CN113576977A - 一种黄豆发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄豆发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。黄豆发酵物的制备方法包括如下步骤：将发酵菌种接种到发酵底物中，经发酵培养、灭菌，即可；其中，发酵底物为黄豆和水；发酵菌种为乳酸菌和/或酵母菌。本发明制得的黄豆发酵物具有良好的抗氧化功效和紧致肌肤功效，与发酵底物相比，显著降低了对人皮肤成纤维细胞的毒性，使用安全，对皮肤无刺激性，可被广泛应用于皮肤外用剂领域。

Description

一种黄豆发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种黄豆发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对化妆品的要求也越来越高。由于化妆品与皮肤长时间直接连续接触，质量和安全尤为重要。化妆品的原料可分为合成产物或是天然提取物。通过合成的方法制备化妆品原料不仅消耗不可再生资源，而且给环境带来大量的废弃物，造成污染。因此开发天然植物提取物作为化妆品功效添加剂已经成为当今时代的发展趋势。

黄豆以其绿色、天然、健康的特点备受化妆品开发者的青睐。黄豆中富含大豆磷脂、维生素E、异黄酮类化合物和大豆肽等多种可用于化妆品领域的活性物质。化妆品领域常用的活性物质提取方法有水提取法、有机溶剂提取、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法和微生物发酵法等。面对如此众多的提取方法，如何筛选出更利于化妆品领域活性物质提取的方法，仍是本领域研发人员面临的技术难题。

因此，本领域亟需开发一种适用于从黄豆中提取可用于化妆品领域的活性成分的提取方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中植物提取的工艺众多，难于筛选出便于从黄豆中提取可用于化妆品领域活性成分的方法等缺陷，提供一种黄豆发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。本发明制得的黄豆发酵物具有良好的抗氧化功效和紧致肌肤功效，与发酵底物相比，显著降低了对人皮肤成纤维细胞的毒性，使用安全，对皮肤无刺激性，可被广泛应用于皮肤外用剂领域。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

本发明提供一种黄豆发酵物的制备方法，具体包括如下步骤：将发酵菌种接种到发酵底物中，经发酵培养、灭菌，即可；其中，所述发酵底物为黄豆和水；所述发酵菌种为乳酸菌和/或酵母菌。

一些实施例中，所述黄豆在使用前还可进一步包括粉碎的操作。

一些实施例中，所述黄豆占所述发酵底物的质量百分数可为0.2％～3％，较佳地为0.5％～1％。

一些实施例中，所述水可为本领域常规使用的蒸馏水、矿泉水和自来水中的任意一种或多种，较佳地为蒸馏水。

一些实施例中，所述发酵底物在使用前还可进一步包括灭菌的操作。所述灭菌的条件和方法可为本领域常规。其中，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，一般可为100～130℃，较佳地为100～121℃。所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般可为10～30min，较佳地为15～30min。

一些实施例中，所述发酵菌种较佳地为所述乳酸菌或所述酵母菌，更佳地为所述乳酸菌。

一些实施例中，所述乳酸菌可为发酵领域常规使用的乳酸菌，较佳地为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp.Bulgaricus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)中的任意一种或多种，更佳地为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)。

其中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)可为购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.16075的德氏乳杆菌保加利亚亚种。

其中，所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)可为购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.15607的布氏乳杆菌。

其中，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)可为购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.5029的两歧双歧杆菌。

一些实施例中，所述酵母菌可为酿酒酵母菌。所述酿酒酵母菌可为酿酒酵母(Sacharomyces)菌株YWY-1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏日期为2019年03月27日，保藏编号为CGMCC No.17452。

一较佳实施方案中，当所述发酵菌种为所述乳酸菌和所述酵母菌的混合菌种时，所述黄豆发酵物的制备方法包括如下步骤：(1)将所述酵母菌接种到所述发酵底物中，经发酵培养、灭菌，制得物料A；(2)将所述乳酸菌接种到所述物料A中，经发酵培养、灭菌，即可。

一些实施例中，当接种所述乳酸菌时，所述乳酸菌可按照本领域常规以乳酸菌菌液的形式添加，所述乳酸菌菌液中所述乳酸菌的浓度可为10⁴～10¹⁰CFU/mL，较佳地为10⁶～10⁹CFU/mL。

其中，所述乳酸菌菌液与所述发酵底物的体积比可为(5～20)：100，较佳地为(8～10)：100。

一些实施例中，当接种所述乳酸菌时，所述发酵培养的条件和方法可为本领域常规，一般可为静置培养。

一些实施例中，当接种所述乳酸菌时，所述发酵培养的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为6～16h，更佳地为8～16h。

一些实施例中，当接种所述乳酸菌时，所述发酵培养的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为37～45℃。

一些实施例中，当接种所述酵母菌时，所述酵母菌可按照本领域常规以酵母菌菌液的形式添加，所述酵母菌菌液中所述酵母菌的浓度可为10⁵～10⁸CFU/mL。

其中，所述酵母菌菌液与所述发酵底物的体积比可为(1～25)：100，较佳地为(10～25)：100。

一些实施例中，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养的条件和方法可为本领域常规，一般可在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速可为100～180rpm，较佳地为150～180rpm。

一些实施例中，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为30～50h，更佳地为30～48h。

一些实施例中，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为20～28℃。

一些实施例中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规。其中，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，一般可为100～130℃，较佳地为100～121℃。所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般可为10～30min，较佳地为15～30min。

一些实施例中，所述灭菌的操作前还可进一步包括离心，收集上清液的操作。

其中，所述离心的转速可为本领域该类操作常规的转速，一般可为4500～6000rpm，较佳地为5500～6000rpm。

其中，所述离心的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般可为20～60min，较佳地为20～30min。

一些实施例中，所述灭菌的操作后，还可进一步包括与防腐剂混合的操作。按照本领域常规，当所述发酵菌种为所述乳酸菌和所述酵母菌的混合菌种时，与所述防腐剂混合的操作在最后一次所述灭菌的操作后进行。

其中，所述混合的温度可为本领域常规，较佳地为35～60℃，更佳地为45℃。

其中，所述防腐剂的种类可为本领域常规，较佳地包括乙二醇和/或戊二醇，更佳地包括乙二醇和戊二醇。当所述防腐剂包括乙二醇和戊二醇时，乙二醇与戊二醇的重量份数比可为(1.8～3)：(0.2～0.8)，较佳地为2.8：0.5。

其中，所述防腐剂占所述灭菌后制得物料的质量百分比可为本领域常规，一般可为1.5％～3％。

本发明还提供一种黄豆发酵物，其由如上所述的黄豆发酵物的制备方法制得。

本发明还提供一种如上所述的黄豆发酵物作为产品、产品添加剂或产品基底在制备皮肤外用剂的应用。

一些实施例中，所述黄豆发酵物可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或紧致肌肤活性成分。

本发明还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的黄豆发酵物。

一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括面膜、精华或爽肤水。

一些实施例中，所述皮肤外用剂中所述黄豆发酵物的质量百分比可为2％～100％，较佳地为20％～100％。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明以黄豆和水为发酵底物，发酵底物简单易得，成本低；制得的黄豆发酵物具有良好的抗氧化功效和紧致肌肤功效，与发酵底物相比，显著降低了对人皮肤成纤维细胞的毒副作用，安全性佳，对皮肤无刺激性，且制备工艺简单，可被广泛应用于皮肤外用剂领域。

附图说明

本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：

图1为牛血清白蛋白、维生素B12和氧化型谷胱甘肽三种标准品的HPLC图谱；

图2为牛血清白蛋白、维生素B12和氧化型谷胱甘肽三种标准品的相对分子质量对数与HPLC保留时间的关系曲线；

图3为实施例1制得黄豆发酵物的HPLC图谱；

图4为实施例2制得黄豆发酵物的HPLC图谱；

图5为实施例3制得黄豆发酵底物的HPLC图谱；

图6为对比例1制得黄豆发酵底物的HPLC图谱；

图7为对比例2制得黄豆发酵物的HPLC图谱；

图8为采用实施例1制得黄豆发酵物处理皮肤后，皮肤弹性R2值随时间变化图；

图9为采用实施例1制得黄豆发酵物处理皮肤后，皮肤弹性Q1值随时间变化图；

图10为采用实施例2制得黄豆发酵物处理皮肤后，皮肤弹性R2值随时间变化图；

图11为采用实施例2制得黄豆发酵物处理皮肤后，皮肤弹性Q1值随时间变化图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YWY-1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏日期为2019年03月27日，保藏编号为CGMCCNo.17452。

下述实施例中的乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbruechii subsp.Bulgaricus)，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.16075。

下述实施例中黄豆为品牌为十月稻田的黄豆。

下述对比例中针叶樱桃提取物购自西安优硕生物科技有限公司(水热浸提法制得)。

1、下述实施例中YWY-1菌液的制备

(1)将YWY-1接种于葡萄糖马铃薯琼脂(PDA)培养基，28℃培养2天(目的为活化)；

(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL YPD培养基(组成为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％)，28℃、180rpm培养24h，得到YWY-1菌液，浓度大致为10⁸的CFU/mL。

2、下述实施例中乳酸菌菌液的制备

将保藏编号为CGMCC No.1.16075的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种于乳酸细菌培养基(MRS培养基)，在45℃恒温震荡培养箱中静置培养24h，得到用于接种的乳酸菌菌液，浓度约为10¹⁰CFU/mL。

3、下述实施例和对比例中黄豆发酵底物的制备

取适量粉碎的黄豆加入水中，在121℃条件下灭菌20min，得到黄豆发酵底物；黄豆发酵底物中，黄豆的质量百分数为1％。

实施例1

将30mL的YWY-1菌液接种到300mL黄豆发酵底物中，在温度为28℃，且搅拌的条件下发酵培养48小时，搅拌的转速为150rpm；制得的物料转移到离心机中，在转速为5500rpm的条件离心20min，收集上清液，上清液在121℃的条件下灭菌15min；灭菌后，降温，在45℃条件下添加占上清液质量2.8％的防腐剂混合液，防腐剂混合液中含有2.3份乙二醇和0.5份戊二醇，制得黄豆发酵物。

制得的黄豆发酵物的pH值为5.6，固形物含量为3.0％，固形物含量是指黄豆发酵物干燥后剩余固体的质量占黄豆发酵物质量的百分比。

实施例2

将30mL乳酸菌菌液接种到300mL黄豆发酵底物中，在温度为45℃条件下静置发酵培养8小时；发酵培养后制得的物料转移到离心机中，在转速为5500rpm的条件离心20min，收集上清液，上清液在121℃的条件下灭菌15min；灭菌后，降温，在45℃条件下添加占上清液质量2.8％的防腐剂混合液，防腐剂混合液中含有2.3份乙二醇、0.5份戊二醇，制得黄豆发酵物。

制得的黄豆发酵物的pH值为5.5，固形物含量为3.2％，固形物含量是指黄豆发酵物干燥后剩余固体的质量占黄豆发酵物质量的百分比。

实施例3

(1)将30mL的YWY-1菌液接种到300mL黄豆发酵底物中，在温度为28℃，且搅拌的条件下发酵培养48小时，搅拌的转速为150rpm；发酵培养后，在温度为121℃的条件下灭菌15min，制得物料A；

(2)将24mL乳酸菌菌液接种到步骤(1)制得的物料A中，在温度为45℃条件下发酵培养8小时；发酵培养后制得的物料转移到离心机中，在转速为5500rpm的条件离心20min，收集上清液，上清液在温度为121℃的条件下灭菌15min；灭菌后，降温，在45℃条件下添加占上清液质量2.8％的防腐剂混合液，防腐剂混合液中含有2.3份乙二醇、0.5份戊二醇，制得黄豆发酵物。

制得的黄豆发酵物的pH值为5.8，固形物含量为3.1％，固形物含量是指黄豆发酵物干燥后剩余固体的质量占黄豆发酵物质量的百分比。

对比例1

上述制得的黄豆发酵底物灭菌冷却至室温后转移到离心机中，在转速为5500rpm的条件离心20min，收集上清液，即可。

对比例2

与实施例1相比，区别仅在于发酵底物为复合发酵底物，其他条件参数同实施例1。复合发酵底物的制备包括如下步骤：取适量粉碎的黄豆和针叶樱桃提取物加入到水中，在121℃条件下灭菌20min，得到复合发酵底物；复合发酵底物中，黄豆的质量百分数为1％，针叶樱桃提取物的质量百分数为0.5％。

制得的黄豆发酵物的pH值为5.0，固形物含量为3.3％，固形物含量是指黄豆发酵物干燥后剩余固体的质量占黄豆发酵物质量的百分比。

效果实施例1

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1～3制得的产品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象：

严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择合适的志愿者30人，年龄范围在18～60岁随机选择。

2、实验方法

分别将0.02mL上述实施例1～3制得的产品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。样品均设置空白对照，即在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，接着于24h后观察皮肤的反应。体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表1。

表1皮肤不良反应分级标准

3、试验结果

结果见表2，从表中可以看出；实施例1～3得到的黄豆发酵物试敏结果都是阴性反应，说明实施例1～3制得的黄豆发酵物具有安全性，不会给人体皮肤带来不良反应。

表2

注：*代表该受试者对斑试器胶带过敏。

效果实施例2

对实施例1～3和对比例1～2制得产品进行成分分析和多肽分子量。其中，多肽含量检测方法和多糖含量检测方法参考文献“王倩，张佳婵，王昌涛，等；碳氮比对真菌发酵桑枝-黄豆的活性成分和抗氧化能力的影响[J].食品工业科技，2019，40(02)：93-99”；所得结果如表3所示：

表3

测试多肽分子量，方法如下：

1、色谱条件：

1)色谱柱：TsK gel 2000SWXL 300mm×7.8mm；

2)流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7)+0.3mol/L NaCl；

3)检测波长：UV 220nm；

4)流速：1mL/min；

5)柱温：25℃；

6)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/mL的样品，再用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样；

7)标准样品：将牛血清蛋白(Mr 67000)、B12(Mr 1335)、氧化型谷胱甘肽(Mr 614)配成混标，每种物质含量均为5mg/mL；

2、标准曲线的制定

将三种标准样品按5mg/mL配制，按照上述色谱条件制作标准曲线。图1为三种标准样品配成的混标的HPLC图谱，由于使用的柱子型号为TSKge12000SWXL(凝胶柱)，所以根据凝胶渗透层析原理，分子量大的物质先被洗脱下来，从图1中可以看到洗脱峰出现时所对应的洗脱时间分别为6.84min、10.12min和12.40min，根据三种标准样品的相对分子质量对数值(见表4)，随后制作三种标准样品的相对分子质量对数与标准样品洗脱时间的关系曲线(如图2)。

表4

采用最小二乘法，求出直线的回归方程为：y＝-0.4119x+7.0253，其回归系数R²＝0.9966。由方程的回归系数R²＝0.9966可知，混合标样的标准曲线线性关系较好，可以提高计算的精确程度。关系式中X代表洗脱时间，Y代表分子量对数。这样当样品进行HPLC分析时，即可通过洗脱图谱中每种物质洗脱峰的出现时间计算其对应的分子量。

采用上述色谱条件测试得到实施例1～3和对比例1～2制得产品的HPLC图谱，利用标准曲线计算得各产品的多肽分子量，结果见表5和图3～7；其中，图3为实施例1制得产品的洗脱图谱，图4为实施例2制得产品的洗脱图谱，图5为实施例3制得产品的洗脱图谱，图6为对比例1制得产品的洗脱图谱，图7为对比例2制得产品的洗脱图谱。

表5

从表5中结果可看出，当提取工艺不同时，对终产品中有效活性成分的种类和含量的影响较大。

效果实施例3体外抗氧化清除自由基性能测试(对DPPH自由基清除作用)

1、溶液配制：DPPH(2×10^-4mol/L)乙醇溶液的配置：称取20mg的DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，DPPH浓度配制为2×10^-4mol/L，0～4℃下避光保存；

2、实验操作：上述实施例1～3和对比例2制得的产品直接作为待测液，分别取3mL上述待测液与3mL DPPH溶液混匀，测波长为517nm下的吸光度(A₁)；取3mL蒸馏水与3mLDPPH溶液混匀,测波长为517nm下的吸光度(A₂)；取3mL蒸馏水与3mL待测液混匀，测波长为517nm下的吸光度(A₃)。清除率计算公式为：

清除率＝(A₂+A₃-A₁)/A₂×100％。

自由基清除率结果见表6。

3、实验结果

从表6可以看出，实施例1～2制得的产品的抗氧化能力强于对比例2制得的产品；实施例3制得的产品的抗氧化能力与对比例2接近。

表6抗氧化清除自由基测试结果

编号	自由基清除率
		实施例1	37.85％
实施例2	53.54％
		实施例3	17.72％
对比例2	17.72％

效果实施例4细胞MTT增殖实验

人皮肤成纤维细胞是组成皮肤真皮的主要结构成分，其可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用，是维持皮肤年轻态的决定性因素，也是维持皮肤结构稳定的重要组成部分。本实验采用的细胞为来自ScienCell公司的人皮肤成纤维细胞(HDF-n)。

1、实验步骤：

分别将上述实施例1～3和对比例1～2灭菌后未添加防腐剂的产品直接作为待测液。

人皮肤成纤维细胞培养于含10％胎牛血清以及1％双抗(1×10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素)的DMEM培养基中。细胞生长于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中，当细胞融合达到85％以上时，以0.05％胰酶消化传代，用含血清的DMEM终止消化反应。细胞计数板计数，将细胞悬液浓度调整到5×10⁴个/mL，将细胞悬液按照每孔100μL的比例接种到96孔板上，37℃、5％CO₂条件下孵育过夜。去除旧培养液，加入已过滤除菌的待测液，每样品做6个复孔，培养24h。培养结束后每孔加入MTT溶液(5mg/mL)和DMEM的混合溶液(v/v，1：5)100μL，孵育4h。去除培养基，每孔加入150μL的DMSO，37℃孵育10min后读取490nm下实验组的吸光度(记为A)。将无细胞处理组(细胞悬液用无血清的DMEM代替，其余步骤相同)设定为空白对照组，记为B。将细胞对照组(用无血清DMEM替代待测液，其余步骤相同)记为C。

细胞存活率的计算公式如下：

细胞存活率(％)＝(A-B)/(C-B)×100％；

实施例1～3与对比例1～2相比，细胞存活率的显著性统计结果见表7；其中，n.s.，P>0.05表示差异性不显著；*，0.01<P<0.05表示差异性显著；**，P<0.01表示差异性极显著。

结果可看出，与对比例1相比，实施例1～3制得的产品处理人皮肤成纤维细胞后，细胞存活率极显著提升。与对比例2相比，实施例1制得的产品处理人皮肤成纤维细胞后，细胞存活率极显著提升，实施例2～3制得的产品处理人皮肤成纤维细胞后，细胞存活率显著提升。

表7

效果实施例4皮肤紧致功效测试(待测样品为实施例1和实施例2制得产品)

1)实验设计：单次测试，组间比较；

2)受试者信息：受试者人数：20人；性别：女；年龄：35～45岁；

3)环境要求：温度：22℃±1℃；湿度：50％±10％；

4)实验仪器：MPA580(德国CK公司)多探头；

5)测试区域：测试部位选择左下颌；

6)测试指标：皮肤弹性(R2值和Q1值)；

7)测试时间点：测试进行4周，分别在第0、4周进行皮肤测试；

8)测试方法：

测试场所无光线直射、无风，温度22～24℃，湿度40％～60％。检测前用洗面奶清洗面部，静息15～30min，测定皮肤弹性(R2值和Q1值)。

下发样品(实施例1产品或实施例2产品)后，志愿者于每日早晚面部各涂抹一次，使用周期为4周，在第四周进行皮肤测试。每次测试需要用洗面奶清洗面部，静息15～30min，测定皮肤弹性(R2值和Q1值)。

皮肤弹性测试仪(Cutometer，MPA580，Courage and Khazaka，德国)的原理是基于吸力和拉伸原理，在被测试的皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进一个特定测试探头内，皮肤被吸进测试探头内的深度是通过一个非接触式的光学测试系统测得的。测试探头内包括光的发射器和接收器，光的比率(发射光和接收光之比)同被吸入皮肤的深度成正比，通过MPA软件分析皮肤的弹性性能。其中，评价参数：R2：回弹部分的弹塑性总量/拉伸部分的弹塑性总量，两个过程的弹塑性性能相比，越接近1越好。Q1：回弹部分的弹塑性总面积/拉伸部分的弹塑性总面积，越接近1越好，实施例1的结果见表8和图8～9，实施例2的结果见表8和图10～11。

测试方法：选择左侧脸颊区域使用Cutometer进行皮肤弹性测试，每个测试区测试3次取平均值。参数设置为：Pressure 450mbar；on-time 2.0s；off-time2.0s；repetition2times。

表8

从表8可看出，志愿者使用实施例1和实施例2制得的产品四周后，R2和Q1均明显增大，即实施例1～2制得的产品可有效改善皮肤弹性。

最后，还需要说明的是，在本发明中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种黄豆发酵物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将发酵菌种接种到发酵底物中，经发酵培养、灭菌，即可；其中，所述发酵底物为黄豆和水；所述发酵菌种为乳酸菌和/或酵母菌。

2.如权利要求1所述的黄豆发酵物的制备方法，其特征在于，所述黄豆占所述发酵底物的质量百分数为0.2％～3％；

和/或，所述黄豆在使用前还进一步包括粉碎的操作；

和/或，所述水为蒸馏水、矿泉水和自来水中的任意一种或多种；

和/或，所述发酵底物在使用前还进一步包括灭菌的操作；

和/或，所述发酵菌种为所述乳酸菌或所述酵母菌；

和/或，所述乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)中的任意一种或多种；

和/或，所述酵母菌为酿酒酵母菌；

和/或，当所述发酵菌种为所述乳酸菌和所述酵母菌的混合菌种时，所述黄豆发酵物的制备方法包括如下步骤：(1)将所述酵母菌接种到所述发酵底物中，经发酵培养、灭菌，制得物料A；(2)将所述乳酸菌接种到所述物料A中，经发酵培养、灭菌，即可。

3.如权利要求2所述的黄豆发酵物的制备方法，其特征在于，所述黄豆占所述发酵底物的质量百分数为0.5％～1％；

和/或，所述水为蒸馏水；

和/或，所述发酵底物在使用前的所述灭菌操作中，所述灭菌的温度为100～130℃，较佳地为100～121℃；

和/或，所述发酵底物在使用前的所述灭菌操作中，所述灭菌的时间为10～30min，较佳地为15～30min；

和/或，所述发酵菌种为乳酸菌；

和/或，所述乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)；

和/或，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)为购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.16075的德氏乳杆菌保加利亚亚种；

和/或，所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)为购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.15607的布氏乳杆菌；

和/或，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)为购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1.5029的两歧双歧杆菌；

和/或，所述酿酒酵母菌为酿酒酵母(Sacharomyces)菌株YWY-1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏日期为2019年03月27日，保藏编号为CGMCC No.17452。

4.如权利要求1～3中任意一项所述的黄豆发酵物的制备方法，其特征在于，当接种所述乳酸菌时，所述乳酸菌以乳酸菌菌液的形式添加，所述乳酸菌菌液中所述乳酸菌的浓度为10⁴～10¹⁰CFU/mL；

和/或，当接种所述乳酸菌时，所述发酵培养的时间为6～16h；

和/或，当接种所述乳酸菌时，所述发酵培养的温度为37～45℃；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述酵母菌以酵母菌菌液的形式添加，所述酵母菌菌液中所述酵母菌的浓度为10⁵～10⁸CFU/mL；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速为100～180rpm；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养的时间为30～50h；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养的温度为20～28℃；

和/或，所述灭菌的温度为100～130℃；

和/或，所述灭菌的时间为10～30min；

和/或，所述灭菌的操作前还进一步包括离心，收集上清液的操作；

和/或，所述灭菌的操作后，还进一步包括与防腐剂混合的操作。

5.如权利要求4所述的黄豆发酵物的制备方法，其特征在于，当接种所述乳酸菌时，所述乳酸菌以乳酸菌菌液的形式添加，所述乳酸菌菌液中所述乳酸菌的浓度为10⁶～10⁹CFU/mL；

和/或，当接种所述乳酸菌时，所述发酵培养的时间为8～16h；

和/或，当接种所述乳酸菌时，所述乳酸菌菌液与所述发酵底物的体积比为(5～20)：100；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速为150～180rpm；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述发酵培养的时间为30～48h；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述酵母菌菌液与所述发酵底物的体积比为(1～25)：100；

和/或，所述灭菌的温度为100～121℃；

和/或，所述灭菌的时间为15～30min；

和/或，所述灭菌操作前的所述离心的转速为4500～6000rpm；

和/或，所述灭菌操作前的所述离心的时间为20～60min；

和/或，与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为35～60℃；

和/或，与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂包括乙二醇和/或戊二醇；

和/或，与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂占所述灭菌后制得物料的质量百分比为1.5％～3％。

6.如权利要求5所述的黄豆发酵物的制备方法，其特征在于，当接种所述乳酸菌时，所述乳酸菌菌液与所述发酵底物的体积比为(8～10)：100；

和/或，当接种所述酵母菌时，所述酵母菌菌液与所述发酵底物的体积比为(10～25)：100；

和/或，所述灭菌操作前的所述离心的转速为5500～6000rpm；

和/或，所述灭菌操作前的所述离心的时间为20～30min；

和/或，与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为45℃；

和/或，与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂包括乙二醇和戊二醇；

和/或，当所述防腐剂包括乙二醇和戊二醇时，乙二醇与戊二醇的重量份数比为(1.8～3)：(0.2～0.8)，较佳地为2.8：0.5。

7.一种黄豆发酵物，其特征在于，其由如权利要求1～6中任意一项所述的黄豆发酵物的制备方法制得。

8.一种如权利要求7所述的黄豆发酵物作为产品、产品添加剂或产品基底在制备皮肤外用剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述黄豆发酵物作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或紧致肌肤活性成分。

10.一种皮肤外用剂，其特征在于，其包括如权利要求7所述的黄豆发酵物；

较佳地，所述皮肤外用剂包括面膜、精华或爽肤水；

较佳地，所述皮肤外用剂中所述黄豆发酵物的质量百分比为2％～100％，更佳地为20％～100％。

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