CN115778891A - 一种化妆品原料及其制备方法与应用、以及化妆品 - Google Patents

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CN115778891A CN202211680268.5A CN202211680268A CN115778891A CN 115778891 A CN115778891 A CN 115778891A CN 202211680268 A CN202211680268 A CN 202211680268A CN 115778891 A CN115778891 A CN 115778891A
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陈超
黄淳锡
魏珊
徐思明
许远远
白进轩
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Abstract

本申请提供一种化妆品原料及其制备方法与应用、以及化妆品，属于化妆品制造领域。化妆品原料包括含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料，该化妆品原料能够在一定程度上改善常规的积雪草提取物存在的有效成分稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，从而保证积雪草化妆品原料的综合效能。

Description

一种化妆品原料及其制备方法与应用、以及化妆品
技术领域
本申请涉及化妆品制造领域，具体而言，涉及一种化妆品原料及其制备方法与应用、以及化妆品。
背景技术
现有技术中，积雪草提取物由于具有细胞增殖效果，胶原蛋白和透明质酸的合成效果，预防和改善皮肤老化、改善皱纹、保护皮肤以及缓解特应性湿疹等效果，在化妆品领域被广泛应用。
但是，现有制备工艺制得的积雪草提取物存在有效成分的稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，导致积雪草提取物的综合效能下降，进而导致其在化妆品中的应用和推广受到限制。
发明内容
本申请的目的在于提供一种化妆品原料及其制备方法与应用、以及化妆品，能够在一定程度上改善常规的积雪草提取物存在的有效成分稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，从而保证积雪草化妆品原料的综合效能。
本申请的实施例是这样实现的：
第一方面，本申请实施例提供一种化妆品原料，化妆品原料包括含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料。
上述技术方案中，积雪草化妆品原料中包含有完整细胞结构的积雪草植物细胞，相较于常规的制备工艺提取到的积雪草提取物(基本不含有完整的细胞结构)，可以有效避免细胞壁和细胞膜破损后造成胞内有效成分的流失以及有效成分由于缺少保护导致的稳定性较低的问题。此外，本申请实施例提供的积雪草化妆品原料由于包含细胞壁，细胞壁中的部分功能成分(比如糖蛋白)也能发挥皮肤抗氧化、皮肤保湿、皮肤色素脱失抑制效果以及皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成等功效，相较于不含积雪草细胞的积雪草提取物，能够更为有效地提升其综合性能。因此，通过细胞膜和细胞壁对胞内有效成分的保护作用以及细胞壁中的部分功能组分的协同作用，相较于常规的基本不含积雪草细胞或细胞结构被破坏的积雪草提取物，能够在一定程度上改善常规的积雪草提取物存在的有效成分稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，同时，还能进一步提升积雪草化妆品原料的综合效能。
第二方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料的制备方法，包括以下步骤：
将积雪草的植物组织进行粉碎，以得到粉末状的植物组织；
将粉末状的植物组织加入到培养液中配置得到细胞培养基；
向细胞培养基中接种积雪草生长地土壤后依次经过至少三次富集培养并分离，以得到含有发酵辅酶的培养液；
将含有发酵辅酶的培养液依次进行发酵辅酶处理和灭活处理，以得到化妆品原料。
上述技术方案中，基于发酵处理的方式，将粉碎后的积雪草植物组织作为主要营养物质为积雪草生长地土壤中存在的积雪草植物组织降解微生物(比如果胶降解微生物)提供养料，再经过上述培养能够制备得到含有较多完整细胞结构的积雪草化妆品原料，相较于采用常规的积雪草提取物的制备工艺(比如有机溶剂萃取)，不仅能够有效避免提取溶剂残留在积雪草化妆品原料中对其综合效能造成影响，同时，还能制备得到一种含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料，其能够在一定程度上改善积雪草提取物存在的有效成分稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，同时，还能进一步提升积雪草化妆品原料的综合效能。
在一些可选的实施方案中，积雪草的植物组织包含积雪草的叶和/或茎。
上述技术方案中，积雪草植物细胞选自积雪草的叶和/或茎，相较于采用积雪草的其他组织，具有有效成分的含量更高的优势。
第三方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料在制备改善皮肤再生能力的化妆品中的应用。
第四方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料在制备改善皮肤弹性的化妆品中的应用。
第五方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料在制备改善皮肤皱纹的化妆品中的应用。
第六方面，本申请实施例提供一种化妆品，包括如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料。
上述技术方案中，化妆品中包含含有积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料，相较于不含积雪草植物细胞的积雪草提取物，能够使得化妆品具有更好的综合效能。
在一些可选的实施方案中，化妆品原料在化妆品中的质量占比为0.1～90％。
上述技术方案中，将化妆品原料的含量限定在特定范围内，一方面能够有效避免化妆品原料的用量过低，从而有效避免化妆品难以发挥预期的皮肤改善的效果；另一方面能够有效避免化妆品原料的用量过高，从而有效避免相应化妆品制剂难以成型，以制备得到质量合格的化妆品。
在一些可选的实施方案中，化妆品为润肤水、凝胶、面膜、泡沫、乳液、精华、防晒霜、隔离霜、粉底、BB霜、CC霜、遮瑕膏、睫毛膏、眼线笔、染唇液以及唇彩中的任一种。
本申请实施例提供的化妆品适用于上述多种体系，能够提供更多的可实施方案，从而便于对本申请实施例提供的化妆品进行推广和应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例提供的一种化妆品原料的制备方法的工艺流程图；
图2为本申请实施例提供的积雪草化妆品原料在显微镜下的观测图；
图3为本申请实施例提供的积雪草化妆品原料对EGF分泌促进能力的测试结果图；
图4为本申请实施例提供的积雪草化妆品原料对EGF mRNA表达水平的测试结果图；
图5为本申请实施例提供的积雪草化妆品原料对角质形成细胞分化标志物表达水平的测试结果图；
图6为本申请实施例提供的积雪草化妆品原料对成纤维细胞增殖促进效果的测试结果图；
图7为本申请实施例提供的积雪草化妆品原料对I型胶原C端肽(PICP)生成量的测试结果图；
图8为本申请实施例提供的积雪草化妆品原料改善皮肤皱纹的临床评估结果图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，本申请中的“和/或”，如“特征1和/或特征2”，均是指可以单独地为“特征1”、单独地为“特征2”、“特征1”加“特征2”，该三种情况。
另外，在本申请的描述中，除非另有说明，“一种或多种”中的“多种”的含义是指两种及两种以上；“数值a～数值b”的范围包括两端值“a”和“b”，“数值a～数值b+计量单位”中的“计量单位”代表“数值a”和“数值b”二者的“计量单位”。
现有技术中，植物提取物通常采用溶剂提取法进行制备，该提取方法通常存在以下问题：
(1)溶剂提取法(特别是有机溶剂提取法)得到的提取物中存在溶剂残留，导致制得的植物提取物的综合效能会受到一定程度的影响。
(2)植物细胞的细胞膜和细胞壁在提取过程中遭到破坏，使得细胞内的有效成分大量流失，并且，由于缺少了细胞膜和细胞壁的保护，使得植物提取物内的有效成分的稳定性下降。
由于常规的溶剂提取法存在上述问题，导致得到的植物提取物的综合效能欠佳，进而导致其在化妆品中的应用受到限制。
基于此，发明人研究发现，通过发酵处理方式能够直接制备得到含有完整细胞结构的植物细胞的植物化妆品原料，不仅能够在一定程度上改善常规的植物提取物存在的有效成分稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，同时，还能进一步提升植物化妆品原料的综合效能，本申请实施例以积雪草化妆品原料为例。
下面对本申请实施例的一种化妆品原料及其制备方法与应用、以及化妆品进行具体说明。
第一方面，本申请实施例提供一种化妆品原料，化妆品原料包括含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料。
需要说明的是，本申请提供的积雪草化妆品原料不是提取物，而是直接通过发酵方式获得的植物化妆品原料。
为了更好地理解技术方案，此处对积雪草化妆品原料中的部分有效成分及其部分作用机理进行说明：
积雪草化妆品原料的有效成分：积雪草化妆品原料中的主要成分包括积雪草苷和积雪草酸，同时，其还含有β-胡萝卜素、β-谷甾醇、菜油甾醇、樟脑、山柰酚、皂苷、豆甾醇、钙、铁、镁、锰、磷、钾、硒、锌、维生素B1、维生素B2、维生素B3以及维生素C等有效成分。其中，在药理作用方面：积雪草苷和积雪草酸具有加快皮肤外伤愈合速度的作用，故自古以来被广泛应用于治疗皮肤损伤等疾病，对于其他的有效成分，已知的主要药理作用包括对中枢神经系统的作用、对皮肤组织的作用以及抗菌作用等；在化妆品应用方面：已知其具有细胞增殖效果，胶原蛋白和透明质酸的合成效果，预防和改善皮肤老化、改善皱纹、保护皮肤以及缓解特应性湿疹等效果。
部分作用机理解释：表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)能够促进皮肤表皮细胞的分裂和增殖，并且能够调节真皮中构成真皮层的胶原蛋白、弹性蛋白以及透明质酸的再生速度；此外，EGF还可以通过血管内皮细胞的血管生成作用来生成毛细血管，将氧气和生长因子输送到周围组织，从而起到促进受损组织再生的作用。然而，随着年龄的增长，体内表皮生长因子的合成量降低，表皮的皮肤再生能力下降且皮肤老化现象加速，对此，积雪草化妆品原料能够促进EGF的生成，从而能够促进表皮角质细胞再生、真皮中胶原蛋白和弹性蛋白的合成等，进而表现出改善皮肤再生能力、改善皮肤弹性和以及改善皮肤皱纹等综合效能。
一般而言，植物细胞的55％由细胞壁和细胞膜构成，除了储藏性多糖类(淀粉等)外，植物结构多糖类(纤维素、半纤维素、果胶等)主要存在于高等植物的初级、次级细胞壁和胞间层。其中，纤维素由于具有强的束状结构而不能由热水提取的方法溶解，半纤维素作为碱性溶解物，已知现有的单一溶剂提取方法在充分提取植物细胞壁成分方面存在局限性。
并且，由于在溶剂提取的一系列过程中，植物的细胞壁和细胞膜遭到破坏，细胞内包含的不稳定有用成分可能会流失和丧失，随着时间推移，常规的植物提取物中有效成分的稳定性也可能会下降。不仅如此，作为植物提取物，其主要为液状形式，并且这种液相以不含透明性油脂、其他不溶性物质和因环境变化而产生的沉淀物的液状提供。为了制备这种液状特性的植物提取物，通过物理过滤和沉淀的方法来去除用于提取的植物提取原材料(植物组织、植物细胞、植物细胞壁、植物细胞膜以及其他漂浮性的植物来源的非溶解性物质)。
此外，细胞壁中的功能成分(比如糖蛋白)可以作为“生物刺激剂”与动物细胞相互作用，例如，60年代初期在植物细胞壁中发现的胡萝卜衍生糖蛋白由于含有高含量的羟基丝氨酸，故具有较强的皮肤保湿能力；此外，据报道，尼古丁、芜菁和刀草的细胞壁中的糖蛋白成分具有皮肤细胞抗氧化、皮肤色素脱失抑制效果、皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成等皮肤方面上的效能。
本申请中，积雪草化妆品原料中包含有完整细胞结构的积雪草植物细胞，相较于常规的制备工艺提取到的积雪草提取物(基本不含有完整的细胞结构)，可以有效避免提取溶剂残留在积雪草化妆品原料中对其综合效能造成影响，而且还能有效避免细胞壁和细胞膜破损后造成胞内有效成分的流失以及有效成分由于缺少保护导致的稳定性较低的问题。此外，积雪草化妆品原料由于包含细胞壁，细胞壁中的部分功能成分(比如糖蛋白)也能发挥皮肤抗氧化、皮肤保湿、皮肤色素脱失抑制效果以及皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成等功效，相较于不含积雪草细胞的积雪草提取物，能够更为有效地提升其综合性能。因此，通过细胞膜和细胞壁对胞内有效成分的保护作用以及细胞壁中的部分功能组分的协同作用，相较于常规的基本不含积雪草细胞或细胞结构被破坏的积雪草提取物，能够在一定程度上改善常规的积雪草提取物存在的有效成分稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，同时，还能进一步提升积雪草化妆品原料的综合效能。
第二方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料的制备方法，包括以下步骤：
将积雪草的植物组织进行粉碎，以得到粉末状的植物组织；将粉末状的植物组织加入到培养液中配置得到细胞培养基；向细胞培养基中接种积雪草生长地土壤后依次经过至少三次富集培养并分离，以得到含有发酵辅酶的培养液；将含有发酵辅酶的培养液依次进行发酵辅酶处理和灭活处理，以得到化妆品原料。
本申请中，基于发酵处理的方式，将粉碎后的积雪草植物组织作为主要营养物质为积雪草生长地土壤中存在的积雪草植物组织降解微生物(比如果胶降解微生物)提供养料，再经过上述培养能够制备得到含有较多完整细胞结构的积雪草化妆品原料，相较于采用常规的积雪草提取物的制备工艺(比如有机溶剂萃取)，不仅能够有效避免提取溶剂残留在积雪草化妆品原料中对其综合效能造成影响，同时，还能制备得到一种含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料，其能够在一定程度上改善积雪草提取物存在的有效成分稳定性较低以及有效成分流失较为严重的问题，同时，还能进一步提升积雪草化妆品原料的综合效能。
需要说明的是，采用积雪草生长地土壤，是由于其含有积雪草植物组织残留物，相应地，其中含有许多适应积雪草植物组织生物降解的土壤微生物，因此，采用含有对应植物降解微生物的土壤来进行富集培养时，可以很容易地从积雪草植物组织中分离出完整的单个植物细胞。可以理解的是，不同植物组织中的有效成分的含量不同，考虑到积雪草化妆品原料中有效成分的含量，可以对植物组织的类型进行限定。
作为一种示例，积雪草的植物组织包含积雪草的叶和/或茎。
该实施方式中，积雪草植物细胞提取自积雪草的叶和/或茎，相较于采用积雪草的其他组织，具有有效成分的含量更高的优势。
需要注意的是，富集培养的具体次数不做限定，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，富集培养的次数为三次。
需要注意的是，每次富集培养的具体工艺不做限定。
作为一种示例，在第一次富集培养的步骤中，包括对培养基依次进行高压灭菌、土壤接种、恒温培养以及培养液分离。
需要注意的是，每个处理过程中的具体工艺条件不做限定，可以按照本领域常规选择进行。
作为一种示例，培养基包括2g酵母原料、88g干燥积雪草叶和/或茎(80目)，以及910g去离子水；可以理解的是，各成分的用量配比不固定，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，高压灭菌的过程中，处理温度为115～125℃，处理时间为15～25min；可以理解的是，处理温度和处理时间并不局限于该范围，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，土壤接种的过程中，土壤的与培养基的质量比为1000：(2～5)。
作为一种示例，恒温培养的过程中，处理温度为25℃，处理时间为7天；可以理解的是，处理温度和处理时间并不局限于该范围，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，培养液分离的过程中，包括采用无纺布进行第一次过滤以及采用5C滤纸进行第二次过滤。
需要说明的是，第二次富集培养与第一富集培养的区别在于，将接种土壤替换为接种第一次富集培养过滤液。
需要说明的是，第二次富集培养与第三次富集培养的区别在于，将接种第一次富集培养替换为接种第二次富集培养过滤液，以及对过滤后的培养液进行离心，以得到含有发酵辅酶的培养液。
需要说明的是，离心的过程中，具体工艺参数不做限定，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，离心过程中，转速为14000～16000rpm，离心时间为25～35min。
可以理解的是，通过含有发酵辅酶的培养液制备得到含有积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料的步骤中，除了发酵辅酶处理以及灭活处理外，还包括一些本领域的常规辅助操作，具体的工艺不做限定，可以按照本领域常规操作进行。
作为一种示例，通过含有发酵辅酶的培养液制备得到含有积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料的步骤中，包括依次对含有发酵辅酶的培养液进行浸泡、干燥、破碎、发酵辅酶处理、酶灭活处理、提取以及提取液分离。
需要注意的是，每个处理过程中的具体工艺条件不做限定，可以按照本领域常规选择进行。
作为一种示例，浸泡过程中，包括先用质量分数为2～4％的盐水(体积比为培养液：盐水＝1：10)在室温下(25℃)浸泡4～6h；再用去离子水(体积比为培养液：去离子水＝1：10)在室温下(25℃)浸泡0.5～1.5h，去离子水浸泡需要进行两次。
作为一种示例，干燥过程中，采用8～12℃的冷风干燥。
作为一种示例，发酵辅酶处理过程中，处理温度为30℃，处理时间为2h，转速为60rpm；可以理解的是，处理温度、处理时间以及转速并不局限于该值，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，酶灭活过程中，处理温度为70℃，处理时间为1h；可以理解的是，处理温度和处理时间并不局限于该值，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，提取过程中，处理温度为25℃，处理时间为2h；可以理解的是，处理温度和处理时间并不局限于该值，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，提取液分离过程中，采用150μm的袋式过滤器进行过滤。
需要说明的是，对于含有积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料的制备过程中未做特别说明的工艺以及步骤均可按本领域常规操作进行设置。
作为一种示例，一种化妆品原料的制备方法的工艺流程图示例性的如图1所示。
第三方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料在制备改善皮肤再生能力的化妆品中的应用。
第四方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料在制备改善皮肤弹性的化妆品中的应用。
第五方面，本申请实施例提供一种如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料在制备改善皮肤皱纹的化妆品中的应用。
第六方面，本申请实施例提供一种化妆品，包括如第一方面实施例提供的化妆品原料或者采用如第二方面实施例提供的化妆品原料的制备方法制得的化妆品原料。
本申请中，化妆品中包含含有积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料，相较于不含积雪草植物细胞的积雪草提取物，能够使得化妆品具有更好的综合效能。
需要注意的是，化妆品中的化妆品原料的质量占比不做限定，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，化妆品原料在化妆品中的质量占比为0.1～90％，例如但不限于质量占比为0.1％、2％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、7％、80％和90％中的任意一者点值或任意二者之间的范围值。
该实施方式中，将化妆品原料的含量限定在特定范围内，一方面能够有效避免化妆品原料的用量过低，从而有效避免化妆品难以发挥预期的皮肤改善的效果；另一方面能够有效避免化妆品原料的用量过高，从而有效避免相应化妆品制剂难以成型，以制备得到质量合格的化妆品。
需要注意的是，化妆品的型号或种类不做限定，可以根据实际需要进行调整。
作为一种示例，化妆品包括但不均限于润肤水、凝胶、面膜、泡沫、乳液、精华、防晒霜、隔离霜、粉底、BB霜、CC霜、遮瑕膏、睫毛膏、眼线笔、染唇液以及唇彩中的任一种。
该实施方式中，本申请实施例提供的化妆品适用于上述多种体系，能够提供更多的可实施方案，从而便于对本申请实施例提供的化妆品进行推广和应用。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本申请实施例提供一种化妆品原料的制备方法，包括以下步骤：
将干燥积雪草叶粉碎，得到粉末状的植物组织。
将粉末状的植物组织加入到培养液中配置得到细胞培养基。
向细胞培养基中接种积雪草生长地土壤后依次经过三次富集培养，以得到含有发酵辅酶的培养液。
其中，第一次富集培养包括以下步骤：
将2g酵母原料、88g干燥的粉末状植物组织(80目)以及910g去离子水混合，以得到培养基；将培养基在121℃下灭菌20min；然后，向灭菌后的培养基中加入3g积雪草生长地土壤；然后，在25℃下恒温培养7天；然后，对恒温培养后的培养液先采用无纺布进行第一次过滤，再采用5C滤纸进行第二次过滤，以得到第一次富集培养的培养液。
第二次富集培养可参照第一次富集培养过程的工艺步骤，仅需要在向灭菌后的培养基中加入3g积雪草生长地土壤的过程中，将积雪草生长地土壤替换为第一次富集培养的培养液即可。
第三次富集培养可参照第二次富集培养过程的工艺步骤，仅需要在向灭菌后的培养基中加入3g第一次富集培养的培养液过程中，将第一次富集培养的培养液替换为第二次富集培养的培养液；以及将过滤后的第二次富集培养的培养液在15000rpm下离心30min，即可得到含有发酵辅酶的培养液。
对含有发酵辅酶的培养液依次进行浸泡、干燥、破碎、发酵辅酶处理、酶灭活处理、提取以及提取液分离，以得到含有积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料。其中，浸泡过程中，包括先用质量分数为3％的盐水(体积比为培养液：盐水＝1：10)在室温下(25℃)浸泡5h；再用去离子水(体积比为培养液：去离子水＝1：10)在室温下(25℃)浸泡1h，去离子水浸泡需要进行两次；干燥过程中，采用10℃的冷风干燥；发酵辅酶处理过程中，处理温度为30℃，处理时间为2h，转速为60rpm；酶灭活过程中，处理温度为70℃，处理时间为1h；提取过程中，处理温度为25℃，处理时间为2h；提取液分离过程中，采用150μm的袋式过滤器进行过滤。
对比例1
本申请对比例提供一种化妆品原料的制备方法，其与实施例1的区别在于：在制备得到含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料后，利用均质机(FJ200-SH，上海沪析实业有限公司)，在常温和20000rpm条件下进行40分钟的均质化以使细胞破碎；然后，以20000rpm离心30分钟，制备了不含积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料。
制备例1
本申请制备例1提供一种润肤水的制备方法，其制备原料见表1：
表1润肤水制备原料
组分 1-1 1-2 1-3 1-4
去离子水 余量 余量 余量 余量
丁二醇 1.00 1.00 1.00 1.00
甘油 1.00 1.00 1.00 1.00
香料 0.30 0.30 0.30 0.30
PEG-60氢化蓖麻油 1.00 1.00 1.00 1.00
实施例1的原料 0.10 2.00 50.00 90.00
需要说明的是，余量即为除水以外的组分的总和与100之间的差值。
制备方法：将全部制备原料称取、混合后，在常温下用搅拌机以400rpm均匀混合10分钟。
制备例2
本申请制备例2提供一种润肤水的制备方法，其制备原料见表2：
表2润肤水制备原料
组分 2-1 2-2 2-3 2-4
去离子水 余量 余量 余量 余量
丁二醇 1.00 1.00 1.00 1.00
甘油 1.00 1.00 1.00 1.00
香料 0.30 0.30 0.30 0.30
PEG-60氢化蓖麻油 1.00 1.00 1.00 1.00
对比例1的原料 0.10 2.00 50.00 90.00
需要说明的是，余量即为除水以外的组分的总和与100之间的差值。
制备方法：将全部制备原料称取、混合后，在常温下用搅拌机以400rpm均匀混合10分钟。
制备例3
本申请制备例3提供一种凝胶的制备方法，其制备原料见表3：
表3凝胶制备原料
组分 质量占比(％)
去离子水 余量
丁二醇 1.00
卡波姆 0.50
三乙醇胺 0.50
实施例1的原料 50.00
制备方法：将去离子水和丁二醇称取、混合后，在常温下用搅拌机搅拌的同时，加入卡波姆以制备水相，并且用乳化器搅拌水相的同时，加入三乙醇胺以使其增稠后，再加入实施例1的原料并均匀混合。
制备例4
本申请制备例4提供一种面膜的制备方法，其制备原料见表4：
表4面膜制备原料
组分 质量占比(％)
去离子水 余量
丁二醇 1.00
甘油 1.00
实施例1的原料 90.00
制备方法：将全部原料称取、混合后，在常温下用搅拌机以400rpm均匀混合10分钟。
制备例5
本申请制备例5提供一种泡沫的制备方法，其制备原料见表5：
表5泡沫制备原料
组分 质量占比(％)
肉豆蔻酸 30.00
聚山梨醇酯20 1.00
去离子水 余量
实施例1的原料 10.00
丁二醇 0.01
香料 20.00
制备方法：将肉豆蔻酸和聚山梨醇酯20(油相)在80℃下用搅拌机搅拌的同时，加入去离子水、实施例1的原料以及丁二醇的混合体系(水相)，并以3000rpm乳化10分钟，然后加入香料后进行冷却。
制备例6
本申请制备例6提供一种乳液的制备方法，其制备原料见表6：
表6乳液制备原料
组分 质量占比(％)
去离子水 余量
丁二醇 10.00
卡波姆 0.01
环戊硅氧烷 20.00
聚山梨醇酯60 0.50
三乙醇胺 0.05
实施例1的原料 2.00
制备方法：将去离子水和丁二醇称取、混合后在常温下用搅拌机搅拌的同时，加入卡波姆以制备水相，然后将水相用乳化器搅拌的同时，加入环戊硅氧烷以及聚山梨醇酯60的混合体系(油相)，并以2000rpm乳化10分钟，然后在其中加入三乙醇胺以使其增稠后，加入实施例1的原料并均匀混合。
制备例7
本申请制备例7提供一种霜的制备方法，其制备原料见表7：
表7霜制备原料
组分 质量占比(％)
纯净水 余量
甘油 10.00
实施例1的原料 5.00
卡波姆 0.10
聚二甲基硅氧烷 20.00
乳木果油 2.00
聚山梨醇酯20 0.50
制备方法：将原料1～3称取后在60℃下用搅拌机搅拌的同时，加入原料4以制备水相，然后将水相用乳化器搅拌的同时，加入原料5～7的混合体系(油相)，并以2000rpm乳化10分钟，然后在其中加入原料8以使其增稠后进行冷却。
制备例8
本申请制备例8提供一种精华的制备方法，其制备原料见表8：
表8精华制备原料
组分 质量占比(％)
纯净水 余量
甘油 15.00
透明质酸钠 10.00
实施例1的原料 20.00
卡波姆 0.07
环戊硅氧烷 15.00
聚山梨醇酯60 0.30
三乙醇胺 0.07
制备方法：将原料1～4称取后在常温下用搅拌机搅拌的同时，加入原料5以制备水相，将水相用乳化器搅拌的同时，加入原料6～7的混合体系(油相)，并以2000rpm乳化10分钟，然后在其中加入原料8使其增稠后进行冷却。
制备例9
本申请制备例9提供一种防晒霜的制备方法，其制备原料见表9：
表9防晒霜制备原料
组分 质量占比(％)
纯净水 余量
实施例1的原料 5.00
卡波姆 0.15
环戊硅氧烷 10.00
甲氧基肉桂酸乙基己酯 5.00
水杨酸乙基己酯 2.00
双乙基己氧基苯酚甲氧苯基三嗪 1.00
聚山梨醇酯20 0.30
三乙醇胺 0.15
制备方法：将原料1～2称取后在常温下用搅拌机搅拌的同时，加入原料3以制备水相，并且将水相用乳化器搅拌的同时，加入原料4～8的混合体系(油相)，并以2000rpm乳化10分钟，然后在其中加入原料9使其增稠后进行冷却。
制备例10
本申请制备例10提供一种隔离霜的制备方法，其制备原料见表10：
表10隔离霜制备原料
组分 质量占比(％)
聚二甲基硅氧烷 40.00
PEG-10聚二甲基硅氧烷 1.00
二氧化钛 3.00
氧化铬绿 0.10
丁二醇 10.00
氯化钠 0.50
实施例1的原料 2.00
纯净水 余量
聚二甲基硅氧烷 40.00
制备方法：将原料1～2称取后在常温下用搅拌机搅拌的同时，加入原料3～4以制备油相，然后将油相用乳化器搅拌的同时，加入原料5～8的混合体系(水相)，并以2000rpm乳化10分钟。
制备例11
本申请制备例11提供一种妆前乳的制备方法，其制备原料见表11：
表11妆前乳制备原料
Figure BDA0004018213260000131
Figure BDA0004018213260000141
制备方法：将原料1～2称取后在常温下用搅拌机搅拌的同时，加入原料3，并以2000rpm均匀搅拌10分钟，然后加入原料4并均匀混合。
制备例12
本申请制备例12提供一种粉底的制备方法，其制备原料见表12：
表12粉底制备原料
组分 质量占比(％)
聚二甲基硅氧烷 40.00
PEG-10聚二甲基硅氧烷 1.00
二氧化钛 10.00
氧化铁黄 0.80
氧化铁红 0.50
氧化铁黑 0.20
丁二醇 10.00
氯化钠 0.50
实施例1的原料 10.00
纯净水 余量
制备方法：将原料1～2称取后在常温下用搅拌机搅拌，加入原料3～6以制备油相，然后将油相用乳化器搅拌的同时，然后加入原料7～10的混合体系(水相)，并以2000rpm乳化10分钟。
制备例13
本申请制备例13提供一种BB霜的制备方法，其制备原料见表13：
表13 BB霜制备原料
Figure BDA0004018213260000142
Figure BDA0004018213260000151
制备方法：将原料1～3称取后在60℃下用搅拌机搅拌，加入原料4～7以制备油相，然后将油相用乳化器搅拌的同时，然后加入原料8～11的混合体系(水相)，并以2000rpm乳化10分钟后冷却。
制备例14
本申请制备例14提供一种CC霜的制备方法，其制备原料见表14：
表14 CC霜制备原料
组分 质量占比(％)
纯净水 余量
实施例1的原料 30.00
丁二醇 10.00
聚丙烯酸钠 0.30
聚二甲基硅氧烷 10.00
聚山梨醇酯20 1.00
二氧化钛 5.00
氧化铁黄 0.50
氧化铁红 0.20
制备方法：将原料1～3称取后在常温下用搅拌机搅拌，加入原料4以准备水相；同时，将称取并均匀混合的原料5～6在常温下用搅拌机持续搅拌并加入原料7～10的混合体系以制备油相，然后用乳化器搅拌水相的同时加入油相，并以2000rpm乳化10分钟。
制备例15
本申请制备例15提供一种遮瑕膏的制备方法，其制备原料见表15：
表15遮瑕膏制备原料
Figure BDA0004018213260000152
Figure BDA0004018213260000161
制备方法：将原料1～3称取后在80℃下用搅拌机搅拌，然后加入原料4～7以制备油相，然后用乳化器搅拌油相的同时，加入原料8～11的混合体系(水相)，并以2000rpm乳化10分钟后进行冷却。
制备例16
本申请制备例16提供一种睫毛膏的制备方法，其制备原料见表16：
表16睫毛膏制备原料
组分 质量占比(％)
纯净水 余量
实施例1的原料 5.00
丙烯酸酯共聚物 20.00
聚乙烯醇 2.00
氧化铁黑 10.00
蜂蜡 10.00
巴西棕榈蜡 10.00
聚山梨醇酯60 1.00
纯净水 5.00
制备方法：将原料1～3称取后在80℃下用搅拌机搅拌的同时，加入原料4～5分散均匀，再加入原料6～8的混合体系(油相)，并以2000rpm乳化10分钟后进行冷却。
制备例17
本申请制备例17提供一种眼线笔的制备方法，其制备原料见表17：
表17眼线笔制备原料
组分 质量占比(％)
纯净水 余量
实施例1的原料 5.00
丙烯酸酯共聚物 40.00
聚乙烯醇 1.00
膨润土 1.00
氧化铁黑 20.00
二异硬脂醇苹果酸酯 1.00
鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯 1.00
聚山梨醇酯60 0.50
丙烯酸酯共聚物 40.00
制备方法：将原料1～3称取后在60℃下用搅拌机搅拌，再加入原料4～6以制备水相，然后用乳化器搅拌水相的同时，加入原料7～9的混合体系(油相)，并以2000rpm乳化10分钟后进行冷却。
制备例18
本申请制备例18提供一种染唇液的制备方法，其制备原料见表18：
表18染唇液制备原料
组分 质量占比(％)
纯净水 余量
实施例1的原料 10.00
甘油 20.00
红2号 0.10
聚丙烯酸钠 0.50
制备方法：将原料1～2称取后在常温下用搅拌机搅拌的同时，加入原料3并分散均匀后，再加入原料4以使其增稠后均匀搅拌。
制备例19
本申请制备例19提供一种唇彩的制备方法，其制备原料见表19：
表19唇彩制备原料
组分 质量占比(％)
二异硬脂醇苹果酸酯 余量
氢化聚异丁烯 30.00
聚丁烯 30.00
微晶蜡 5.00
二氧化钛 0.50
实施例1 0.10
红202号 0.20
制备方法：将原料1～7称取并在80℃下用搅拌机均匀搅拌后进行冷却。
试验例1
发酵辅酶中果胶酶的活性测试
测试方法：
按照实施例1提供的制备方法，分别在完成了第一、第二以及第三次富集培养后，对得到的各个培养液进行编号，然后，对各个样品分别以15000rpm离心15分钟，取上清液，然后，测量各试样的果胶酶活性：具体的酶活性测量方法如下：
将聚半乳糖醛酸作为底物溶于蒸馏水中后，用0.1M NaOH调节pH至8.5，并以15000rpm离心25分钟以制备底物溶液。在100μL的酶溶液和200μL的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH9.0)中添加200μL的底物溶液并在40度下反应30分钟。然后，添加5mL的10mM硫代巴比妥酸和2.5mL的0.5M HCl，并在水浴中煮沸45分钟后迅速冷却；然后，以3000rpm离心5分钟，在550nm处测量其吸光度(此时，将吸光度0.1的值定义为1个单位，即unit)。
需要说明的是，第三次富集培养后的即为最终的发酵辅酶的活性测试结果，且上述试验重复进行四次。
表20发酵辅酶在制备过程中果胶酶活性的变化结果
试样名 果胶酶活性(unit)
富集培养前 -
第一次富集培养后 1360
第二次富集培养后 2630
第三次富集培养后 3510
第二次试验最终结果 3290
第三次试验最终结果 3640
第四次试验最终结果 3300
参阅表20可知，在每阶段富集培养后，果胶酶活性均明显增加，可知培养液中果胶降解微生物占具优势。此外，四次重复试验结果均表现出相似的果胶酶活性，说明本申请实施例提供的制备方法较为稳定。
试验例2
原料中完整积雪草植物细胞随发酵辅酶处理时间的变化
测试方法：
将实施例1制备得到的发酵辅酶在常温30度下，以60rpm条件下分别处理1、2、3以及4小时后，使用血细胞计数器对发酵辅酶处理液在光学显微镜下对发酵辅酶处理液中的完整植物细胞进行计数。
表21细胞数量测试结果
试样名 完整细胞数(cells/mL)
0h -
1h 1.5×10<sup>4</sup>
2h 3.5×10<sup>5</sup>
3h 7.7×10<sup>4</sup>
4h 3.1×10<sup>4</sup>
需要说明的是，“-”表示细胞数量过少，无法正常计数。
参阅表21可知，发酵辅酶处理的最佳时间为2h。
试验例3
积雪草提取液的电镜测试
测试方法：
将实施例1制备得到的含有积雪草细胞的积雪草提取液在显微镜下进行观察即可。
参阅图2可知，含有积雪草细胞的积雪草化妆品原料在显微镜下拍摄的图片中包含许多结构完整的积雪草细胞，说明按照本申请实施例1提供的制备方法能够制备得到含有细胞壁未被破坏的积雪草细胞的积雪草化妆品原料。
试验例4
有效成分(例如多酚)稳定性测试
测试方法：
分别按照实施例1以及对比例1的制备方法进行积雪草化妆品原料的制备，然后分别对制得的积雪草化妆品原料进行编号，同时，以单宁酸为标准品制作标准曲线，然后，分别向各样品中加入福林试剂溶液，静置3min后，加入10％的碳酸钠溶液，静置1h后再测试760nm处的吸光度以计算有效成分的含量，通过该方法分别测试在制备当天(即第1天)以及第30天的总多酚含量。
表22多酚含量测试结果
Figure BDA0004018213260000191
参阅表22可知，不含积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料(对比例1)的总多酚含量减少了73.4％，而含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料(实施例1)的总酚含量仅减少了16.47％，由此可以说明：含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料相比于不含积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料(即通过溶剂提取法制得的常规积雪草提取物)，对多酚表现出更高的稳定性，积雪草化妆品原料内的积雪草植物细胞增加了作为植物有效成分之一的多酚的稳定性。其原因在于，有效成分存在于植物细胞的细胞壁内，细胞壁保护了胞内的有效成分。
试验例5
积雪草化妆品原料对EGF分泌促进能力评估
测试方法：
分别按照实施例1以及对比例1的制备方法进行积雪草化妆品原料的制备，然后分别对制得的积雪草化妆品原料进行编号备用。然后，在包含内皮生长试剂盒组分的EGM-2培养基中进行了人脐静脉内皮细胞的培养试验。此时，用于实验的细胞代数(passage)不超过6代。在96孔板(well plate)中接种人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Human Umbilical VeinEndothelial Cells)使其达到1×104cells/well，然后在37℃、5％的CO2条件下培养了24h。将实施例1以及对比例1的积雪草化妆品原料分别以10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL浓度处理，然后培养48h后，利用EGF ELISA kit(R&D systems)来测量破坏沉淀后的上清液中的EGF含量。
参阅图3可知，采用实施例1制备得到的含有积雪草细胞的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，相较于采用对比例1制备得到的积雪草植物细胞被破坏后的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，前者对应的EGF分泌量增加幅度更大，由此可以说明含有完整细胞结构的积雪草细胞的积雪草提取液具有进一步促进EGF分泌的功能。
试验例6
积雪草化妆品原料对EGF mRNA表达水平的影响
测试方法：
分别按照实施例1以及对比例1的制备方法进行积雪草化妆品原料的制备，然后分别对制得的积雪草化妆品原料进行编号备用。然后，在包含内皮生长试剂盒组分的EGM-2培养基中进行了人脐静脉内皮细胞的培养试验。此时，用于实验的细胞代数(passage)不超过6代。在96孔板(well plate)中接种人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Human Umbilical VeinEndothelial Cells)使其达到1×104cells/well，然后在37℃、5％的CO2条件下培养了24h。将实施例1以及对比例1的积雪草化妆品原料分别以10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL浓度处理，然后培养48h后，然后提取RNA后，合成cDNA，并通过Light Cycler 480系统并利用引物来进行扩增后，计算表达的EGF mRNA水平。
参阅图4可知，采用实施例1制备得到的含有积雪草细胞的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，相较于采用对比例1制备得到的积雪草植物细胞被破坏后的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，前者对应的EGF mRNA表达水平更高，由此可以说明含有完整细胞结构的积雪草细胞的积雪草提取液具有进一步促进EGF分泌的功能。
试验例7
积雪草化妆品原料对角质形成细胞分化标志物表达水平的影响
测试方法：
分别按照实施例1以及对比例1的制备方法进行积雪草化妆品原料的制备，然后分别对制得的积雪草化妆品原料进行编号备用。然后，将HaCaT细胞以3×104cells/well接种到96孔板中后，收获分别用细胞分化因子(5mM的CaCl2)、实施例1制得的积雪草化妆品原料以及对比例1制得的积雪草化妆品原料培养后的细胞，将其裂解后，利用蛋白质提取试剂盒来提取蛋白质。利用SDS-PAGE分离所提取的蛋白质后，转移到硝酸纤维素中，并利用对应的一抗、二抗确认β-肌动蛋白和外皮蛋白的表达水平。
参阅图5可知，采用实施例1制备得到的含有积雪草细胞的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，相较于采用对比例1制备得到的积雪草植物细胞被破坏后的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，前者对应的外皮蛋白的表达水平更高，由此可以说明含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料能够更多地促进外皮蛋白的表达。
试验例8
积雪草化妆品原料对成纤维细胞增殖促进效果的测量
测试方法：
分别按照实施例1以及对比例1的制备方法进行积雪草化妆品原料的制备，然后分别对制得的积雪草化妆品原料进行编号备用。然后，将成人真皮成纤维原代细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中进行培养，用于实验的细胞代数不超过8代。在96孔板中成人真皮成纤维原代细胞使其达到1×104cells/well，然后在37℃、5％的CO2条件下培养了24h。将实施例1以及对比例1的积雪草化妆品原料分别以10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL浓度处理细胞，然后培养48h后，利用CCK-8试剂来测量成纤维细胞的存活率。
参阅图6可知，采用实施例1制备得到的含有积雪草细胞的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，相较于采用对比例1制备得到的积雪草植物细胞被破坏后的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，前者能够进一步增加真皮成纤维细胞的存活率，由此可以说明含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料对改善皮肤再生、改善皮肤弹性和改善皮肤皱纹等更有效。
试验例9
积雪草化妆品原料对I型胶原C端肽(PICP)生成量的影响
测试方法：
分别按照实施例1以及对比例1的制备方法进行积雪草化妆品原料的制备，然后分别对制得的积雪草化妆品原料进行编号备用。然后，将成人真皮成纤维原代细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中进行培养，用于实验的细胞代数不超过8代。在96孔板中成人真皮成纤维原代细胞使其达到1×104cells/well，然后在37℃、5％的CO2条件下培养了24h。将实施例1以及对比例1的积雪草化妆品原料分别以10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL浓度处理细胞后，利用ELISA试剂盒对破坏沉淀后的上清液中的分泌的I型前胶原C端肽的量进行测量。
需要说明的是，胶原蛋白在细胞内合成为前胶原，然后分泌到细胞外聚合成为胶原纤维。此时，前胶原的N/C末端的前肽可通过内肽酶发生游离。因此，可以通过游离的前肽量来确定胶原蛋白生物合成的程度。
参阅图7可知，采用实施例1制备得到的含有积雪草细胞的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，相较于采用对比例1制备得到的积雪草植物细胞被破坏后的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，前者对应的I型前胶原C端肽的分泌量更高，由此可以说明含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料对改善皮肤弹性和改善皮肤皱纹等更有效。
试验例10
积雪草化妆品原料对改善皮肤皱纹的临床评估
测试方法：
分别按照实施例1以及对比例1的制备方法进行积雪草化妆品原料的制备，然后分别对制得的积雪草化妆品原料进行编号备用，然后，按照制备例2-2的方法以及配比分别制备得到润肤水。然后，将对应润肤水分别涂覆于30～55岁的受试者(n>30)，每天2次持续4周，然后利用皮肤测试仪(Callgari公司，意大利)来测量眼角的弹性。
参阅图8，采用实施例1制备得到的含有积雪草细胞的积雪草化妆品原料对细胞进行处理后，相较于采用对比例1制备得到的积雪草化妆品原料对皮肤进行处理后，前者对应的眼角弹性的增加值更大，由此可以说明含有积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料对改善皮肤弹性更有效。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (9)

1.一种化妆品原料，其特征在于，所述化妆品原料包括含有完整细胞结构的积雪草植物细胞的积雪草化妆品原料。
2.一种如权利要求1所述的化妆品原料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将积雪草的植物组织进行粉碎，以得到粉末状的植物组织；
将所述粉末状的植物组织加入到培养液中配置得到细胞培养基；
向所述细胞培养基中接种积雪草生长地土壤后依次经过至少三次富集培养并分离，以得到含有发酵辅酶的培养液；
将所述含有发酵辅酶的培养液依次进行发酵辅酶处理和灭活处理，以得到所述化妆品原料。
3.根据权利要求2所述的化妆品原料的制备方法，其特征在于，所述积雪草的植物组织包含积雪草的叶和/或茎。
4.一种如权利要求1所述的化妆品原料或者采用如权利要求2～3中任一项所述的化妆品原料的制备方法制得的所述化妆品原料在制备改善皮肤再生能力的化妆品中的应用。
5.一种如权利要求1所述的化妆品原料或者采用如权利要求2～3中任一项所述的化妆品原料的制备方法制得的所述化妆品原料在制备改善皮肤弹性的化妆品中的应用。
6.一种如权利要求1所述的化妆品原料或者采用如权利要求2～3中任一项所述的化妆品原料的制备方法制得的所述化妆品原料在制备改善皮肤皱纹的化妆品中的应用。
7.一种化妆品，其特征在于，包含如权利要求1所述的化妆品原料或者采用如权利要求2～3中任一项所述的化妆品原料的制备方法制得的所述化妆品原料。
8.根据权利要求7所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品原料在所述化妆品中的质量占比为0.1～90％。
9.根据权利要求7或8所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品为润肤水、凝胶、面膜、泡沫、乳液、精华、防晒霜、隔离霜、粉底、BB霜、CC霜、遮瑕膏、睫毛膏、眼线笔、染唇液以及唇彩中的任一种。
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