性碳进行脱色，脱色完毕后，过滤，即得混合发酵产物。
实施例3
1)积雪草叶的预处理：将积雪草叶进行粉碎，然后过100目筛，得到积雪草叶粉。
2)制备嗜热栖热菌的种子液：按照酵母粉10g/L，聚蛋白胨3g/L，NaCl 5g/L，向去离子水中加入上述组分，溶解后，调节pH为7.0～7.2，得到种子培养基。取嗜热栖热菌菌种加入到含有种子培养基的培养瓶中，然后将培养瓶置于摇床上，设置温度85℃和摇床转速为100rpm，进行培养10h，得到嗜热栖热菌的种子液。
3)发酵提取：按照积雪草叶粉800g/L，透明质酸钠10g/L，酵母粉5g/L，聚蛋白胨25g/L，FeCl3 0.2g/L，CaSO4·2H2O 0.1g/L，MgSO4·2H2O 0.5g/L，KNO3 0.1g/L，MnSO4 3g/L，ZnSO4·7H2O 0.3g/L，向去离子水中加入上述组分，混匀后，调节pH为7.0～7.2，得到发酵培养基；将发酵培养基加入到5L的发酵罐中，然后向发酵罐中加入相对于发酵培养基体积10％的嗜热栖热菌的种子液，调节发酵罐的温度为85℃，搅拌速度为200rpm，进行发酵提取25h，得到初级的发酵产物。
4)纯化：将初级发酵产物以20000rpm的转速进行离心，去除菌体和积雪草残渣，然后向离心后的发酵产物中加入相对于其质量1.0％的活性碳进行脱色，脱色完毕后，过滤，即得混合发酵产物。
对比例
对比例1
工艺参数和条件与实施例1是基本相同的，区别点在于，发酵提取步骤中没有加入透明质酸。
对比例2
工艺参数和条件与实施例1是基本相同的，区别点在于，发酵温度为常温发酵。
对比例3
直接将购买的积雪草酸置于去离子水中，然后5g/L的浓度向其中加入透明质酸，搅拌10h后过滤，去除未溶解的积雪草酸，得到的混合溶液。
对比例4
工艺参数和条件与实施例1是基本相同的，区别点在于，菌种采用酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，向对应的活化温度和发酵温度均设置为30℃。
实施例4，效果对比
1、积雪草酸的提取浓度测定
将实施例1～3中的混合发酵物与对比例1～3中的混合物进行积雪草酸含量采用HPLC进行测定，其结果如表1所示：
表1
积雪草酸的浓度(g/L)
实施例1 0.81
实施例2 0.65
实施例3 0.78
对比例1 0.49
对比例2 0.32
对比例3 0.68
对比例4 0.24
由表1分析可知：对比例3中未经处理的积雪草酸在水中的最大的溶解度为0.68g/L，而实施例1中积雪草酸可以达到0.81g/L，说明在发酵过程中积雪草酸与透明质酸发生了作用，从而增大了积雪草酸的水中的溶解度。在对比例1中未加入透明质酸进行发酵提取获得的积雪草酸的浓度为0.49g/L，相较于实施例1而言，其积雪草酸的浓度是明显降低的，说明加入透明质酸通过与积雪草酸的作用，增大了积雪草酸的溶解度，并促进积雪草酸的溶出。在对比例2中发酵温度的降低，降低了菌种的活性，因而未能很好的实现发酵提取，因而积雪草酸的浓度相较于实施例1而言，出现较大程度的降低。在对比例4中，换了发酵菌种，可以看出酿酒酵母对积雪草酸发酵提取的效果不佳，很难实现对积雪草酸的提取。从实施例1～3的效果上来看，调整了发酵的工艺，对积雪草酸的发酵提取时存在一定影响的，其中实施例1的提取效果是最佳的达到0.81g/L，这表明适当的调整工艺参数(例如调整积雪草叶粉的浓度，透明质酸的浓度等)是可以使提取效果达到最佳的。
2、经表皮水分流失率和角质层水分含量的测定
对实施例1～3和对比例1～4中的产物进行经表皮水分流失率、角质层水分含量进行测定，其测试方法为：
S1:选取测试者，共有8组，每组18人；在测试进行前，先采用经表皮水分流失测量仪Tewameter(Courage&Khazaka,德国)测试每位测试者的初始经表皮水分流失率，测试区域为脸颊上眼中线与鼻翼交界区域；然后采用皮肤角质层水分含量测量仪Corneometer(Courage&Khazaka,德国)测试每位测试者初始角质层水分含量，测量时，每位测试者需要测量两次。
其中：经表皮水分流失测量仪Tewameter的测试探头，使用特殊设计的两端开放的圆柱形腔体测量探头在皮肤表面形成相对稳定的测试小环境，通过两组温度、湿度传感器测定近表皮(约1cm内)由角质层水分散失形成的在不同两点的水蒸气压梯度，直接测出经表皮蒸发的水分量，以此来衡量皮肤表面水分流失情况。皮肤角质层水分含量测量仪Corneometer的测试探头是基于电容的原理进行测量；水的介电常数是81，其他物质的介电常数通常小于7，水是皮肤上介电常数最大的物质；当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量，测得值是一相对值。
S2:8组测试者中，除了1组不做任何处理，其余按照分组分别在脸颊上涂抹实施例1～3以及对比例1～4中的进行杀菌后的混合发酵提取液或者混合溶液，早晚各一次，涂抹28天后，按照S1步骤中的测试方法，测试实验后的经表皮水分流失率和角质层水分含量，其结果可见表2。
表2
从表2可以看出：空白组不做任何处理，其经表皮水分流失率和角质层水分含量的会有微弱的变化，但是变化很小。采用实施例1～3中的混合发酵产物进行涂覆，其初始经表皮水分流失率会有明显的降低，角质层水分含量会有明显的提升，说明本申请中的混合发酵产物对保持皮肤的水分上有很好的效果。
实施例1与对比例1相比，实施例1中的实验后的经表皮水分流失率的降低是明显高于对比例1中的，实验后的角质层水分含量的升高也是明显优于对比例1中，可能是以下两个方面导致的，第一点是，实施例1中添加了透明质酸，透明质酸的锁水能力是比较强的，因而实施例1中的性能得到提升；第二个点是，实施例1中加入了透明质酸，使得积雪草酸的含量明显增加，因而使得实施例1中护肤的性能得到了提升。
实施例1与对比例2相比，实施例1中的实验后的经表皮水分流失率的降低是明显高于对比例2中的，实验后的角质层水分含量的升高也是明显优于对比例2中，其原因可能是：对比例2中嗜热栖热菌的活性不高，向对应的发酵提取的活性物质含量是比较低的，因而其效果不佳。
实施例1与对比例3相比，实施例1中的实验后的经表皮水分流失率是稍微高于对比例3中的，实验后的角质层水分含量的升高也是稍优于对比例3中，主要是有以下2个方面的原因：第一点是：对比例3中混合溶液含有的物质主要是积雪草酸和透明质酸，但是在实施例1中还包括其他积雪草的提取物以及嗜热栖热菌的代谢产物，因而其活性物质含量更高；第二点是：实施例1中积雪草酸的含量时高于对比例3中的，而且积雪草酸是与透明质酸发生了作用的，水溶性更好，渗透性更高，因而其效果更好。
实施例1与对比例4相比，实施例1中的实验后的经表皮水分流失率的降低是明显高于对比例4中的，实验后的角质层水分含量的升高也是明显优于对比例4中，其主要原因是因为酿酒酵母对积雪草的发酵提取效果不佳，因而其活性物质是会明显低于实施例1，因而其效果会低于实施例1。
1.抗炎性效果测试
抗炎效果测试采用细胞炎症因子评价方法，其具体步骤为：
S1建立角质形成细胞(Hacat)炎症模型，利用脂多糖(LPS)进行诱导刺激：
S2在炎症模型下分别加入实施例1～3以及对比例1～4中的混合发酵产物或者混合溶液；
S3利用相关酶联免疫试剂盒(Elisa)，测定炎症因子IL-1α、IL-6的表达浓度，按照如下公式计算抑制率，得到的数据如表3所示。
表3
从表3的数据可知，实施例1～3中都对两种炎症因子都具有较高水平的抑制率，可以说明实施例1～3的混合发酵产物针对角质形成细胞(Hacat)所引起的炎症免疫反应，具有较好改善效果，从而解决皮肤敏感脆弱等常见问题。实施例1与对比例1和2以及4相比，炎症抑制率是有明显的提高的，其原因主要是实施例1中的活性物质提取条件，使得混合发酵产物中活性物质含量更高，因而其抑制效果更好。对比例3中是采用的积雪草酸直接溶解获得的物质，其积雪草酸含量高，而且加入了透明质酸，其炎症抑制率也是比较高的，但是相对于实施例1抑制效果还是更好。
由以上结果可知，本申请中透明质酸与积雪草叶粉通过采用嗜热栖热菌进行共同发酵提取，基于嗜热栖热菌具有独特的“生物加工”作用，一方面可将积雪草定向转化生成高效活性物质，另一方面，在透明质酸的存在下，还促进了积雪草酸的溶出，改善了积雪草酸的水溶性，提高了积雪草酸的生物利用，增强了高温混合发酵产物的修护和抗炎功效。
具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法，包括以下步骤：
S1:将积雪草叶进行预处理，得到处理后的积雪草叶；
S2:制备嗜热栖热菌的种子液；
S3:将透明质酸和步骤S1中的处理后的积雪草加入到发酵培养基中，接着将步骤S2中的嗜热栖热菌的种子液接种到发酵培养基中，然后在45-85℃的温度下进行发酵提取，得到初级发酵产物；
S4:将步骤S3中的初级发酵产物进一步进行后处理除杂，得到混合发酵产物；
所述步骤S2中，嗜热栖热菌是购买的菌种保存号为CICC 10647的菌种；
步骤S4中，后处理除杂具体为：首先采用离心去除菌体和积雪草残渣，接着采用活性炭进行脱色，再接着进行过滤，即得混合发酵产物。
2.根据权利要求1所述的提升积雪草酸水溶性的生物转化方法，其特征在于，所述步骤S1中，预处理为粉碎和过筛处理，筛孔的尺寸为10-100目。
3.根据权利要求1所述的提升积雪草酸水溶性的生物转化方法，其特征在于，所述步骤S2中，制备嗜热栖热菌的种子液的具体步骤为：将嗜热栖热菌接种于种子培养基中摇床培养，得到嗜热栖热菌的种子液；其中：种子培养基的组成为：酵母粉 2-10g/L，聚蛋白胨 2-20g/L，NaCl 1-5g/L，pH 7.0-7.2；摇床的转速为100-150rpm，摇床培养温度为45-85℃，摇床培养时间为12-30h。
4.根据权利要求1所述的提升积雪草酸水溶性的生物转化方法，其特征在于，所述步骤S3中，预处理后的积雪草叶在发酵培养基中的浓度为500-800g/L，透明质酸在发酵培养基中的浓度为1-10g/L；嗜热栖热菌的种子液与发酵培养基的接种体积比1%-10%。
5.根据权利要求4所述的提升积雪草酸水溶性的生物转化方法，其特征在于，步骤S3中，发酵培养基的组成为：酵母粉 5-15g/L，聚蛋白胨 5-25g/L，FeCl3 0.05-0.2g/L，CaSO4·2H2O 0.1-0.5g/L，MgSO4·2H2O 0.1-0.5g/L，KNO3 0.1-0.5g/L，MnSO4 1-3g/L，ZnSO4·7H2O 0.3-1g/L，pH 7.0-7.2；发酵提取转速200-250rpm，发酵提取时间为10-30h。
6.根据权利要求1所述的提升积雪草酸水溶性的生物转化方法，其特征在于，离心的转速为2000-20000rpm；活性炭的添加量为离心后的产物重量的0.1%-1%。
7.根据权利要求1~6中任意一项所述的生物转化方法获得的混合发酵产物。
8.根据权利要求7所述的混合发酵产物在制备改善皮肤经皮失水率及抗炎功效的化妆品和药物中的应用。
CN202210499903.3A 2022-05-09 2022-05-09 一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物 Active CN114763565B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210499903.3A CN114763565B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210499903.3A CN114763565B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114763565A CN114763565A (zh) 2022-07-19
CN114763565B true CN114763565B (zh) 2023-08-22

Family

ID=82364596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210499903.3A Active CN114763565B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114763565B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104357332A (zh) * 2014-10-17 2015-02-18 浙江工业大学 黑曲霉jh-2及在生物转化合成积雪草酸中应用
CN108553403A (zh) * 2018-04-20 2018-09-21 上海中翊日化有限公司 一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物的用途
CN113025680A (zh) * 2021-03-15 2021-06-25 杭州优玛达生物科技有限公司 一种羟基积雪草苷的发酵转化的方法与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2944435B1 (fr) * 2009-04-17 2011-05-27 Sederma Sa Composition cosmetique comprenant de l'oridonine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104357332A (zh) * 2014-10-17 2015-02-18 浙江工业大学 黑曲霉jh-2及在生物转化合成积雪草酸中应用
CN108553403A (zh) * 2018-04-20 2018-09-21 上海中翊日化有限公司 一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物的用途
CN113025680A (zh) * 2021-03-15 2021-06-25 杭州优玛达生物科技有限公司 一种羟基积雪草苷的发酵转化的方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Felipe Cava 等.Thermus thermophilus as biological model. Extremophiles.2009,第13卷213-231. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114763565A (zh) 2022-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114931530A (zh) 一种具有抗敏和修复作用的护肤组合物及其应用和化妆品及其方法
CN115678805B (zh) 一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法及其应用
CN113116755A (zh) 一种促渗透的护肤组合物及其制备方法和应用
CN115054530B (zh) 一种具有保湿抗衰老功效的护肤组合物及其制备方法
CN107929127B (zh) 一种太子参提取液的制备方法及其在抗皱化妆品中的应用
CN111840176A (zh) 一种具有抗糖基化、美白、祛斑、祛皱作用的美容组合物及其应用
CN113384506A (zh) 一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物和制备方法及其应用
CN110251433B (zh) 一种香水莲花提取物及其制备方法、包含其的香水莲花水以及莲花保湿舒敏水
CN114763565B (zh) 一种提升积雪草酸水溶性的生物转化方法及该方法制得的发酵混合产物
CN111494299B (zh) 一种神经酰胺复方安肌修护因子及其乳液
CN113350233A (zh) 一种抗衰组合物及其制备方法及用途
CN113755544A (zh) 一种裂褶菌发酵物及其制备方法和用途
CN113101256A (zh) 一种抗衰修复纳米乳及其应用
KR20120054298A (ko) 발효 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물
CN115927128B (zh) 一种透明颤菌发酵产物及其制备方法与应用
EP2878342A1 (en) Method for extraction of peat active substances and use of their combination in skin regenerating cosmetic formulations
CN115414290B (zh) 一种具有保湿、抗氧化、抗炎功效的中药组合物及其制备和应用
CN114796087B (zh) 一种海茴香干细胞提取物的制备方法及在化妆品中的应用
CN111714434B (zh) 一种神经酰胺复方安肌活肤因子以及膏霜
CN111603404B (zh) 一种含细胞提取液的护肤精华液及其制备方法
CN111419733B (zh) 一种神经酰胺多肽复方安肌蜜
CN114788806A (zh) 一种具有抗氧化美白一体功效的中药组合物发酵原浆及其制备方法和应用
KR20150109201A (ko) 황칠나무 수액 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
CN114209621A (zh) 一种保湿、抗氧化的红曲发酵物及其制备方法与应用
CN113274329A (zh) 植物美白提取物及其在美白化妆品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant