CN111374922B - 一种大米复合发酵产品及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种大米复合发酵产品及其制备方法和应用，该制备方法包括：将发酵菌接种至由大米、石榴果提取物、白花蛇舌草、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述大米复合发酵产品。采用该制备方法制备的大米复合发酵产品，具有强大的抑制酪氨酸酶活力的能力，具有良好的美白效果和肤感。

Description

一种大米复合发酵产品及其制备方法和应用

技术领域

本公开涉及发酵技术领域，尤其涉及一种大米复合发酵产品及其制备方法和应用。

背景技术

大米是稻谷经清理、砻谷、碾米和成品整理等工序后制成的成品，大米含有稻米中近64％的营养物质和90％以上的人体所需的营养元素，同时是中国大部分地区人民的主要食品。大米还具有护肤用途功效，以大米提取液作为主要成分(其富含y-谷维素、稻糠甾醇和原花青素等成分)，有性质温和安全，具有较强的润白功效，并可补充肌肤所缺失水分，使肌肤光滑细腻，充满弹性功效。我国稻米资源丰富，为开发应用稻米提供有利条件。随着稻米栽培业迅速发展及应用范围拓宽，对大米营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步深入。

石榴果为石榴(Punica granatum L.)的果实，含有丰富的维生素C、石榴多酚和花青素等物质，有很好的排毒、抗氧化功效，其中，石榴多酚能抑制透明质酸酶的活性，从而减缓透明质酸的分解速度，从而达到保湿的效果；另外，石榴多酚能以氢键和疏水等作用与皮肤内的蛋白质发生反应，产生收敛作用，减少皱纹。石榴果提取物在药用、美容、食疗方面都有重要作用。

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)为茜草科金鸡纳亚科耳草族耳草属，药用价值极高，主要功效是清热解毒、消痛散结、利尿除湿，尤善治疗各种类型炎症。在临床实践中，发现白花蛇舌草若配伍得当，可治疗多种疾病。白花蛇舌草在化妆品里也有运用，全草含车叶草甙，含多种美白成分如熊果酸、β-谷甾醇豆甾醇、齐墩果酸、β-谷甾醇-β-葡萄糖甙；另外，白花蛇舌草提取物还可用作化妆品的抗菌剂；其提取物尚可用作抗炎剂和减肥剂。

目前食品、化妆品领域较为常用的活性物质提取方法有热水浸提法、酸提取法、碱提取法、酶提取法、微生物发酵法。其中，微生物发酵法不需要添加其它的催化剂，只需先培养出大量的微生物菌种，然后加入底物进行能实现的反应，所以微生物法比化学试剂的反应法更专一、更有效；反应条件温和，微生物发酵一般都是在常温和pH为7左右的条件下进行催化反应，不需要高温、高压等苛刻的条件；设备的运行操作也比较简单、安全，产生的公害较少，一般不会造成环境污染，后处理也相对简单；筛选不同的菌种与优化反应条件可提高转化率，对同一底物进行微生物转化的菌种可能有多种，通过筛选选出最佳菌种，可以保证较高的转化率。当今国内外许多研究者采用生物法生产多糖，即微生物法、酶法、植物细胞组织培养等多种生物转化法结合，已经呈现出明显优势。微生物发酵技术在天然活性物质的研究开发中发挥着越来越重要的作用。发酵技术在护肤品中应用已有大量报道，最著名的例子就是SK II神仙水。

尽管大米、石榴果和百花蛇舌草各自都在化妆品领域有着应用，但基本都各与多种原料复配使用，活性物提取方式也多种多样，如何选择更有潜力的材料组合，如何改进活性物的提取效果，仍然是研究人员面临的难题。

发明内容

在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

鉴于现有技术的上述缺陷，本公开的目的是提供大米复合发酵产品及其制备方法、应用，具有良好的美白效果和肤感。

根据本公开的一个方面，提供了一种大米复合发酵产品的制备方法，包括：将发酵菌接种至由大米、石榴果提取物、白花蛇舌草、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述大米复合发酵产品。

本公开中采用的发酵菌为益生菌，可以维持新的皮肤环境，有益于改善皮肤的生态平衡和舒适度，强化微生物保护膜，促进皮肤微循环。优选地，所述益生菌为乳酸菌；具体为选自以下任一种或两种以上：

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp. Bulgaricus)，保藏编号为CGMCC 1.16075，可从CGMCC购买；

布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，保藏编号为CGMCC 1.15607，可从CGMCC购买；

两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，保藏编号为CGMCC 1.5029，可从CGMCC购买。

本公开中发酵底物将大米、石榴果提取物、白花蛇舌草加入水中后经灭菌处理制备而成。

本公开中采用的大米是稻谷经清理、砻谷、碾米、成品整理等工序后制成的成品，优选用量为0.4-3％，即大米用量占水重量的0.4-3％，可以为大米颗粒也可以为大米粉末。如用量比例超过3％，大米和水灭菌后会体系变得过于粘稠，氧气供应不足，不利于微生物发酵；如用量比例不足 0.4％，仍然可以顺利发酵，但是体系过稀，生产效率较低。

本公开中采用的石榴果提取物为石榴(Punica granatum L.)的果实提取物。石榴果实中含有丰富的维生素C、石榴多酚和花青素等物质，因此其提取物具有很好的排毒、抗氧化功效。本公开的实施例中所用石榴果提取物为10:1粗提物，即用100重量份的原料(即新鲜的整颗石榴果)水浸提后，所得清液浓缩成为10重量份，然后制成的干粉；优选用量为0.005-0.015％，即发酵底物中所述石榴果提取物占水重量的 0.0005-0.015％。石榴果提取物用量比过低不能体现应有的功效，石榴果提取物用量比过高得到的发酵液整体颜色较深，色素沉着于皮肤且容易产生造成皮肤过敏反应。

本公开中采用的石榴果提取物可以为市售产品，也可以为自制，比如采用热水浸提法自制，可选的一个制备方法如下：取1重量份新鲜的石榴果、切碎加至10重量份水中(即重量比为1:10)，加热至95℃保温2h进行提取，然后离心分离，取清液将其浓缩至0.1重量份，然后干燥成干粉。

本公开中采用的白花蛇舌草具有抑制Melan-细胞黑色素生成及抑制酪氨酸酶活性的作用，对防止和改善色素沉淀具有很好效果。可以采用整株，但本公开中优选使用部位为叶，干品，优选用量为0.005-0.01％，即发酵底物中所述白花蛇舌草占水重量的0.005-0.01％。白花蛇舌草用量比过低不能体现应有的功效，白花蛇舌草用量比过多得到的发酵液整体颜色较深，色素沉着于皮肤且容易产生造成皮肤过敏反应。

本公开中白花蛇舌草既可以是其本身，也可以是其提取物，比如白花蛇舌草提取物按适合比例配置于发酵底物中。

上述大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp. Bulgaricus)。

进一步地，用于接种至发酵底物的德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液的制备方法依次包括如下步骤：

活化：将菌种接种至MRS液体培养基的试管中，35～37℃活化20～48h；

纯化：取所述活化步骤得到的液体菌种梯度稀释后，接种于MRS固体培养基平板中，35～37℃静置培养40～48h；

液体培养：取所述纯化步骤得到的的单菌落2～3环，接种于100mL MRS液体培养基中，35～37℃活化20～48h；

扩大培养：以10％(体积比)接种量取所述液体培养步骤得到的菌液，接入到MRS液体培养基中，35～37℃培养10～14h左右，当菌体量达到 10⁷-10¹⁰CFU/mL时，得到种子液。

其中，上述MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O 5.0g,柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，吐温80 1.0mL，pH6.2，补足水分至1000mL；上述MRS固体培养基为往上述MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉；所述MRS液体培养基和MRS固体培养基的灭菌条件为： 115～121℃15～20min。

上述小米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，用于接种至发酵底物的乳酸菌种子液的浓度为10⁷-10¹⁰CFU/ml(比如 10⁸CFU/ml、10⁹CFU/ml等)；所述发酵菌的接种比例，即所述种子液与所述发酵底物的体积比为1％～3％(比如1.2％、1.5％、2％、2.5％、2.8％等)。

上述大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵培养的温度为30-50℃(比如31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、 37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、 48℃、49℃等)，时间为6-10h(比如6.5h、7h、8h、9h、9.5h等)。

上述大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理的温度是115～121℃(比如116℃、117℃、118℃、119℃、120℃等)，时间是15-20min(比如16min、17min、18min、19min等)。

上述大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理前，还包括分离处理，弃沉淀，取上清液进行所述灭菌处理，最终得到所述大米复合发酵产品，即大米复合发酵原浆。

上述大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到所述大米复合发酵产品，即大米复合发酵干粉。

上述大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述干燥处理可以是喷雾干燥、真空冷冻干燥。

上述大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述分离处理为离心处理；进一步优选地，所述离心处理的速度是 3500-8000r/min(比如4000r/min、4500r/min、5000r/min、5500r/min、 6500r/min、7000r/min、7500r/min等)，时间是20-60min(比如25min、30min、 40min、50min、55min等)。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种采用上述制备方法制备的大米复合发酵干粉。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种采用上述制备方法制备的大米复合发酵原浆。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述大米复合发酵干粉在制备化妆品的应用。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述大米复合发酵原浆在制备化妆品的应用。

上述化妆品可以是面膜、精华液或爽肤水等。

上述根据本公开实施例的技术方案，通过选取适合的菌种对大米、石榴果提取物、白花蛇舌草进行复合发酵，制得了一种新型大米复合发酵原浆，具有良好的抑制酪氨酸酶活力的能力，具有良好的美肤、护肤效果。

通过以下结合附图对本公开的最佳实施例的详细说明，本公开的这些以及其他优点将更加明显。

附图说明

本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：

图1示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆配制成体积百分比为10％的水溶液(10％样品)和体积百分比为0.1％的透明质酸水溶液 (0.1％HA)进行皮肤水分含量(简称“水含”)和皮肤水分流失量(即经皮水分散失，简称“水散”)测试所得结果；

图2示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆配制成体积百分比为10％的水溶液(10％样品)和体积百分比为0.1％的透明质酸水溶液 (0.1％HA)进行皮肤水分含量(简称“水含”)测试所得结果，其中，A 表示使用后不同时间点与各区域使用前水分含量的变化百分比变化趋势， B表示不同时间点不同区域的水分含量中位数变化趋势；

图3示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆配制成体积百分比为10％的水溶液(10％样品)和体积百分比为0.1％的透明质酸水溶液 (0.1％HA)进行皮肤水分流失量(即经皮水分散失，简称“水散”)测试所得结果，其中，A表示使用后不同时间点与各区域使用前TEWL值的变化百分比变化趋势，B表示不同时间点不同区域的TEWL值中位数变化趋势；

图4示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆进行透皮吸收性实验所得结果；

图5示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆进行抗氧化清除 ABTS自由基测试所得结果；

图6示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆进行酪氨酸酶抑制率测试所得结果；

图7示出了志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆后进行皮肤皱纹及粗糙度测试所拍摄的照片，其中，从上至下依次为分析毛孔、细纹、皱纹的照片，从左至右依次为使用样品前、使用样品后5min、20min、60min 拍摄的照片；

图8示出了志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆前后测试部位的皮肤毛孔数柱状图；

图9示出了志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆前后测试部位的皮肤细纹深度柱状图；

图10示出了志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆前后测试部位的皮肤皱纹深度柱状图。

具体实施方式

在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大米来自市面销售，具体为东北五常稻花香大米(品牌：金龙鱼)。

下述实施例中的石榴果提取物为西安优硕生物科技有限公司生产的石榴果提取物，规格为10:1，10:1粗提物即用100重量份的原料(即新鲜的整颗石榴果)提取后浓缩成为10重量份，然后干燥为粉末状。

下述实施例中的白花蛇舌草为安徽省亳州市何欢堂农副产品购销有限公司生产的白花蛇舌草叶干品。

下述实施例中的发酵菌为乳酸菌，具体为：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp.Bulgaricus)，保藏编号为CGMCC 1.16075，可从CGMCC购买。还可以根据本申请实施例的内容替换采用布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri，保藏编号为CGMCC 1.15607)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum，保藏编号为CGMCC 1.5029)或任意两者或三者的组合实施本公开的方案。

下述实施例中，MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O 5.0g,柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O0.05g，吐温80 1.0mL，pH6.2，补足水分 1000mL。MRS固体培养基为MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉。培养基成分配置好后于115℃灭菌20min。

实施例1 大米复合发酵原浆的制备

1、菌种的活化：挑取德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)菌落2环接种至100mL MRS液体培养基的试管中，35℃活化24h。

2、菌种纯化：取上述液体菌种梯度稀释后，接种200μL涂布于MRS 固体培养基平板中，35℃静置培养48h。

3、液体培养：取上述平板中的单菌落3环，接种于100mL MRS液体培养基中，35℃活化48h。

4、扩大培养：以10％接种量取上述液体试管，接入到100mLMRS液体培养基中，37℃培养12h，当菌体量达到10⁸CFU/mL时，得到种子液。

5、发酵底物配制：取石榴果提取物(10:1)0.05g，大米5g，白花蛇舌草0.05g，加入到500g水中，115℃灭菌20min，得到发酵底物；其中，石榴果提取物(10:1)占0.01％，大米占1％，白花蛇舌草占0.01％。

6、大米复合发酵原浆的获得：将15mL由步骤4得到的发酵菌种子液接种到500g发酵底物(约500ml)中，得到发酵体系；将发酵体系在 45℃培养箱中发酵8小时，得到发酵产物；将发酵产物在5000r/min、离心30min，弃沉淀，收集上清液，于115℃灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物即为大米复合发酵原浆。

实施例1所制得的大米复合发酵原浆的外观为粘稠液体，颜色为淡白色至淡黄色。pH值5.2-6.3，粘度200-500cP，可溶性固含物含量 1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵提取物符合化妆品质量要求。

对该大米复合发酵原浆进行成分分析，其中，蛋白质检测方法参照 GB5009.5-2010，粗多糖检测方法参照GB/T 5009.8-2008，黄酮检测方法参照GB/T 5009.124-2003，总酚检测方法参照GB/T8313-2008；所得结果如下：实施例1制得的大米复合发酵原浆含蛋白质1.146g/kg、粗多糖 9.014g/kg、总黄酮0.057g/kg(以芦丁计)、总酚0.031g/kg。

实施例2 大米复合发酵原浆在作为化妆品的应用

一、大米复合发酵原浆的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本公开根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1获得的大米复合发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象：

本试验选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法：

将液体样品(100％大米复合发酵原浆，无稀释)0.02mL到0.025mL 滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照 (水)，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后(等待压痕消失)，24h和48h观察皮肤的反应。人体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表1。

表1 皮肤不良反应分级标准

3、试验结果：

参见表2。从表中可以看出：使用实施例1得到的大米复合发酵原浆后都是阴性反应，说明本发明提供的大米复合发酵原浆具有安全性，不会给人体带来不良反应。

表2、实施例1获得的大米复合发酵原浆的斑贴试验

二、大米复合发酵原浆的水含、水散测试

对实施例1获得的大米复合发酵原浆的保湿效果进行测试，具体为皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试，透明质酸(HA)普遍认为是具有较好保湿效果的阳性对照样品，本测试采用10％大米复合发酵原浆(记为10％样品，即用实施例1制备的大米复合发酵原浆配制的体积浓度为 10％的水溶液)和0.1％透明质酸(记为0.1％HA，即用透明质酸配制的体积浓度为0.1％的水溶液)进行对比实验。

1、测试环境：温度:22±1℃；湿度:50％-60％。

2、测试区域：皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试：左右前臂。

3、测试时间点：皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试：使用前、使用后5min、20min、60min。

4、实验仪器：Cornemeter，CM825、Tewameter，TM300。

5、测试方法：

1)30名符合条件的志愿者参加测试。测试场所无光线直射、无风，室温22～24℃，湿度40％～60％。检测前用洗面奶清洗双侧前臂，静息 30min，取受试者双侧前臂内侧，用记号笔画出面积为3.5×3.5cm正常皮肤。依次测量在使用前的皮肤水分含量及皮肤水分流失量。

2)将浸有待测样品(分别为10％样品，0.1％HA)的面膜分别剪成3 ×3cm大小，分别贴在前臂相应标记处，15min后取下，轻轻用化妆棉沾干测试部位未干的精华液，并开始计时。

3)分别在5min、20min、60min时测试3个部位角质层含水量及TEWL 值。每个部位测量3次取平均值。

6、测试结果：

图1是30名志愿者手臂测试皮肤水含和水散的离散图，从图1可以看出10％样品(即10％大米复合发酵原浆)和0.1％HA的水含水散变化趋势较相似，利用T-Test分析其显著性发现，使用后5min的水含量显著高于本底(样品p＝0.02，vs本底；HA p＝0.01，vs本底)，其他时间点水含量与本底均无显著性差异。

进一步对数据进行分析，图2中的A为10％样品和0.1％HA的水含量变化百分比趋势图，B为10％样品和0.1％HA水含量中位数的变化趋势图。从图2中可以看出样品和HA在使用后5min的水含量中位数均达到最大，随着使用后时间的延长，样品和HA的水含量中位数均呈现降低趋势，水含量变化百分比均低于0，表示使用后该时间点的水含量低于本底数据，但是样品和HA数据趋势相似。

图3中的A为10％样品和0.1％HA的经皮水分散失变化百分比趋势图，B为10％样品和0.1％HA经皮水分散失量中位数的变化趋势图。由图3可知，样品和HA的经皮水分散失变化规律较为相似，两者均在使用后5min达到最大，是因为此时水含量较大造成经皮水分散失也较大；随着使用后时间的延长，经皮水分散失量逐渐下降，并在使用后60min有所回弹，该时间点下的TWEL变化百分比均大于0，表示该时间点下的TWEL 高于皮肤本底，这是由于未进一步进行锁水成分(如油脂)的涂抹的原因。

可见实施例1制备的大米复合发酵原浆具有良好的补水性能，其10％样品与0.1％HA补水性能相当。

三、透皮吸收性实验

1、鼠皮的制备

将裸鼠脱颈椎处死，迅速将其背部毛用剃须刀剃净，剥离背部皮肤并除去皮下脂肪，血管，用蒸馏水反复冲洗至净，再用生理盐水冲洗数遍，置-80℃冰箱中冷藏备用(在5天内用完)。

2、Franz扩散池进行体外透皮吸收实验

实验过程：向体外渗透扩散装置恒温槽中加入适量水。开启电源和恒温槽磁力搅拌，设定恒温槽中水温为37±0.1℃。将制备好的鼠皮用铁夹子固定在两室扩散池之间，向垂直扩散池的接受池内加入5mL接受液，放入体外渗透扩散装置恒温槽中预热，设定接受池搅拌速度为400r/min。向供给池内分别加入供给液(10％样品，即将实施例1制备的大米复合发酵原浆制备成体积百分比为10％的水溶液)，以保鲜膜封住上口。开始记时，当样品(即供给液)渗透0、2、4、6、8、12、24小时时(根据实际样品确定具体时间间隔)，分别取样500μl置具塞离心管中，每次取样的同时向接受池中补充等量的接受液并排除池中的气泡。测定样品含量。再根据以下公式计算出累积透过量Q(mg/cm²)。其中，扩散池底部直径为1.50cm，样品接触面积为1.77cm²。

式中，Q为累积透过量，S为透皮扩散面积，V为改进Franz扩散池接受室的体积，Cn为第n次取样时接受液的浓度，Ci为第i次取样时接受液的浓度，0.5为取样量。通过以上公式计算后，做出累积量与时间的曲线图。接受液为浓度为0.9％的NaCl溶液(生理盐水)；供给液为(10％样品，即将实施例1制备的大米复合发酵原浆制备成体积百分比为10％的水溶液)。

3、实验结果

实验结果参见图4。从图中可以看出样品0到2h时透过率急速增到 0.50mg/cm³，随着时间的延长透过率平缓上升，表示样品可以顺利透过皮肤。

五、抗氧化清除自由基性能测试

1、实验方法

配制ABTS+·储备液：配制2.45mmol/L过硫酸钾，用过硫酸钾溶解 ABTS，配成7mmol/L ABTS储备液，在室温、避光条件下静置12～16h，这种储备液可稳定3～4d。

配制ABTS工作液：将5mL 7mmol/LABTS和88μL 140mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS工作液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734nm下的吸光度在0.70±0.02。

实验操作：取4mL ABTS工作液，加入40μL样品待测液(即事先配置的体积浓度分别为5％、10％、20％、50％、100％的大米复合发酵原浆水溶液)，准确震荡30s，测定反应6min后734nm波长下的吸光度A样品。

按照下式计算：

ABTS·+清除率/％＝(1-A样品/0.700)×100

2、实验结果

实验结果参见图5。从图中可以看出不同浓度的样品具有不同的 ABTS自由基清除能力，且呈现剂量依赖性，100％的样品清除ABTS自由基的能力在40％以上。说明实施例1制备的大米复合发酵原浆具有一定的抗氧化性能。

六、酪氨酸酶抑制率测试

1、实验方法

配置：0.1M HCl；PBS溶液(pH＝6.8，0.1mol/L)；L-酪氨酸溶液(0.05g 溶于35ml的0.1mol/L的HCl中，用pH＝6.8的PBS(0.1mol/L)缓冲液定容至100ml)；样品溶液(即事先配置的体积浓度分别为1％、10％、50％、 100％的大米复合发酵原浆水溶液)。

在玻璃试管中进行生化反应，各管按照下表3数据加入所需PBS缓冲液(pH＝6.8，0.1mol/L)，样品溶液，L-酪氨酸溶液。于37℃水浴中反应10min，加入酪氨酸酶(酶活性为100U/mL)，再于37℃水浴中反应 10min，在475nm测吸光度值。

表3

试剂	C<sub>1</sub>(ml)	C<sub>0</sub>(ml)	T<sub>1</sub>(ml)	T<sub>0</sub>(ml)
					PBS	2	2.5	1	1.5
样品	0	0	1	1
					L-酪氨酸	1	1	1	1
酪氨酸酶	0.5	0	0.5	0

计算酪氨酸酶抑制率的公式如下：

IR(％)＝[(C₁-C₀)-(T₁-T₀)]/(C₁-C₀)×100％

式中：IR—样品对OH·清除率；C₁—空白对照组吸光度值；C₀—不加酪氨酸酶的空白对照吸光度值；T₁—样品组吸光度值；T₀—不加酪氨酸酶的样品组吸光度值。

2、实验结果

实验结果参见图6。从图中可以看出不同浓度样品对酪氨酸酶的抑制能力各不相同，且随着浓度的增大，抑制能力越大，50％的样品浓度其抑制能力已接近100％。说明实施例1制备的大米复合发酵原浆具有良好的美白效果。

七、人体皮肤皱纹及粗糙度测试

1、测试方法

Antera 3D相机可发射多种波长的平行光，并通过收集所测区域内皮肤表面的反射光波长构建出皮肤图像，根据其内置复杂算法，可以准确测量皮肤皱纹、纹理、色素化程度等参数。

选10名符合条件的志愿者参加测试。测试场所无光线直射、无风，室温22～24℃，湿度40％～60％。检测前用洗面奶清洗面部，静息30min，取受试者眼角位置作为测试部位，将浸有样品(实施例1制得的100％大米复合发酵原浆)的面膜分别剪成3×3cm大小，贴在眼角处，15min后取下，轻轻用化妆棉沾干测试部位未干的精华液，并开始计时，在使用前 (本底)、5min、20min、60min时通过Antera 3D面部成像分析。测量在使用前后眼角皮肤毛孔、细纹、皱纹的变化。

2、测试结果

测试结果参见图7-图10。

图7为其中一位志愿者在使用样品过程中眼角皮肤的变化分析图片，其中，从左至右依次为使用前(本底)、使用样品后5min、20min、60min 时的图片；从图中可以看出该志愿者在使用前的毛孔、细纹、皱纹均较为明显，使用实施例1制得的大米复合发酵原浆后有较为明显的改善。

进一步用软件捕捉数据进行变化趋势分析，得到图8～图10。

图8为志愿者所分析眼角区域中毛孔数的变化趋势，从图中可以看出相同区域本底毛孔数在100个左右，使用后20min仪器扫描到的毛孔数目少于本底毛孔数，表明该样品具有缩小毛孔的潜在作用，在使用后60min 时的毛孔数增多，可能是由于样品用后水分散失，皮肤含水量降低造成毛孔明显，数量增多，说明使用原浆后需要及时进行下一步护理。

图9为志愿者所分析眼角区域中细纹平均深度的变化趋势，从图中可以看出相同区域本底皮肤细纹平均深度为0.05mm，使用后5min、20min 和60min的皮肤细纹平均深度均低于本底，表示该样品具有抗细纹能力。

图10为志愿者所分析眼角区域中皱纹平均深度的变化趋势，从图中可以看出相同区域本底皮肤细纹平均深度为0.07～0.08mm，使用后5min、20min和60min的皮肤皱纹平均深度均低于本底，表示该样品具有抗皱纹能力。

综上，在根据本公开的实施例中，本公开提供了如下技术方案，但不限于此：

方案1、一种大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，包括：将发酵菌接种至由大米、石榴果提取物、白花蛇舌草和水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述大米复合发酵产品。

方案2、如方案1所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为乳酸菌。

方案3、如方案1或2所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌具体为选自以下任一种或两种以上：

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp. Bulgaricus)，保藏编号为CGMCC 1.16075；

布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，保藏编号为CGMCC 1.15607；

两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，保藏编号为CGMCC 1.5029。

方案4、如方案1-3中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物通过将所述大米、石榴果提取物和白花蛇舌草加入水中后经灭菌处理制备而成。

方案5、如方案1-4中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述大米用量占水重量的0.4-3％。

方案6、如方案1-4中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述石榴果提取物为用100重量份的新鲜整颗石榴果水浸提后，所得清液浓缩成为10重量份，然后制成的干粉。

方案7、如方案6所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述石榴果提取物采用热水浸提法制备：取1重量份新鲜的石榴果、切碎加至10重量份水中，加热至95℃保温2h进行提取，然后离心分离取清液将其浓缩至0.1重量份，最后干燥成干粉。

方案8、如方案6或7所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述石榴果提取物占水重量的0.0005-0.015％。

方案9、如方案1-8中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述白花蛇舌草为干燥的白花蛇舌草叶。

方案10、如方案9所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述白花蛇舌草占水重量的0.005-0.01％。

方案11、如方案2-10中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，用于接种至所述发酵底物的乳酸菌种子液的浓度为 10⁷-10¹⁰CFU/ml，所述种子液与所述发酵底物的体积比为1％～3％。

方案12、如方案1-11中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)。

方案13、如方案12所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，用于接种至所述发酵底物的德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液的制备方法依次包括如下步骤：

活化：将菌种接种至MRS液体培养基的试管中，35～37℃活化20～48h；

纯化：取所述活化步骤得到的液体菌种梯度稀释后，接种于MRS固体培养基平板中，35～37℃静置培养40～48h；

液体培养：取所述纯化步骤得到的的单菌落2～3环，接种于100mL MRS液体培养基中，35～37℃活化20～48h；

扩大培养：以10％接种量取所述液体培养步骤得到的菌液，接入到 MRS液体培养基中，35～37℃培养10～14h，得到种子液。

方案14、如方案13所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，

所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉 5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O 5.0g,柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，吐温80 1.0mL，pH6.2，补足水分至1000mL；

所述MRS固体培养基为往所述MRS液体培养基中添加1.5wt.％琼脂粉；

所述MRS液体培养基和MRS固体培养基的灭菌条件为：115～121℃ 15～20min。

方案15、如方案1-14中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为30-50℃，时间为6-10h。

方案16、如方案1-15中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的温度是115～121℃，时间是15-20min。

方案17、如方案1-16中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理前，还包括分离处理，弃沉淀，取上清液进行所述灭菌处理，最终得到大米复合发酵原浆。

方案18、如方案1-17中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到大米复合发酵干粉。

方案19、如方案17或18所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述干燥处理至少包括喷雾干燥和真空冷冻干燥中的一种。

方案20、如方案17所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述分离处理为离心处理。

方案21、如方案20所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述离心处理的速度是3500-8000r/min，时间是20-60min。

方案22、一种采用如方案18-22中任一项所述的制备方法制备的大米复合发酵干粉。

方案23、一种采用如方案1-17、20-21中任一项所述的制备方法制备的大米复合发酵原浆。

方案24、一种如方案22所述的大米复合发酵干粉在制备化妆品的应用。

方案25、一种如方案23所述的上述大米复合发酵原浆在制备化妆品的应用。

方案26、如方案24或25所述的应用，其特征在于，所述化妆品是面膜、精华液或爽肤水。

最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (23)

1.一种大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，包括：将发酵菌接种至由大米、石榴果提取物、白花蛇舌草、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述大米复合发酵产品；

所述发酵菌为乳酸菌，所述乳酸菌具体为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus），保藏编号为CGMCC1.16075。

2.如权利要求1所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物通过将所述大米、石榴果提取物和白花蛇舌草加入水中后经灭菌处理制备而成。

3.如权利要求2所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述大米用量占水重量的0.4-3%。

4.如权利要求2所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述石榴果提取物为用100重量份的新鲜整颗石榴果水浸提后，所得清液浓缩成为10重量份，然后制成的干粉。

5.如权利要求4所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述石榴果提取物采用热水浸提法制备：取1重量份新鲜的石榴果、切碎加至10重量份水中，加热至95℃保温2h进行提取，然后离心分离取清液将其浓缩至0.1重量份，最后干燥成干粉。

6.如权利要求4所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述石榴果提取物占水重量的0.0005-0.015%。

7.如权利要求1-6中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述白花蛇舌草为干燥的白花蛇舌草叶。

8.如权利要求7所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，所述白花蛇舌草占水重量的0.005-0.01%。

9.如权利要求1-6、8中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，用于接种至所述发酵底物的乳酸菌种子液的浓度为10⁷-10¹⁰CFU/ml，所述种子液与所述发酵底物的体积比为1%~3%。

10.如权利要求1所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，用于接种至所述发酵底物的德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液的制备方法依次包括如下步骤：

活化：将菌种接种至MRS液体培养基的试管中，35~37℃活化20~48h；

纯化：取所述活化步骤得到的液体菌种梯度稀释后，接种于MRS固体培养基平板中，35~37℃静置培养40~48h；

液体培养：取所述纯化步骤得到的单菌落2~3环，接种于100mL MRS液体培养基中，35~37℃活化20~48h；

扩大培养：以10%接种量取所述液体培养步骤得到的菌液，接入到MRS液体培养基中，35~37℃培养10~14h，得到种子液。

11.如权利要求10所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，

所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O 5.0g, 柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，吐温801.0mL，pH6.2，补足水分至1000mL；

所述MRS固体培养基为往所述MRS液体培养基中添加1.5wt.%琼脂粉；

所述MRS液体培养基和MRS固体培养基的灭菌条件为：115~121℃ 15~20min。

12.如权利要求1-6、8、10-11中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为30-50℃，时间为6-10h。

13.如权利要求1-6、8、10-11中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的温度是115~121℃，时间是15-20min。

14.如权利要求1-6、8、10-11中任一项所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理前，还包括分离处理，弃沉淀，取上清液进行所述灭菌处理，最终得到大米复合发酵原浆。

15.如权利要求14所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到大米复合发酵干粉。

16.如权利要求15所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述干燥处理至少包括喷雾干燥和真空冷冻干燥中的一种。

17.如权利要求14所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述分离处理为离心处理。

18.如权利要求17所述的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，所述离心处理的速度是3500-8000r/min，时间是20-60min。

19.一种采用如权利要求15或16所述的制备方法制备的大米复合发酵干粉。

20.一种采用如权利要求1-14中任一项所述的制备方法制备的大米复合发酵原浆。

21.一种如权利要求19所述的大米复合发酵干粉在制备化妆品的应用。

22.一种如权利要求20所述的大米复合发酵原浆在制备化妆品的应用。

23.如权利要求21或22所述的应用，其特征在于，所述化妆品是面膜、精华液或爽肤水。

Images