CN111494269B - 一种葡萄发酵原浆及其制备方法、应用 - Google Patents

一种葡萄发酵原浆及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种葡萄发酵原浆及其制备方法和应用，其中，所述制备方法为：将葡萄的果泥与果水、水的混合物与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为葡萄发酵原浆。本发明采用两种乳酸菌对葡萄进行发酵，保留了葡萄的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。

Description

一种葡萄发酵原浆及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及一种发酵产品，具体涉及一种具有护肤功能的发酵产品。
背景技术
葡萄为著名水果，生食或制葡萄干，并酿酒，酿酒后的酒脚可提酒石酸。葡萄的营养成分葡萄不仅味美可口，而且营养价值很高。成熟的浆果中葡萄含糖量高达10％-30％，以葡萄糖为主。葡萄中的多种果酸有助于消化，适当多吃些葡萄，能健脾和胃。葡萄中含有矿物质钙、钾、磷、铁以及多种维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C和维生素P 等，还含有多种人体所需的氨基酸，常食葡萄对神经衰弱、疲劳过度大有裨益。研究发现，葡萄比阿司匹林能更好地阻止血栓形成，并能降低人体血清胆固醇水平，降低血小板的凝聚力，对预防心脑血管病有一定作用。每天食用适量的鲜葡萄，不仅会减少心血管疾病的发病风险，还特别有益于那些局部缺血性心脏病和动脉粥样硬化心脏病患者的健康。鲜葡萄中的黄酮类物质，能“清洗”血液，防止胆固醇斑块的形成。葡萄越呈黑色，含黄酮类物质越多，但若将葡萄皮和葡萄籽一起食用，对心脏的保护作用更佳。中医认为葡萄性平、味甘酸，入肺、脾、肾经，有补气血、益肝肾、生津液、强筋骨、止咳除烦、补益气血、通利小便的功效。葡萄皮中的白藜芦醇、葡萄籽中的原花青素含量都高于葡萄的其他部位、也高于其他大多数果树，且具有极高的药用价值。
目前，行业中绝大多数的护肤品不是发酵护肤品，主要为传统工艺制备，而传统工艺则受限于古人思维，难有突破，甚至当前发现许多护肤品中的植物提取物运用传统的工艺提取，不仅严重耗费药材，非可持续发展，甚至获取物只有很有限的种类与数量，还往往会有一些未知的刺激性，所以应当考虑用新技术。当前许多的发酵宣称护肤品，实际商品往往是仅往护肤品配方中加入一点点的发酵来源成分，导致在配方中，该发酵产物的含量往往只有1-2％，其他都是传统的化工物质，而许多的植物提取物，当中所含的物质本来就已经少量，在配方中继续以这种低比例添加，自然得到很差的功效，虽然外观状态透明清澈，但对消费者来说，根本毫无意义。且这往往也令好的技术无法在市场上得到真正有意义的推广，埋没优秀的科技。
背景技术部分的内容仅仅是发明人所知晓的技术，并不当然代表本领域的现有技术。
发明内容
本发明目的是针对现有技术存在问题中的一个或多个，提供一种用葡萄制得的发酵原浆；
本发明的另一目的是提供上述方法制得的发酵原浆的制备方法；
本发明的又一目的是提供上述发酵原浆的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
一种葡萄发酵原浆的制备方法，将葡萄果浆、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌、离心得到上清液，即为葡萄发酵原浆。
根据本发明的一个方面，所述葡萄 果浆为整颗葡萄果实直接打浆而成。
根据本发明的一个方面，葡萄果浆：水的比例为(20-50)g:(100-300)mL；优选地，所述葡萄果浆：水的质量比为20g:200mL。
根据本发明的一个方面，发酵菌液的浓度为105-108CFU/ml。
根据本发明的一个方面，所述发酵菌液与所述葡萄果浆的比例关系为(10-40)ml：(100-200)g；进一步优选地，所述发酵菌液与所述葡萄的果泥与果水的比例关系为10ml：100g。
根据本发明的一个方面，所述发酵的发酵温度为30-45℃，优选为40℃。
根据本发明的一个方面，所述发酵的发酵时间为8-30h，优选为12h。
根据本发明的一个方面，所述离心在4000-12000r/min下离心15-30min；优选地，所述离心在4500r/min下离心20min。
根据本发明的一个方面，所述离心的离心半径为9-12cm。
根据本发明的一个方面，所述发酵菌为乳酸菌。优选地，所述发酵菌为植物乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌；进一步优选的，所述植物乳杆菌和嗜热链球菌的比例关系为2：3。
根据本发明的一个方面，所述发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：
菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；
菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；和
菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度105-108CFU/ml；优选地，所述培养基为MRS培养基。
按照上述方法制得的葡萄发酵原浆，所述葡萄发酵原浆中含有蛋白质 0.8-1.6mg/ml、粗多糖6-14mg/ml、总黄酮0.1-0.6mg/ml、总酚0.1-0.5mg/ml。
作为优选方案，所述葡萄发酵原浆的pH值为4.5-6.8。
一种护肤用产品，包括上述的葡萄发酵原浆。
根据上述的葡萄发酵原浆作为护肤化妆水的应用。
本发明提供的葡萄发酵原浆可作为护肤品中的有效成分，也可单独作为护肤品应用，具有抗氧化功能和美白的功能。
本发明提供的利用葡萄发酵原浆的制备方法，具有以下优点：
(1)本发明采用两种乳酸菌对葡萄进行发酵，保留了葡萄的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。
(2)本发明所采用的发酵法，在对葡萄有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性。
(3)本发明方法中发酵完成后，发酵原浆中不添加香精等对化学成分，确保产品对人体的安全性。
(4)本发明提供的葡萄发酵原浆中富含具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性物质，从而对皮肤具有较强的美白功能，同时与发酵滤液中的成分具有协同作用。
附图说明
图1为本发明具体实施例中葡萄发酵原浆对DPPH自由基清除作用曲线；
图2为本发明具体实施例中葡萄发酵原浆对酪氨酸酶活性和熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率柱型图；
图3为本发明具体实施例中葡萄发酵原浆减少经皮水分蒸发TEWL的图表。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同结构。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本发明提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所用发酵菌为植物乳杆菌和嗜热链球菌按比例关系为2：3的混合菌。
发酵菌事先进行预处理，所述预处理工艺包括：
菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；
菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；和
菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其 OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度105-108CFU/ml；优选地，所述培养基为MRS培养基。
菌种活化和菌种纯化是本领域技术人员的常规技术。
实施例1：
将扩培培养基里的发酵菌浓度为105-108CFU/ml的发酵菌菌液10mL接种到100g的葡萄果浆和1000mL的水中，并且在40℃培养箱中进行培养12小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在4500r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，收集上清液，即为本发明提供的葡萄发酵原浆化妆品。
该实施例制备所得的葡萄发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。 pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。
对该葡萄发酵原浆化妆品进行成分分析：本发明制得的葡萄发酵原浆化妆品含蛋白质 0.8-1.6mg/ml、粗多糖6-14mg/ml、总黄酮0.1-0.6mg/ml、总酚0.1-0.5mg/ml。
葡萄发酵原浆的抗氧化功效分析：
阳性对照用95％乙醇溶解稀释成：0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL、0.01mg/mL系列浓度梯度用以验证试验系统。
受试物处理：水溶性受试物用水稀释为多级浓度样品，油溶性受试物用95％乙醇稀释为多级浓度样品。
参考表1，使用10mL，试管设立样品管(T)、样品本底(T0)、DPPH管(C)和溶剂本底(C0),每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管。
在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入1mL相同浓度的样品溶液。
在所有试管中(T、T0、C、C0)补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性样品用95％乙醇，补足3mL，混匀。
在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL,样品本底(T0)和溶剂本底(C0)用95％乙醇代替，轻轻摇匀，室温下静置5分钟。
将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。
表1：样品加液要求
Figure BDA0002525659710000051
萄发酵原浆对DPPH自由基清除作用曲线，见附图1。图1中，横坐标为葡萄发酵原浆的质量浓度，纵坐标为DPPH自由基清除率。
由图1可知，葡萄发酵原浆对DPPH自由基的清除作用明显。随葡萄发酵原浆浓度升高，其对DPPH自由基的清除能力不断增强。30％浓度的葡萄发酵原浆可清除37％左右的DPPH 自由基，IC50为40.004％。
葡萄发酵原浆的美白功效分析：
酪氨酸酶是黑素生成的关键酶,它控制着黑素的形成过程,其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用, 故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。
通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：
按表2配置溶液：
表2、溶液配制列表
单位(mL) <![CDATA[C<sub>1</sub>]]> <![CDATA[C<sub>2</sub>]]> <![CDATA[T<sub>1</sub>]]> <![CDATA[T<sub>2</sub>]]>
L-酪氨酸 2 2 2 2
样品 0 0 2 2
PBS 4 5 2 3
酪氨酸酶 1 0 1 0
总体积 7 7 7 7 
注：C1和T1加入1mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL。
实验方法：
(1)C2管配好摇匀后，在40℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。
(2)C1管溶液配好摇匀，40℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定C1吸光度值。
(3)按(1)(2)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。
(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)，T(％)＝(C1-T1)/C1×100％。
如图2所示，1％熊果苷为酪氨酸酶活性抑制实验的阳性对照，其对酪氨酸酶活性抑制率为75％。25％葡萄原浆可抑制28.2％的酪氨酸酶活性，因此葡萄原浆具有抑制酪氨酸酶活性的作用。具有一定的美白功效。
葡萄发酵原浆的保湿功能分析：
产品涂抹区和空白对照区应随机分布于左右手臂标定区域，确保所有产品和空白区域位置在统计学上达到平衡。
测试样品按(2.0±0.1)mg/cm2的用量进行单次涂布，使用乳胶指套将试样均匀涂抹于试验区内，并记录实际涂样量。
按电容法皮肤水分测定仪使用说明书调整仪器后，进行产品区域和对照区域的测量，每个区域平行测定至少3次。先测量各测试区域的初始值(样品使用前)，然后在设定时间后测定受试区域和对照区域的皮肤TEWL值。设定时间应大于1h，可根据产品评价需要设定2h、3h等多个测定点，通过不超过24h。
同一个受试者的测试必须使用同一个仪器由同一个测量人员完成。
产品使用期间如志愿者皮肤出现不良反应，应立即终止测试，对不良反应应予以记录。
结果计算：
对样品涂抹侧和对照侧的TEWL平均值进行描述性统计，包括数量、均值、标准差、最小值、中位值和最大值等。
分别计算样品涂抹侧和对照侧TEWL平均值的变化率，见公式(1)，然后利用此变化率，统计分析不同测量时间点样品涂抹区域和对照区域的差别。
Figure BDA0002525659710000071
式中：
T0(TEWL值)一单臂TEWL初始值；
Tn(TEWL值)一不同测量时间点的单臂TEWL值。
结果判断：
阳性结果：与对照侧相比，样品涂抹侧TEWL值得变化率呈显著性差异，表示被测样品对皮肤的经表皮水分流失的恢复有促进效果。
阴性对照：与对照侧相比，样品涂抹侧TEWL值得变化率无呈显著性差异，表示被测样品对皮肤的经表皮水分流失的恢复无促进效果。
由图3可知：使用葡萄原浆与未涂抹的空白对照区域相比，葡萄原浆可降低皮肤经表皮水分流失，持久保湿。受试者使用葡萄原浆8h后，经表皮水分流失量始终低于未涂抹的空白对照区域。
葡萄发酵原浆的安全性评价
斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对葡萄发酵原浆化妆品进行人体封闭式斑贴试验，对其潜在皮肤刺激性进行评估。
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。称取0.020g-0.025g将固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续12h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。
12h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后12h和48h分别再观察一次。
斑贴试验结果如表3：
表3、斑贴试验结果
Figure BDA0002525659710000081
Figure BDA0002525659710000091
*"-"＝阴性反应；
"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；
"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；
"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；
"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。
由表3可知，实施例1提供的葡萄发酵原浆在试验中均产生2级反应的不超过1例。经判定，葡萄发酵原浆具有安全性，不会给人体带来不良反应。
实施例2：
将扩培培养基里的发酵菌浓度为105-108CFU/ml的发酵菌菌液40mL接种到100g的葡萄果浆和1500mL的水中，并且在30℃培养箱中进行培养30小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在4000r/min、离心半径为12cm的条件下离心30min，收集上清液，即为本发明提供的葡萄发酵原浆化妆品。
该实施例制备所得的葡萄发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。 pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。
实施例3：
将扩培培养基里的发酵菌浓度为105-108CFU/ml的发酵菌菌液20mL接种到400g的葡萄果浆和800mL的水中，并且在45℃培养箱中进行培8小时后，将所得发酵液进行121℃高压灭菌，15min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在12000r/min、离心半径为 10cm的条件下离心15min，收集上清液，即为本发明提供的葡萄发酵原浆化妆品。
该实施例制备所得的葡萄发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为无色透明至棕色。pH值4.5-6.8，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。
实施例2和3的成分分析方法和结果同实施例1，抗氧化效果分析、美白效果分析、保湿效果分析及安全评价分析的分析方法同实施例1，其结果基本同实施例1，在此不做重复描述。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.葡萄发酵原浆在制备具有抗氧化、美白和保湿功能的护肤化妆水的应用；所述葡萄发酵原浆的制备方法如下：将葡萄果浆、水与发酵菌液混合得到初始体系，再经发酵得到发酵液，所得发酵液经灭菌使菌失活、离心得到上清液，即为葡萄发酵原浆；所述葡萄果浆为整颗葡萄果实直接打浆而成；所述发酵菌为植物乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌，所述植物乳杆菌和嗜热链球菌的比例关系为2：3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述葡萄果浆：水的比例为（20-50）g:（100-300）mL。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述葡萄果浆：水的比例为20g:200 mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵菌液的浓度为105-108CFU/ml。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵菌液与所述葡萄果浆的比例关系为（10-40）ml：（100-200）g。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵菌液与所述葡萄果浆的比例关系为10ml：100g。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵温度为30-45℃。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵温度为40℃。
9.根据权利要求1或7所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵时间为8-30h。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述发酵的发酵时间为12h。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述离心在4000-12000r/min下离心15-30min。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述离心在 4500r/min下离心20min。
13.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于：所述离心的离心半径为9-12cm。
14.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述发酵菌液事先进行预处理，所述预处理工艺包括：
菌种活化：将发酵菌菌落放入液体培养基中，再将培养基放入培养箱中将菌种活化；
菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落；和
菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30-45℃的培养箱中培养，至其OD值=0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度105-108CFU/ml。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述培养基为MRS培养基。
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