CN110638697A

CN110638697A - 一种赤芝乳酸菌发酵提取物的制备及应用

Info

Publication number: CN110638697A
Application number: CN201911060746.0A
Authority: CN
Inventors: 芦艳荣; 方祥铭; 王昌涛
Original assignee: Shanghai Shanjiao Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Shanjiao Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2039-11-01
Also published as: CN110638697B

Abstract

本发明公开了一种赤芝乳酸菌发酵提取物的制备方法，其包括如下步骤：将乳酸菌活化后制得的乳酸菌菌液接种在含有灭活赤芝发酵液和水的培养基中，混合得到初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到赤芝乳酸菌发酵提取物。该方法利用发酵工程技术从赤芝和乳酸菌发酵并提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何香精、乳化剂、增稠剂、防腐剂等化学添加剂，提取物可直接作为化妆品使用，制得的赤芝乳酸菌发酵提取物对皮肤安全无伤害，具有更高的抗衰老、抗炎活性，同时具有良好的补水保湿效果。

Description

一种赤芝乳酸菌发酵提取物的制备及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种赤芝乳酸菌发酵提取物的制备及应用。

背景技术

赤芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属药用真菌，是传统中药材灵芝的主要来源之一，具有益气血、安心神、健脾胃的功效，主治虚劳心悸、失眠、头晕、神疲乏力、久咳气喘、冠心病、肿瘤等疾病。

乳酸菌是能发酵利用糖类而产生大量乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，广泛分布于人体、动物体、植物及发酵食品中。众所周知，乳酸菌是一种应用广泛的益生菌。FAO和WHO认定，益生菌是当剂量充足时对机体有益的和能促进机体健康的活微生物。乳酸菌作为益生菌中的一类重要成员，引起人们的关注和研究。现在益生菌已被广泛应用于各种领域，包括促进和维护人体健康、促进农业动物的生长等方面。益生菌包括双歧杆菌属、乳酸杆菌属、链球菌属等，其中的部分菌种已经被列为可用于食品的菌种。

本发明根据以上两种微生物所具有的优异功效，将赤芝与乳酸菌进行复合发酵。通过复合发酵的协同作用，发酵获得的产物具有小分子多肽产物。这种小分子多肽更易被皮肤吸收，具有良好的抗衰老、美白以及保湿补水功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种赤芝乳酸菌发酵提取物的制备方法与应用。该方法利用发酵工程技术从赤芝和乳酸菌发酵并提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何香精、乳化剂、增稠剂、防腐剂等化学添加剂，提取物可直接作为化妆品使用，制备得到的赤芝乳酸菌发酵提取物对皮肤安全无伤害，具有更高的抗衰老、抗炎活性，同时具有良好的补水保湿效果。

根据本发明的第一方面，提供了一种赤芝乳酸菌发酵提取物的制备方法，其包括如下步骤：将乳酸菌活化后制得的乳酸菌菌液接种在含有灭活赤芝发酵液和水的培养基中，混合得到初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到赤芝乳酸菌发酵提取物。

根据本发明的第二方面，提供了一种由上述制备方法制备得到的赤芝乳酸菌发酵提取物。

根据本发明的第三方面，提供了上述的赤芝乳酸菌发酵提取物在制备具有下述1)-7)中至少一种功能的化妆品中的应用：

1)抑制黑色素生成；

2)皮肤美白；

3)清除DPPH自由基；

4)促进胶原蛋白合成；

5)抗衰老；

6)增加皮肤含水量；以及

7)保湿。

根据本发明的第四方面，提供了上述的赤芝乳酸菌发酵提取物在直接作为具有下述1)-7)中至少一种功能的化妆品中的应用：

1)抑制黑色素生成；

2)皮肤美白；

3)清除DPPH自由基；

4)促进胶原蛋白合成；

5)抗衰老；

6)增加皮肤含水量；以及

7)保湿。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的制备方法采用发酵工程技术，通过选择合适的菌种及发酵条件，提取得到赤芝乳酸菌发酵提取物。一方面可最大程度保留活性成分，且相对于传统的提取法，避免了有机溶剂的引入，安全环保；另一方面，不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化地简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。

(2)本发明提供的赤芝乳酸菌发酵提取物含有健康皮肤不可或缺的小分子多肽成分，且由于在制备过程中未引入外来物质，不含任何合成化学成分，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何副作用。

(3)本发明提供的赤芝乳酸菌发酵提取物中小分子多肽的分子量为275.40Da，且占总量的99％以上，易于让皮肤充分吸收。

(4)本发明提供的赤芝乳酸菌发酵提取物，具有较强的抗氧化能力，可清除自由基、促进细胞代谢、增强细胞活力、促进胶原蛋白合成，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，具有抗衰老的功效。

(5)本发明提供的赤芝乳酸菌发酵提取物，可抑制黑色素合成，5％浓度下对黑色素合成的抑制效果优于33mM熊果苷的效果，具有良好的美白功效。

(6)本发明提供的赤芝乳酸菌发酵提取物能够显著提高皮肤含水量，具有优异的保湿作用。

附图说明

下文将仅以举例的方式并参照附图描述本发明的实施方案，其中：

图1为根据本发明一实施方案制备的赤芝乳酸菌发酵提取物的活性多肽分子量分布HPLC图谱。

图2为不同体积百分浓度的根据本发明一实施方案制备的赤芝乳酸菌发酵提取物与DPPH自由基清除率的关系曲线。

图3示出了根据本发明一实施方案制备的赤芝乳酸菌发酵提取物对成纤维细胞合成胶原蛋白的影响。

图4示出了根据本发明一实施方案制备的赤芝乳酸菌发酵提取物对B16细胞合成黑色素的影响。

具体实施方式

在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其它方法、部件、材料等的情况下可实现实施方案。

在某些具体的实施方案中，初始体系中，乳酸菌菌液、灭活赤芝发酵液和水的体积比为(5-15)：(50-150)：(200-400)。在某些优选的实施方案中，初始体系中，乳酸菌菌液、灭活赤芝发酵液和水的体积比为(8-12)：(80-120)：(250-350)。在某些更优选的实施方案中，初始体系中，乳酸菌菌液、灭活赤芝发酵液和水的体积比为10：100：300。

在某些具体的实施方案中，乳酸菌菌液的浓度为10⁴至10¹⁰CFU/mL。在某些优选的实施方案中，乳酸菌菌液的浓度为10⁵至10⁹CFU/mL。在某些更优选的实施方案中，乳酸菌菌液的浓度为10⁶至10⁸CFU/mL。

在某些具体的实施方案中，发酵培养的温度为35至40℃。在某些优选的实施方案中，发酵培养的温度为38℃。

在某些具体的实施方案中，发酵培养的时间为30至38h。在某些优选的实施方案中，发酵培养的时间为32h。

在某些具体的实施方案中，乳酸菌为乳杆菌。在某些优选的实施方案中，乳酸菌为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

在某些具体的实施方案中，灭活赤芝发酵液的制备包括挑取赤芝菌丝接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，于20至30℃震荡培养30至60h；用匀浆器将菌球磨碎后，将菌液于100至130℃灭活10至20min。在某些优选的实施方案中，灭活赤芝发酵液的制备包括挑取赤芝菌丝接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，于22至28℃震荡培养44至52h；用匀浆器将菌球磨碎后，将菌液于110至120℃灭活13至17min。在某些更优选的实施方案中，灭活赤芝发酵液的制备包括挑取赤芝菌丝接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，于25℃震荡培养48h；用匀浆器将菌球磨碎后，将菌液于115℃灭活15min。

在某些具体的实施方案中，乳酸菌菌液可以培养液或悬浮液的形式存在，所述培养液或悬浮液的pH值为6.0至8.0。在某些优选的实施方案中，培养液或悬浮液的pH值为7.0。

在某些具体的实施方案中，上述制备方法还包括在发酵培养之后对赤芝乳酸菌发酵提取物依次进行灭菌、离心和取上清液的步骤。

在某些具体的实施方案中，灭菌温度为115至125℃，灭菌时间为20至30min。在某些优选的实施方案中，灭菌温度为120℃，灭菌时间为25min。

在某些具体的实施方案中，离心转速为3800至4200r/min，离心时间为15至30min，离心半径为8至10cm。在某些优选的实施方案中，离心转速为4000r/min，离心时间为20min，离心半径为9cm。

1)抑制黑色素生成；

2)皮肤美白；

3)清除DPPH自由基；

4)促进胶原蛋白合成；

5)抗衰老；

6)增加皮肤含水量；以及

7)保湿。

1)抑制黑色素生成；

2)皮肤美白；

3)清除DPPH自由基；

4)促进胶原蛋白合成；

5)抗衰老；

6)增加皮肤含水量；以及

7)保湿。

在某些具体的实施方案中，上述的应用中，化妆品包括但不限于：面膜、精华液或爽肤水。

下文中，本发明将通过如下实施例进行详细解释以便更好地理解本发明的各个方面及其优点。然而，应当理解，以下的实施例是非限制性的而且仅用于说明本发明的某些实施方案。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的赤芝活化培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为马铃薯提取液，溶质及其在液体培养基中的浓度为葡萄糖20g/L。

下述实施例中的乳酸菌活化液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：酪蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，Tween 801g/L，K₂HPO₄2 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，MnSO₄.H₂O 0.05g/L，CaCO₃20g/L，琼脂15g/L,pH 6.8。

下述实施例中的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

下述实施例中的赤芝来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

实施例1灭活赤芝发酵液的制备

挑取赤芝菌丝接种到300mL马铃薯葡萄糖液体培养基中，于25℃震荡培养48h。用匀浆器将菌球磨碎后，将菌液于115℃灭活15min。获得灭活赤芝发酵液。

实施例2罗伊氏乳杆菌菌液的制备

1、菌种的活化

挑取罗伊氏乳杆菌菌落一环于液体培养基(250mL)中，放入摇床中将菌种活化，得到活化罗伊氏乳杆菌菌液。

2、菌种的纯化

将步骤1得到的活化罗伊氏乳杆菌菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化罗伊氏乳杆菌菌种。

3、菌种的扩大培养

将步骤2得到的纯化罗伊氏乳杆菌菌种接种到乳酸菌培养基(300mL，pH值为7.0)中，在37℃的摇床中培养，当OD值＝0.6-1.0时，得到罗伊氏乳杆菌菌液，此时菌种处在对数期，浓度为10⁶至10⁸CFU/mL。

实施例3、赤芝乳酸菌发酵提取物的制备

按照如下步骤制备赤芝乳酸菌发酵提取物：

(1)将10mL实施例2步骤3得到的浓度为10⁶至10⁸CFU/mL的罗伊氏乳杆菌菌液接种到100mL实施例1制备的灭活赤芝发酵液和300mL去离子水中，得到发酵体系；

(2)将上述发酵体系在38℃摇床中发酵32小时，得到发酵产物；

(3)将上述发酵产物在120℃下灭菌25min，使罗伊氏乳杆菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在4000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即为赤芝乳酸菌发酵提取物。

实施例4、赤芝乳酸菌发酵提取物的表征

实施例3所制备的发酵提取物原浆经活性炭脱色、去味后呈淡黄色至棕黄色粘稠液体。pH值5.8-6.5，粘度300-400cP，可溶性固含物含量1.8-4.7％，菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵提取物原浆符合化妆品质量要求。

对该赤芝乳酸菌发酵提取物进行成分分析，其中蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010，粗多糖检测方法参照GB/T 5009.8-2008，黄酮检测方法参照GB/T 5009.124-2003，总酚检测方法参照GB/T 8313-2008。所得结果如下：

所制得的赤芝乳酸菌发酵提取物含蛋白质9.24g/kg、粗多糖34.17g/kg、总黄酮0.134g/kg(以芦丁计)、总酚0.115g/kg。

实施例5、赤芝乳酸菌发酵提取物的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。对实施例3中获得的赤芝乳酸菌发酵提取物进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象

随机选择年龄范围在18-60岁的志愿者30人。

2、试验方法

称取0.020g至0.025g固体样品或半固体样品放入斑试器中备用。将液体样品0.020mL至0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。

试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。

3、试验结果

斑贴试验结果如表1所示，表1中各符号表示的含义如下：

"-"＝阴性反应；

"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；

"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；

"++"＝强阳性反应(疱疹反应)：红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，反应可超出受试区；

"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)：明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，反应超出受试区。

表1、实施例3获得的赤芝乳酸菌发酵提取物的斑贴试验结果

从表1中可以看出，实施例3得到的赤芝乳酸菌发酵提取物未产生可疑反应，说明本发明提供的赤芝乳酸菌发酵提取物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。

实施例6、赤芝乳酸菌发酵提取物的多肽分子量大小检测

分子量大小是检验能否进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(HPLC)测定实施例3制备的赤芝乳酸菌发酵提取物中多肽的分子量大小。具体步骤如下：

1、试验的试剂和溶液的制备

(1)流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝30：70：0.1(v/v/v)；

(2)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/mL的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后进样；

(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(Mw 67000)、维生素B₁₂(Mw 1335)、氧化型谷胱甘肽(Mw 614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/mL。

2、试验方法

将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(Mw 67000)、维生素B₁₂(Mw 1335)和氧化型谷胱甘肽(Mw 614)通过高效液相色谱仪(Waters公司)参照文献“王成忠等.蛋白酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肽分子量分布的研究.粮食加工，2012:37(2)”中的方法进行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例3中制备的赤芝乳酸菌发酵提取物进行HPLC分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例3制备的赤芝乳酸菌发酵提取物的多肽分子量大小。

色谱条件：色谱柱：TsK gel 2000 SWXL 300mm×7.8mm；检测波长：UV 280nm；流速：1mL/min；柱温：30℃。

3、试验结果

标准物质的分子量与洗脱时间如表2所示，根据分子量的对数和洗脱时间作图，得到标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，R²＝0.9998。其中y为洗脱时间(min)；x为分子量对数。

表2、标准物质的分子量与洗脱时间

实施例3制备的赤芝乳酸菌发酵提取物的HPLC图谱如图1所示。从图1可以看出，赤芝乳酸菌发酵提取物的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为11.62min。将洗脱时间代入标准曲线y＝-2.4738x+17.656，计算出多肽峰的分子量为275.40Da，并且根据峰面积计算出赤芝乳酸菌发酵提取物中多肽占99.61％。一般认为分子量小于500Da左右的活性肽成分更易被皮肤吸收，所以赤芝乳酸菌发酵提取物中存在容易被吸收的活性多肽。

实施例7、赤芝乳酸菌发酵提取物的抗氧化性能检测

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力。它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰。当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

取不同量的实施例3制备得到的赤芝乳酸菌发酵提取物溶于去离子水中，制得体积百分浓度为0.31％、0.63％、1.25％、2.5％、5％的一系列赤芝乳酸菌发酵提取物待测液。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

(1)取等体积(一般为3mL)的待测液与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A₁管)；

(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A₂管)；

(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(A₃管)；

(4)反应30min后，在517nm下测A₁、A₂、A₃管吸光度值。

清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A₂+A₃)-A₁]/A₂ (1)

以赤芝乳酸菌发酵提取物待测液的体积百分浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作赤芝乳酸菌发酵提取物对DPPH自由基清除作用曲线，结果见图2。

由图2可知，实施例3所得赤芝乳酸菌发酵提取物在5％的浓度下可清除98.34％的DPPH自由基，其对DPPH清除作用的IC₅₀＝5.65％，说明赤芝乳酸菌发酵提取物具有较强的抗氧化能力，可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。

实施例8、赤芝乳酸菌发酵提取物对胶原蛋白Ⅰ合成影响检测

取实施例3制备的赤芝乳酸菌发酵提取物，稀释为适当浓度的样品，作用于成纤维细胞24h后，使用无菌管收集细胞培养液，在2000-3000rpm下离心20min，保存上清液。采用南京建成生产的人Ⅰ型胶原(COLⅠ)酶联免疫检测试剂盒进行检测。实施例3所制备的赤芝乳酸菌发酵提取物不同浓度下对胶原蛋白I相对表达量影响的结果如图3所示(阳性对照为抗坏血酸葡萄糖苷，浓度为86μg/ml)。

从图3可见，2.5至5％浓度赤芝乳酸菌发酵提取物均对胶原蛋白合成有促进作用，5％浓度赤芝乳酸菌发酵提取物作用下胶原蛋白合成为空白对照的131％。

实施例9、赤芝乳酸菌发酵提取物的美白功效分析：黑色素合成抑制实验

取对数生长期状态良好的B16细胞计数并接种于T25培养瓶中，置于培养箱37℃、5％CO₂环境中培养过夜。更换培养基，分别加入实施例3赤芝乳酸菌发酵提取物稀释得到的不同浓度的样品，并以33mM熊果苷为阴性对照组，未作处理的空白样为空白对照组。培养48小时后，吸弃培养基，使用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤后加入裂解液。刮取细胞并收集于离心管中，80℃水浴30min。振荡混匀，吸取至96孔板于475nm读取吸光度值。黑色素含量变化＝(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)。

图4为实施例3所制备的赤芝乳酸菌发酵提取物不同浓度下对B16细胞内黑色素含量影响的结果示意图。结果表明，5％赤芝乳酸菌发酵提取物作用下相对黑色素含量为69.31％，33mM熊果苷作用下相对黑色素含量为75.3％，即5％赤芝乳酸菌发酵提取物的美白效果优于33mM熊果苷的效果，具有较强的美白功效。

实施例10、赤芝乳酸菌发酵提取物保湿功效测试

将实施例3制备的赤芝乳酸菌发酵提取物作为面膜或精华液或爽肤水等化妆品直接对皮肤进行涂抹，并通过皮肤含水量测试试验对其保湿性能进行检测，具体步骤如下：

1、试验对象

随机选取24名健康的志愿受试者，所有受试者均无任何皮肤和系统性疾患史，且受试部位(前臂内侧)的皮肤无异常，也不涂抹任何外用药物和化妆品等其他外用制剂。

2、试验方法

将测试物(实施例3获得的赤芝乳酸菌发酵提取物)对受试者的前臂内侧的皮肤进行涂抹(涂抹的量为0.08-0.1mL)，并以未涂抹任何样品的皮肤作为对照组(BL)。

在涂抹0.5、1、2、4h后使用Corneometer CM-825测量受试部位的皮肤含水量，测量结果通过设定的湿度测量值(Moisture Measurement Value，MMV)来表示，MMV为0至150的数值。整个研究在室内温度为22℃至24℃、湿度为50％至60％的良好皮肤非创伤性检查实验室内进行。

3、试验结果

表3为涂抹实施例3制备的赤芝乳酸菌发酵提取物后皮肤含水量测试结果。

从表3可以看出，和对照组(BL)相比，受试者在涂抹实施例3制备的赤芝乳酸菌发酵提取物0.5、1、2、4h后(分别记为T0.5、T1、T2、T4)，皮肤含水量均显著提高，且在涂抹4小时后仍有很高的保湿功能。说明本发明的赤芝乳酸菌发酵提取物具有很好的保湿功能，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水等化妆品用于提高皮肤的含水量。

表3皮肤含水量

时间点	BL	T0.5	T1	T2	T4
						平均值	26.214	56.214	50.626	48.155	42.218
％改变vs BL		114.442％	93.125％	83.699％	61.051％
						p值vs BL		0.000	0.000	0.000	0.000

表3中“％改变vs BL”表示含水量与对照组相比增加的比例，“p值vs BL”表示显著性。

从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本申请的具体实施方案，但是在不偏离本申请的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进。这些变形或修改都应落入本申请所附权利要求的范围。

Claims

1.一种赤芝乳酸菌发酵提取物的制备方法，其包括如下步骤：将乳酸菌活化后制得的乳酸菌菌液接种在含有灭活赤芝发酵液和水的培养基中，混合得到初始体系，并对所述初始体系进行发酵培养，得到所述赤芝乳酸菌发酵提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中在所述初始体系中，所述乳酸菌菌液、所述灭活赤芝发酵液和水的体积比为(5-15)：(50-150)：(200-400)，优选(8-12)：(80-120)：(250-350)，更优选10：100：300。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述乳酸菌菌液的浓度为10⁴至10¹⁰CFU/mL，优选10⁵至10⁹CFU/mL，更优选10⁶至10⁸CFU/mL。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其中所述发酵培养的温度为35至40℃，优选38℃，所述发酵培养的时间为30至38h，优选32h。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其中所述乳酸菌为乳杆菌，优选罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法，其中所述灭活赤芝发酵液的制备包括挑取赤芝菌丝接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，于20至30℃、优选22至28℃、更优选25℃震荡培养30至60h、优选44至52h、更优选48h；用匀浆器将菌球磨碎后，将菌液于100至130℃、优选110至120℃、更优选115℃灭活10至20min、优选13至17min、更优选15min。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其中所述乳酸菌菌液可以培养液或悬浮液的形式存在，所述培养液或悬浮液的pH值为6.0至8.0，优选7.0。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的制备方法，其还包括在所述发酵培养之后对所述赤芝乳酸菌发酵提取物依次进行灭菌、离心和取上清液的步骤。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其中灭菌温度为115至125℃、优选120℃，灭菌时间为20至30min，优选25min；离心转速为3800至4200r/min、优选4000r/min，离心时间为15至30min、优选20min，离心半径为8至10cm、优选9cm。

10.一种赤芝乳酸菌发酵提取物，其根据权利要求1至9中任一项所述的制备方法制备得到。