CN111544356B - 一种苹果发酵原浆及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种苹果发酵原浆的制备方法，将苹果果浆、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为苹果发酵原浆。本发明采用两种乳酸菌对苹果进行发酵，保留了苹果的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。

Description

一种苹果发酵原浆及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种发酵产品，具体涉及一种具有护肤功能的发酵产品。

背景技术

迄今为止，在护肤品制造行业中，绝大多数的护肤品不是发酵护肤品。有效成分多为传统工艺的提取方法，如浸泡、熬煮等提取方法，这种传统工艺不仅严重耗费食材，非可持续发展，甚至获取物只有很有限的种类与数量，还往往会有一些未知的刺激性。随着技术的进步，也有采用萃取等技术提取植物中的有效成分，但这种萃取工艺会引入大量的有机杂质，还需要分离工艺，并不能得到发酵产物，所得到的成分并不纯净。

绝大多数的新鲜水果都很难直接用到化妆品中，即使是现代，新鲜的水果时常夹杂着对皮肤带有些刺激风险的未知物质。且从历史来看，用于医疗时绝大多数的材料，几乎都是经历炮制、干燥等的加工，然后又是蒸煮后才饮食。但我们也看到，运用发酵技术后得到的物质，多数时候是安全的，且人类有许多的食用案，比如制成水果酒、把水果制成酵素饮品。除了我们已知水果酒的工艺不适合化妆品用以外，我们还在水果酵素饮品的工艺中，见到超长时间的发酵以及存在大量酵素（酶）等，超长时间的发酵不仅耗费极度惊人的空间、时间、资源等，其中含有的大量酵素往往会分解皮肤表面的蛋白质即角质，导致皮肤自身屏障角质的减少，持续使用一段时间，就会受到过度去角质所带来的许多危害，比如不稳定的皮肤、容易过敏等。这也是为何绝大多数的酵素根本不会实际用在化妆品中的两大主要原因。

当前许多的发酵宣称护肤品，实际商品往往是仅往护肤品配方中加入一点点的发酵来源成分，导致在配方中，该发酵产物的含量往往只有1-2%，其他都是传统的化工物质，而许多的植物提取物，当中所含的物质本来就已经少量，在配方中继续以这种低比例添加，自然得到很差的功效，虽然外观状态透明清澈，但对消费者来说，根本毫无意义。

专利CN105687034A公开了一种健康温和酵素护肤霜的制备方法，采用水果皮和黑糖一起发酵。其制作工艺不仅时间耗费极长、且工艺不明确，不清楚明确用哪些种类微生物参与发酵，实际生产中，在质量的控制上，并不理想。

背景技术部分的内容仅仅是发明人所知晓的技术，并不当然代表本领域的现有技术。

发明内容

本发明目的是针对现有技术存在问题中的一个或多个，提供一种苹果果浆经发酵后制得的发酵原浆；

本发明的另一目的是提供上述方法制得的发酵原浆的制备方法；

本发明的又一目的是提供上述发酵原浆的应用。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

一种苹果发酵原浆的制备方法，将苹果果浆、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为苹果发酵原浆。

根据本发明的一个方面，所述苹果果浆为整颗苹果打浆而成。

根据本发明的一个方面，苹果果浆：水的比例为（50-100）g:100-200mL；优选地，所述苹果果浆：水的质量比为100g:200 mL。

根据本发明的一个方面，所述发酵菌液的浓度为10⁵-10⁸CFU/ml。

根据本发明的一个方面，所述发酵菌液与所述苹果果浆的比例关系为（10-40）ml：（5-20）g；优选地，所述发酵菌液与所述苹果果浆的比例关系为20ml：10g。

根据本发明的一个方面，所述发酵的发酵温度为30-45℃，优选为37℃；优选地，所述发酵的发酵时间为8-30h，优选为8h。

根据本发明的一个方面，所述离心在4000-12000r/min下离心15-30min；优选地，所述离心在 4500r/min下离心20min。

根据本发明的一个方面，所述离心的离心半径为9-12cm。

根据本发明的一个方面，所述发酵菌为乳酸菌；优选地，所述发酵菌为植物乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌；进一步优选的，所述植物乳杆菌和嗜热链球菌的比例关系为2：3。

根据本发明的一个方面，所述发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：

菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；

菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；和

菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值=0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度10⁵-10⁸CFU/ml；优选地，所述培养基为MRS培养基。

根据上述方法制得的苹果发酵原浆，所述苹果发酵原浆中含有蛋白质0.5-1.5mg/ml、粗多糖5-10mg/ml、总黄酮0.1-0.5mg/ml、总酚0.1-1.0mg/ml。

根据本发明的一个方面，所述苹果发酵原浆的pH值为4.5-6.8。

一种护肤用产品，包括上述的苹果发酵原浆。

据上述的苹果发酵原浆作为护肤化妆水的应用。

本发明提供的苹果发酵原浆可作为护肤品中的有效成分，也可单独作为护肤品应用，具有抗氧化功能和美白的功能。

本发明提供的利用苹果发酵原浆的制备方法，具有以下优点：

（1）本发明采用两种乳酸菌对苹果进行发酵，保留了苹果的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。

（2）本发明所采用的发酵法，在对苹果有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性。

（3）本发明方法中发酵完成后，发酵原浆中不添加香精等对化学成分，确保产品对人体的安全性。

（4）本发明提供的苹果发酵原浆中富含具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性物质，从而对皮肤具有较强的美白功能，同时与发酵滤液中的成分具有协同作用。

附图说明

图1为本发明具体实施例中苹果发酵原浆对羟自由基清除作用曲线；

图2为本发明具体实施例中苹果发酵原浆对酪氨酸酶活性和熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率柱型图；

图3是本发明具体实施例中苹果发酵原浆的空白对照保湿度柱型图，每组右边为使用苹果原浆后皮肤含水量，左边为空白对照。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同结构。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本发明提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所用发酵菌为植物乳杆菌和嗜热链球菌按比例关系为2：3的混合菌。

发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：

菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；

菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；和

菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值=0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度10⁵-10⁸CFU/ml；优选地，所述培养基为MRS培养基。

菌种活化和菌种纯化是本领域的常规技术手段。

实施例1：

将扩培培养基里的发酵菌浓度为10⁵-10⁸CFU/ml的发酵菌菌液20mL接种到10g的苹果果浆和20mL的水中，并且在37℃培养箱中进行培养24小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在4500r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，收集上清液，即为本发明提供的苹果发酵原浆化妆品。

该实施例制备所得的苹果发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0%，菌落总数小于50 CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。

对该苹果发酵原浆化妆品进行成分分析：本发明制得的苹果发酵原浆化妆品含蛋白质0.5-1.5mg/ml、粗多糖5-10mg/ml、总黄酮0.1-0.5mg/ml、总酚0.1-1.0mg/ml。

苹果发酵原浆的抗氧化功效分析：

实验方法

参考表1，使用10mL，试管设立样品管（T）、样品本底（T0）、空白管（C）、对照管（C0）每一样品的每个受试浓度的样品管（T）需设立3支平行管。

精密移取3mL硫酸亚铁溶液置试管中，依次加入3mL双氧水溶液和3mL水杨酸溶液混匀，于37℃水浴中加热15min;分别加入1mL不同浓度的样品溶液为T，继续加热15min;方法同上，空白管（C）和对照管（C0）以同体积的蒸馏水代替样品，样品本底（T0）和对照管（C0）以同体积蒸馏水代替双氧水反应体系。在510nm处测其吸光度。

表1：样品加液要求

	T-样品管	T0-样品本底	C-空白管	C0-对照管
					FeSO4（mL）	3	3	3	3
H2O2（mL）	3	--	3	--
					水杨酸（mL）	3	3	3	3
样品（mL）	1	1	--	--
					蒸馏水（mL）	--	3	1	4
平行次数	3/样	1/样	3/实验	1/实验

参见图1，横坐标为苹果原浆的质量浓度，纵坐标为羟自由基清除率。

如图1所示，苹果原浆对羟自由基的清除作用明显， 随苹果原浆浓度增大，其清除羟自由基的能力逐渐增强。30%苹果原浆能够清除约48.5%羟自由基，IC50为31.266%。

苹果发酵原浆的美白功效分析：

酪氨酸酶是黑素生成的关键酶,它控制着黑素的形成过程,其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用,故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。

通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：

按表2配置溶液：

抑制率（%）=（C1-T1）/C1X100%

表2 试剂配比表

单位（mL）	C1	C2	T1	T2
					0.05% L-酪氨酸	0.5	0.5	0.5	0.5
样品	0	0	0.5	0.5
					PBS	2	2.5	1.5	2
100U/ml酪氨酸酶	0.5	0	0.5	0
					总体积	3	3	3	3

实验方法：

（1） C2管配好摇匀后，在37摄氏度水浴中加热10min，在波长475下调零；

（2） C1管溶液配好摇匀后，在37摄氏度水浴中加热10min后，加入酪氨酸酶1ml，继续加热10min,测定C1吸光度值。

（3） 方法同上，以T2调零测定T1吸光度值。

（4） 通过C1、T1吸光度值计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T（%）。

实验证明1%熊果苷为酪氨酸酶活性抑制实验的阳性对照，其对酪氨酸酶活性抑制率为75%。25%苹果原浆可抑制34.4%的酪氨酸酶活性，因此苹果原浆具有抑制酪氨酸酶活性的作用，具有一定的美白功效。

苹果发酵原浆的保湿功效分析：

保湿能力是评判产品性能的一个重要指标。皮肤含水量能够在使用产品后提升，并且能够长时间保持比未涂抹的还要高时，可认定该产品具备良好的保湿能力。能够使皮肤滋润、柔软。

实验方法：

首先在受试者（3人）的左右臂做好测量区域，区域面积3cmx3cm，测定样品按（2.0±1.0）mg/cm²的用量进行单次涂抹。先测定各测试区的初始值（样品使用前，然后在设定的时间后测定受试区域和对照区域的水分含量和水分流失。自愿者选择与测试方法按照QL-SOP-YF-3-01和QL-SOP-YF-3-02方法操作。

实验结果与分析：

如图3所示，为苹果发酵原浆的空白对照保湿度柱型图，每组右边为使用苹果原浆后皮肤含水量，左边为空白对照。使用苹果发酵原浆跟未涂抹的空白对照区域相比，苹果发酵原浆长久的保湿性有很明显的优势；受试者使用苹果发酵原浆1天、7天、14天后，皮肤水分含量始终高于未涂抹的空白对照区域。

苹果发酵原浆的安全性评价：

斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对苹果发酵原浆化妆品进行人体封闭式斑贴试验，对其潜在皮肤刺激性进行评估。

选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。称取0.020g-0.025g将固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。

试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续8h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。

8h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后8h和48h分别再观察一次。

斑贴试验结果如表3：

表3、斑贴试验结果

*"-" = 阴性反应；

"±" = 可疑反应：仅有微弱红斑；

"+" = 弱阳性反应（红斑反应）：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；

"++" = 强阳性反应（疱疹反应）；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；

"+++" = 极强阳性反应（融合性疱疹反应）；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。

由表3可知，实施例1提供的苹果发酵原浆在试验中均产生2级反应的不超过1例。经判定，苹果发酵原浆具有安全性，不会给人体带来不良反应。

实施例2：

将扩培培养基里的发酵菌浓度为10⁵-10⁸CFU/ml的发酵菌菌液10mL接种到20g的苹果果浆和80mL的水中，并且在37℃培养箱中进行培养24小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在12000r/min、离心半径为12cm的条件下离心15min，收集上清液，即为本发明提供的苹果发酵原浆化妆品。

该实施例制备所得的苹果发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0%，菌落总数小于50 CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。

实施例3：

将扩培培养基里的发酵菌浓度为10⁵-10⁸CFU/ml的发酵菌菌液40mL接种到5g的苹果果浆和5mL的水中，并且在37℃培养箱中进行培养24小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在4000r/min、离心半径为10cm的条件下离心30min，收集上清液，即为本发明提供的苹果发酵原浆化妆品。

该实施例制备所得的苹果发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0%，菌落总数小于50 CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。

实施例2和实施例3的成分分析结果和实施例1相同，相关的抗氧化功效分析、美白功效分析、保湿功效分析和安全性评价的分析方法与实施例1相同，其结果与实施例1基本相同，在此不做重复描述。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.苹果发酵原浆在制备美白和保湿功效护肤化妆水的应用；所述苹果发酵原浆的制备方法如下：将苹果果浆、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为苹果发酵原浆；所述苹果果浆为整颗苹果打浆而成；所述发酵菌为比例关系为2：3的植物乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌；所述苹果发酵原浆的pH值为4.5-6.8。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述苹果果浆：水的比例为（50-100）g:100-200mL。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述苹果果浆：水的比例为100g:200 mL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵菌液的浓度为10⁵-10⁸CFU/ml。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵菌液与所述苹果果浆的比例关系为（10-40）ml：（5-20）g。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵菌液与所述苹果果浆的比例关系为20ml：10g。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵温度为30-45℃。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵温度为37℃。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵时间为8-30h。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵时间为8h。

11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述离心在4000-12000r/min下离心15-30min。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述离心在 4500r/min下离心20min。

13.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于：所述离心的离心半径为9-12cm。

14.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：

菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；

菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；和

菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值=0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度10⁵-10⁸CFU/ml。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述培养基为MRS培养基。

16.根据权利要求1-12、14、15任一项所述的应用，其特征在于，所述苹果发酵原浆中含有蛋白质0.5-1.5mg/ml、粗多糖5-10mg/ml、总黄酮0.1-0.5mg/ml、总酚0.1-1.0mg/ml。

17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述苹果发酵原浆中含有蛋白质0.5-1.5mg/ml、粗多糖5-10mg/ml、总黄酮0.1-0.5mg/ml、总酚0.1-1.0mg/ml。

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