KR101944082B1

KR101944082B1 - 아가위 열매의 에탄올 추출물을 포함하는 피부노화방지용 또는 피부미백용 화장료 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101944082B1
Application number: KR1020170080712A
Authority: KR
Inventors: 박성진; 권성필
Original assignee: 제이앤팜유한책임회사; 한림성심대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-26
Filing date: 2017-06-26
Publication date: 2019-01-31
Also published as: KR20190001628A

Abstract

본 발명은 아가위 열매의 에탄올 추출물을 포함하는 피부노화방지용 또는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 아가위 열매 에탄올 추출물은 우수한 피부 항노화능을 발휘하고, 우수한 피부미백능을 발휘한다.

Description

아가위 열매의 에탄올 추출물을 포함하는 피부노화방지용 또는 피부미백용 화장료 조성물 및 그 제조방법 {Cosmetics for anti-aging or whitening of skin with ethanol extract of Crataegi fructus fruit and manufacturing method of producing the same}

본 발명은 피부노화방지용 또는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아가위 열매의 에탄올 추출물을 포함하는 피부노화방지용 또는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 들어 과학의 발달 및 생활수준 향상에 따라 건강에 대한 관심이 높아지고 있으며, 노화억제와 건강 유지를 위한 기능성 활성물질에 대한 연구가 광범위하게 이루어지고 있다. 이에 따라 식품, 화장품 및 의약품을 포함한 여러 제품의 소재 활용을 위한 항산화 등의 기능성 연구가 꾸준히 이루어지고 있다.

체내에서 발생하는 활성산소는 일반적으로 체내에 존재하는 항산화 시스템으로 인해 저해와 방어가 가능하였다. 그러나 최근 산업화로 인한 각종 매연, 환경호르몬, 알콜 및 흡연 등과 같은 환경적 요인은 활성산소의 양을 증가시켜, 체내의 항산화 시스템만으로는 산화적 스트레스에 의해 발생하는 손상을 적절히 방어하지 못할 수 있다. 이와 같은 현상으로 인해 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 매우 높아서 고분자 단백질과 DNA의 변형 및 생체막을 손상시키며, 조직이나 기관들을 손상시켜 암과 같은 질병을 야기한다.

ROS를 제거하기 위해서 과거에는 효과와 경제성이 뛰어난 합성 항산화제인 BHT(butylated hydroxytoluene) 및 BHA(butylated hydroxyanisole)가 많이 사용되어 왔으나, 최근 이러한 합성물들의 인체에 대한 독성과 안정성 문제가 많이 알려지면서 법적으로 규제되고 있으며, 그 사용이 점점 감소하고 있다. 이로 인해, 최근에는 안전성이 확보된 천연물을 이용한 새로운 천연 항산화제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

인간의 세포는 매일 산화적 손상을 받는데 인체 각 세포의 DNA는 하루에 약 10,000번의 산화적 공격을 받는다. 이로 인한 손상은 일부 회복되지만 회복되지 않은 손상이 축적되어 노화, 암, 심장병 등의 질병을 일으키게 된다. 또한, 항산화 영양 성분으로는 베타-카로틴(β-carotene), 비타민 E, 비타민 C 등의 비타민과 Se, Cu, Mn, Zn 등의 미량원소와 폴리페놀이 알려져 있는데 이들 미량성분의 항암효과는 항산화 능력에 기인한다는 연구결과도 보고되었다.

한편, 아가위(Crataegi fructus)는 우리나라 각지의 산야와 계곡에서 자생하는 산사나무(Crataegus pinnatifida Bunge) 및 동속 근연식물의 성숙한 과실로서 장미과(Rosacease)에 속하며, 성분으로는 시트르산(citric acid), 크라테골산(crataegolic acid), 숙신산(succinic acid), 클로젠산(chlorogenic acid) 등의 유기산과 퀘르세틴(quercetin), 퀘르시트린(quercitrin), 에피카테킨(epicatechin), 루틴(rutin) 등의 플라보노이드 화합물을 함유하며, 비타민과 카로틴이 풍부하다. 특유의 향긋한 냄새와 단맛 및 신맛을 가지고 있으며, 건위, 소화, 수렴, 진통, 살충에 효능이 뛰어나고 숙취에도 좋은 효과가 있다. 또한, 트리글리세라이드(trigyceride) 대사 능력을 좋게 하고, LDL(lowdensity lipoprotein) 대사를 향상시키는 등 지질대사를 개선시키는데 뛰어난 효능을 보이며, 스코폴아민(scopolamine)으로 유도시킨 동물모델에서 기억능력 개선 및 인지능 향상, 혈압 저하효과, α-아말리아제와 α-글루코시다아제 억제 효과 등의 연구 보고가 있다. 이외에도 산사 첨가 식빵의 품질 특성, 산사 첨가량에 따른 산사편의 품질특성, 산사를 이용한 돈육 불고기양념의 품질특성과 항산화 활성 등 조리과학부분의 연구도 활발히 진행되고 있다.

하지만, 아직까지 아가위 열매 추출물의 최적추출조건에 대한 연구는 미미한 상태이다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0047814호(공개일자 2015.05.06)에는, 반응표면분석법을 이용한 머위로부터 페타신 함유 추출물을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 대한민국 공개특허 제10-2015-0044192호(공개일자 2015.04.24)에는, 우수한 품질의 가자미식해를 제조하기 위한 반응표면분석법 및 이의 제조방법이 기재되어 있다.

체내 활성산소는 생체조직을 공격한 후 정상 세포를 손상시키며, 피부노화, 고지혈증, 동맥경화, 당뇨 등 다양한 질병을 유발시키게 되므로 이를 방지하기 위한 항산화제에 대한 연구가 이루어지고 있다. 따라서 산화적 손상을 줄일 수 있는 항산화계의 강화는 체내 자유 라디칼과 지질 과산화물의 증가로 인해 발생되는 합병증 발생 예방에 매우 중요하다.

다양한 생리활성을 지닌 아가위나무 열매를 기능성식품 소재로 활용하기 위해 효율적인 성분의 추출방법 확립은 산업적으로 매우 중요한 요소이다. 일반적으로 식물체로부터 유용성분의 추출은 열수추출법, 상온교반추출법, 환류냉각추출법, 초음파추출법, 고온가압추출법 그리고 저온고압추출법 등의 방법을 사용하고 있다. 주파수가 약 20kHz 이상인 음파를 지칭하는 초음파는 반사되는 성질을 이용하여 식품의 성분과 구조 등의 비파괴 검사에 적용되는 low-intensity(<1 W/cm²)와 물체를 전단 및 압축시켜 조직의 물리적 파괴, 유화형성, 화학반응 촉진 등의 성질을 가져 천연물로부터 유용성분 추출에 이용되는 high-intensity (101,000 W/cm2) 초음파 등이 여러 분야에서 활용되고 있다.

본 발명에서는 아가위나무 열매 추출물의 효율적인 추출방법을 규명하기 위하여 추출방법에 따른 추출물의 항산화, 미백효능을 비교 검토하였다.

본 발명은 아가위 열매의 에탄올 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 아가위 열매의 에탄올 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 아가위 열매의 에탄올 추출물은, 바람직하게 초음파를 가해 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 아가위 열매의 에탄올 추출물은, 바람직하게 70~80%(v/v)의 에탄올 수용액을 추출용매로 사용하고, 70~74℃의 추출온도에서, 5시간 30분 ~ 6시간 30분의 추출시간으로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 아가위 열매 에탄올 추출물은 우수한 항산화 능력을 발휘하였고, 그 결과 피부노화방지용 화장료 조성물의 원료로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 아가위 열매 에탄올 추출물은 우수한 피부미백능을 발휘하여, 피부미백용 화장료 조성물의 원료로도 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에서는 상기와 같은 항산화능 또는 피부미백능의 최적 발휘를 위한 아가위 열매 에탄올 추출물의 추출조건을 발굴하였는데, 초음파를 가해서 추출하는 것이 바람직한 것으로 도출되었고, 그 외 70~80%(v/v)의 에탄올 수용액을 추출용매로 사용하고, 70~74℃의 추출온도에서, 5시간 30분 ~ 6시간 30분의 추출시간으로 추출한 것이 바람직한 것으로 도출되었다.

도 1은 아가위 열매 추출물의 DPPH 소거능을 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 아가위 열매 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 아가위 열매 추출물의 환원력 측정 결과 그래프이다.
도 4는 아가위 열매 추출물의 세포 생존 능력 측정 결과 그래프이다.
도 5는 아가위 열매 추출물의 티로시나아제 저해활성 결과 그래프이다.
도 6은 아가위 열매 추출물의 마우스 흑색 세포(B16F10)에서의 멜라닌 생합성 저해활성 측정 결과 그래프이다.
도 7은 아가위 열매 추출공정별 수율을 비교한 그래프이다.
도 8은 아가위 열매 추출공정별 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 비교 그래프다.
도 9는 아가위 열매의 최적 추출조건을 찾기 위한 에탄올 농도별 수율 그래프이다.
도 10은 아가위 열매의 최적 추출조건을 찾기 위한 용매량에 따른 수율 그래프이다.
도 11은 아가위 열매의 최적 추출조건을 찾기 위한 추출시간별 수율 그래프이다.
도 12는 아가위 열매의 최적 추출조건을 찾기 위한 추출온도별 수율 그래프이다.
도 13은 Box-Behnken 디자인(design)에 따른 15개 구간에서 아가위나무 열매 추출수율을 측정한 결과를 MiniTab 16 program을 이용하여 3차원 표면으로 나타낸 그래프이다.
도 14는 Box-Behnken 디자인(design)에 따른 15개 구간에서 아가위나무 열매 추출수율을 측정한 결과를 MiniTab 16 program을 이용하여 2차원 등고선으로 나타낸 그래프이다.

본 발명은 아가위 열매 에탄올 추출물을 함유하는 피부노화방지용 조성물을 제공한다. 하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 본 발명의 아가위 열매 에탄올 추출물은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, 전자공여능, ABTS 라디칼 소거능이 우수하게 나타나, 높은 항산화 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.

피부노화는 여러가지 원인에 의해 발생하는데, 피부 세포가 산화되는 것도 중요한 원인 중 하나이다. 따라서, 항산화 효능을 가지는 본 발명의 아가위 열매 에탄올 추출물은 피부노화방지용 화장료 조성물의 주요 원료로 사용될 수 있는 것이다.

한편, 본 발명은 아가위 열매 에탄올 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다. 하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 본 발명의 아가위 열매 에탄올 추출물은 우수한 티로시나아제 저해 활성을 보이는 것으로 나타났고, 마우스 흑색 세포(B16F10)에서 멜라닌 생합성을 저해하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 아가위 열매 에탄올 추출물은 피부미백용 화장료 조성물의 주요 원료로 사용될 수 있는 것이다.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 또한, 본 발명의 조성물은 수성, 수성-알콜성 또는 오일성 용액, 수중유 또는 유증수 또는 다중 에멀전, 수성 또는 오일성 겔, 액체, 페이스트성 또는 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물의 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이온성 및/또는 비이온성 형태의 지질 소포체의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 다소 유체일 수 있으며, 백색 또는 유색크림, 연고, 밀크로션, 유액(serum), 에센스, 페이스트 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

한편, 본 발명에서는 상기와 같은 항산화 또는 피부미백능을 보이는 아가위 열매 에탄올 추출물의 최적 추출조건을 탐구하고자 하였다. 하기 본 발명의 실험에서는 상온교반추출물, 환류냉각추출물, 초음파추출물의 수율을 비교하였는데, 초음파 전처리 공정을 거친 추출물의 수율이 약 10% 정도 높아지는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에서는 바람직하게 초음파 추출을 통해 추출물을 수득하는 것이 좋은 것으로 결론내릴 수 있었다.

또한, 본 발명에서는 반응표면분석법을 이용하여 아가위 열매 초음파 에탄올 추출조건을 최적화하고자 하였는데, 70~80%(v/v)의 에탄올 수용액을 추출용매로 사용하고, 70~74℃의 추출온도에서, 5시간 30분 ~ 6시간 30분의 추출시간으로 추출하는 것이 가장 바람직한 것으로 나왔다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 아가위 열매의 시료 제조]

강원도 춘천에서 채취한 아가위 열매(Crataegi fructus) 중 외관이 건전한 것을 선별하고 세척하여 풍건한 후 120 mesh 이하로 마쇄하여 준비하였다. 둥근플라스크에 준비된 분말을 넣고 70% 에탄올을 가해서 4시간 환류추출하고, 추출액을 면포로 여과한 후 감압농축(CCA-1100, Eyela, Tokyo, Japan)한 다음, -70℃에서 급속동결건조(PVTFA 10AT, ILSIN, Korea) 과정을 거쳐 분말 상태로 최종 제조하였다. 이렇게 준비한 70% 에탄올로 추출한 시료의 수율은 17.2%이었다. 이 시료를 각종 생리활성 물질 함량분석 실험에 사용하였다.

[ 실험예 1: 아가위 열매 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정]

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu's phenol 시약이 시료의 페놀성 화합물에 의해 몰리브덴 청색으로 환원되는 원리로 측정하였다. 각 시료 1 mL에 10% folin-ciocalteu's phenol 시약 1 mL 및 2% Na₂CO₃ 용액 1 mL을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 그리고 상등액에 대해 마이크로플레이트 리더 (microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 갈산(gallic acid)을 이용하였으며 표준 검량 곡선(y=16.785x-0.0343, R2=0.9992)으로부터 총 폴리페놀 함량을 계산 하였다.

70% 에탄올의 아가위 열매 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 표 1에 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 57.4 mg/g, 총 플라보노이드 함량은 10.9 mg/g, 14.4 mg/g으로 나타났다.

시료	아가위 열매 70% 에탄올 추출물
총 폴리페놀 함량(GAE¹⁾ mg/g)	61.31 ± 1.90
총 플라보노이드 함량(RE²⁾ mg/g)	25.42 ± 1.22
Values are mean± S.E. Values are mean of triplicates. 1) Gallic acid equivalent. 2) Rutin equivalent.

[ 실험예 2: 아가위 열매 에탄올 추출물의 전자공여능 ( 항산화능 ) 측정]

아가위 열매 에탄올 추출물의 전자공여작용(electron donating abilities, EDA)은 각각의 추출물에 대한 DPPH (α,α-diphenyl-picrylhydrazyl)의 전자공여효과로 확인되는 각 시료의 환원력을 확인함으로써 측정하였다. 즉, 에탄올 1 mL, 시료 10 μL, 100 mM 소디움 아세테이트 버퍼 (sodium acetate buffer, pH 5.5) 990 uL를 분주한 시험관에 0.5 mM DPPH 용액 (Abs. EtOH soln.) 0.5 mL를 넣어 교반하고, 암실에서 5분간 반응을 유도한 후, 잔존 라디칼의 농도를 UV 스펙트로포토미터를 이용하여 517 nm에서 측정하였다.

전자공여능(%)은 하기 수학식 1로부터 계산하였고, As와 Ac에 실험군과 대조군의 흡광도 값을 각각 대입하여 계산하였다.

[수학식 1]

EDA(%) = (1-As/Ac)

As : 추출물 첨가구의 흡광도

Ac : 추출물 무첨가구의 흡광도

아가위 열매 에탄올 추출물의 DPPH 소거능은 10, 50, 100, 500, 1,000 ug/mL의 농도에서 각각 17.24, 19.26, 28.90, 60.64 및 85.80%로 확인되었다(도 1). 이상의 실험을 통해 아가위나무 열매가 우수한 전자공여 활성을 나타내는 것으로 확인되어, 우수한 천연 항산화제 소재로 평가할 수 있었다.

[ 실험예 3: 아가위 열매 에탄올 추출물의 ABTS 라이칼 소거능 ]

ABTS 라디칼 소거능 측정은 Roberta et al.(Roberta R, Nicoletta P, Anna P, Anath P, Min Y, Catherine RE: Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Bio Med 26(9-10): 1231-1237, 1999)의 방법으로 평가하였다.

7.4 mM ABTS와 2.6 mM 포타슘 퍼설페이트 (potassium persulphate)를 제조하여 섞은 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온 라디칼(ABTS+)을 형성시킨 후, 734 nm에서 흡광도의 값이 1.5 이하가 되도록 희석하였다. 희석된 ABTS+용액 1 mL에 농도별로 제조된 시료 20 μL를 첨가한 뒤 30분 후 흡광도의 변화를 측정하였다. 항산화 활성은 시료를 녹인 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 대조군으로 사용하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다.

[수학식 2]

ABTS 라디칼 소거능 = (1-A_test/A_control)×100

ABTS 어세이는 포타슘 퍼설페이트 (potassium persulfate)와의 반응으로 생성된 퍼옥사이드 라디칼 (roxide radical) 성격의 ABTS이 항산화성 물질에 의해 제거되면서 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법이다. 앞에서의 DPPH 어세이의 경우 유리라디칼이 소거되는 것을 이용하는 것인 반면, ABTS 어세이는 양이온 라디칼이 소거되는 것을 이용하는 방법이다.

아가위 열매 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 10, 50, 100, 500, 1,000 ug/mL의 농도에서 각각 2.0, 5.1, 6.1, 8.3 및 27.3%로 확인되었다(도 2).

[ 실험예 4: 아가위 열매 에탄올 추출물의 환원력 측정]

아가위 열매 에탄올 추출물의 환원력은 Oyaizu (Oyaizu M: Studies on products of browning reactions: antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn J Nutr 44(6): 307-315, 1986)의 방법에 따라 측정하였으며, 시료 1 mL에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충액 및 1%의 포타슘 페리시아나이드 (potassium ferricyanide)를 각 1 mL씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분간 반응시켰다. 여기에 15% TCA (trichloroacetic acid) 용액을 1 mL 가하고, 12,000 × g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상등액 1 mL에 증류수 및 페릭 클로라이드 (ferric chloride) 각 1 mL를 가하여 혼합한 후 700 mm에서 흡광도를 측정하였다.

시료의 환원력은 흡광도의 값으로 나타내었다. 환원력은 시료가 Fe3+에 수소를 공여하여 라디칼을 안정화시킴으로써 Fe² ⁺로 환원되는 것을 이용한 방법으로 앞에서 FRAP(ferric-reducing antioxidant potential) 어세이와 유사하다. 환원력을 평가한 655 nm의 값은 10, 50, 100, 500, 1,000 ug/mL의 농도에서 각각 0.01, 0.06, 0.07, 0.19 및 0.31을 나타내어, 농도의존적으로 증가하였다(도 3).

[ 실험예 5: 아가위 열매 에탄올 추출물의 세포 생존 능력 측정]

세포 생존률 측정은 Carmichael et al.(Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB: Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 47(4): 936-942, 1987)의 방법에 따라 측정하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁴ cells/well이 되게 180 μl씩 분주하고, 시료를 농도별로 20 μl 처리하고 48시간 배양하였다. 배양 후 5 mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 20 μl를 첨가하여 3시간 처리 후 배양액을 제거하고 각 웰 당 DMSO 200 μl를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA 리더로 550 nm에서 흡광도를 측정한 후 '1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도'에 의하여 생존율을 계산하였다.

세포 수준의 연구에 많이 이용되고 있는 MTT 어세이는 세포 증식 (cell proliferation)과 생존력(viability)의 in vitro 분석에 매우 유용하게 사용되고 있다. 아가위 열매 추출물에 의한 멜라노마 세포의 생존율을 확인한 결과(도 4), 추출물이 10, 25, 50, 100 μg/mL 농도에서 100% 이상의 세포 생존율을 보이는 것으로 확인하였다. 따라서, 하기에서는 50 μg/mL 농도 이하에서 멜라닌 생합성 저해 실험을 진행하였다(도 4).

[ 실험예 6: 아가위 열매 에탄올 추출물의 티로시나아제( Tyrosinase ) 저해 활성 측정]

티로시나아제 억제 효과는 dopachrome 방법 (Kim KS, Kim JA, Eom SY, Lee SH, Min KR, Kim Y: Inhibitory effect of piperlonguminine on melanin production in melanoma B16 cell line by downregulation of tyrosinase expression. Pigment Cell Research 19(1): 90-98, 2006)을 이용하여 측정하였다. 150 μL의 mushromm tyrosinase-150 unit(Sigma Chemical Co.), 225 μL(2.5 mM)의 L-tyrosinase, 225 μL의 0.4M Hepes buffer(pH 6.8), 그리고 300 μL의 에탄올 용액 혹은 시료(1 mg/mL)용액을 섞은 후, 배양 전과 15분간 배양 후, 475 nm에서 흡광도를 각각 측정하여 억제되는 정도를 살폈다. 티로시나아제의 억제 정도는 하기 수학식 3에 의해 측정하였다. 티로시나아제 억제효과는 100으로 나타날 때 완전한 억제를 의미하며, 0일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미한다.

[수학식 3]

티로시나아제 저해능 (%)={(D-C)-(B-A)}/(D-C)×100

A와 B: 각각 시료를 가지는 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도

C와 D: 각각 시료를 넣지 않은 용액(기준 용액)의 배양전과 배양 후의 흡광도

아가위 열매 추출물 100, 500, 1,000 μg/mL에서 각각 22.29%, 33.36% 및 46.83%의 저해율을 나타냈다 (도 5). 비록 미백제로 알려진 알부틴(arbutin)과 비교하였을 때, 티로시나아제 저해활성 결과가 낮았지만, 아가위 열매 에탄올 추출물은 천연소재로써 미백 효능이 있는 것으로 확인할 수 있었다. 일부 생약과 해조류의 티로시나아제 저해 활성을 측정한 Choi et al.(Choi BW, Lee BH, Kang KJ, Lee ES, Lee NH: Screening of the tyrosinase inhibitors from marine algae and medicinal plants. Kor J Pharmacogn 29(3): 237-242, 1998)은 치자 36%, 인삼 27%, 지실 15%, 매생이 21%, 청각11% 그리고 미역 7%의 저해율을 보고하였으며, 제주산 식물을 이용한 티로시나아제 저해연구에서는 1000 μg/mL의 농도에서 10% 미만의 효과를 나타내었는데(Lee NH, Yang HC, Bu HJ, Jung DS, Lee SJ, Riu KZ: Screening of the tyrosinase inhibition and hyaluronidase inhibition activities and radical scavenging effects using plants in Jeju. Kor J Pharmacogn 32(3): 175-180, 2001), 이들 결과와 비교하여 아가위 열매 추출물의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 7: 아가위 열매 추출물의 마우스 흑색 세포( B16F10 )에서의 멜라닌(melanin) 생합성 저해활성 측정]

멜라닌 양은 Hosoi et al.(Hosoi J, Abe E, Suda T, Kuroki T: Regulation of melanin synthesis of B16 melanoma cells by 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res 45(4): 1474-1478, 1985)의 방법을 변형하여 사용하였다. B16F10 멜라노마 세포를 6 well에 5×10⁴ cells/well이 되도록 접종하여 배양하고, 각 웰에 시료를 처리한 뒤 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척하고, 원심 분리하여 세포 침전물을 만들었다.

10% DMSO(dimethyl sulfoxide)가 첨가된 1 N NaOH 용액을 150 μl 첨가하고, 60℃에서 1시간 용해하였으며, 405 nm에서 흡광도를 측정한 후, 실험군의 멜라닌 양은 무첨가군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.

멜라닌은 세포 내의 소기관인 리보솜(ribosome)에서 티로시나아제라는 효소의 생합성 기작에 의해 합성되기 시작한다. 이 효소의 작용으로 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에서 몇 단계의 합성을 거쳐, 기저층의 멜라닌 세포 멜라노마 사이트 (melanoma site)라는 흑색소포 표면에 침착하여 검고 갈색의 작은 멜라닌 입자가 만들어 진다.

아가위 열매 추출물의 멜라노마 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과는 도 6에 나타내었다. 측정 결과, 아가위 열매 추출물은 50 μg/ml의 농도에서 무첨가군에 비해 멜라닌 생성을 8.5% 저해하였고, 합성 미백원료인 코직산은 같은 농도에서 17.2% 저해하는 것을 관찰할 수 있었다. 유럽밤나무 꽃 MeOH, EtOH, 물 추출물을 통한 멜라닌 저해 연구에서 보고된 50 μg/mL 농도의 멜라닌 생합성 저해는 9, 11, 8%로 나타나, 아가위 열매 추출물과 비슷한 결과를 보였고(Sapkota K, Park SE, Kim JE, Kim S, Choi HS, Chun HS, Kim SJ: Antioxidant and antimelanogenic properties of chestnut flower extract. Biosci Biotech Bioch 74(8): 1527-1533, 2010), 초음파 병행을 통한 병풀 EtOH, 물 추출물의 멜라닌 생합성 저해가 200 μg/mL의 농도에서 10% 이하의 효과를 나타낸 결과와 비교하면, 본 발명 아가위 열매추출물은 피부 색소 침착에 효능이 있는 미백 소재로 훌륭한 효능을 보이는 것으로 평가할 수 있었다.

[ 실시예 2: 상온교반 추출, 환류냉각 추출, 초음파 전처리 추출공정에 의한 아가위 열매 에탄올 추출물의 수율 비교]

강원도 춘천에서 채취한 아가위(Crataegi fructus) 열매를 외관이 건전한 것을 선별하고 세척하여 불순물을 제거한 뒤 동결건조(PVTFA 10AT, ILSIN, Korea)하였으며, 건조한 시료는 분쇄기(IKA M20, IKA, Germany)를 이용하여 2030 mesh로 조분쇄한 후 20℃에서 보관하면서 추출물 제조에 사용하였다.

아가위무 열매의 추출은 시료 100 g에 15배의 70% 에탄올을 가하여 수행하였는데, 상온교반추출(SE, stirrer extraction)은 25℃의 실온에서 교반기(Hanbak Scientific Co., Bucheon, Korea)를 이용 150 rpm으로 24시간, 3회 반복 추출하였고, 환류냉각추출(RE, reflux extraction)은 냉각관을 부착하여 60℃의 항온수조에서 3시간 3회 반복 추출하였으며, 초음파추출(USE, ultrasonification extraction)은 초음파 추출기(AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 120 kHz의 조건으로 6시간 3회 반복 추출하였다.

얻어진 각각의 추출물은 감압여과펌프(KNF Laboport Pressure Pump, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA)와 Whatman사(Piscataway,NJ, USA)의 20~25 μm 여과지를 이용하여 여과하였다. 여과한 추출물을 감압회전농축기(Rotary Vacuum Evaporator N-N series, EYELA, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용해 농축한 후 동결건조(PVTFA 10AT, ILSIN, Suwon, Korea) 하였으며, 각 추출물들의 수율은 동결건조 후 건물 중량을 구한 다음 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다 (도 7).

[실험예 8: 실시예 2에서 수득된 아가위 열매 에탄올 추출물의 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량 비교]

식물성 식품 속에 함유되어 있는 페놀화합물은 화학적으로 이질적인 물질들을 포함하는데, 유기용매에만 녹는 지용성인 것도 있고, 수용성의 카르복실산이나 배당체, 그리고 크기가 큰 중합체도 포함되어 있어, 이들의 기능은 그 구조적 다양성만큼이나 다양하다. 또한, 페놀성 화합물의 페놀릭 하이드록실 (phenolic hydroxyl) 기는 다른 성분들과 쉽게 결합하여, 항암, 항산화 등 다양한 생리활성을 보이는 것으로 알려져 있다.

추출공정별 아가위 열매의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 표 2에 나타내었다.

시료	SE (상온교반 추출)	RE (환류 추출)	USE (초음파 추출)
총 폴리페놀 함량 (GAE¹⁾mg/g)	41.27 ±1.01^c	61.31 ±1.90^b	84.20 ±0.21^a
총 플라보노이드 함량 (RE²⁾mg/g)	10.26 ±0.29^c	25.42 ±1.22^b	41.27 ±1.47^a
Values are mean ±S. E. Values are mean of triplicates. Values with different letters in a column are significantly different by Duncan’multiple range test (p<0.05). 1) Gallic acid equivalent. 2) Rutin equivalent.

총 폴리페놀함량은 USE, RE, SE의 순으로 각각 84.20 mg/g, 61.31 mg/g 및 41.27 mg/g으로 나타났다.

플라보노이드의 함량은 총 폴리페놀 함량과 비슷한 경향을 보였으나, 함량 면에서 다소 적게 나타내었으며, USE, RE, SE가 각각 41.27 mg/g, 25.42 mg/g 및 10.26 mg/g 으로 측정되었다.

상기의 결과는 먼나무 추출에 초음파를 이용한 연구결과 지표물질인 시린진(syringin)의 함량의 증가에 관한 연구와 유사한 결과를 나타내었다 (hao LC, He Y, Deng X, Xia XH, Liang J, Yang GL, Li W, Wang H. 2012. Ultrasound-assisted extraction of syringin from the bark of Ilex rotunda thumb using response surface methodology. Int J Mol Sci. 13: 7607-7616). 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량은 서로 밀접한 상호관계가 있다는 보고가 있으며, 아가위나무 열매의 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량을 회귀 분석으로 분석한 결과 ,결정계수 R²는 0.87로 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량의 연관성이 높게 나타내었다 (P< 0.05).

[ 실험예 9: 실시예 2에서 수득된 아가위 열매 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 비교]

전자공여능은 항산화 측정에 가장 많이 쓰이는 방법 중 하나이다. 이 실험에서 사용되는 DPPH는 항산화 활성을 측정하기 위한 기질로 사용되며, 폴리페놀, 플라보노이드와 같은 페놀성 물질에 대한 항산화작용의 지표로 알려져 있다. DPPH법은 자유 라디칼(free radical)로 특유의 색을 나타나게 되나, 전자나 수소원자에 의해 전자가 쌍이 되어 비 라디칼이 되면 특유의 색이 사라지게 되는 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl의 화학적 성질을 이용한 방법이다.

아가위 열매의 추출 공정별 에탄올 추출물의 DPPH 소거능은 10, 50, 100, 500, 1,000 ug/mL의 농도에서 각각 14.20, 21.24, 29.61, 65.21 및 88.91%로 확인되어 초음파 추출(USE)이 가장 높게 나타났다(도 8).

[ 실시예 3: 아가위 열매 초음파 에탄올 추출 공정의 최적화 실험 계획 수립]

본 실험예에서는 아가위 열매의 초음파 에탄올 최적추출조건 설정을 위해 초음파 기기(Mujigae Co., Ltd., Seoul Korea)를 사용하여 지속적으로 초음파를 가하였으며, 추출시간, 추출온도, 에탄올 농도를 달리하여 추출하였다. 추출한 추출물은 여과지(Whatman, No.3, Maidstone, Kent, UK)를 사용하여 여과한 후, 회전식 진공 농축기(Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)와 동결건조기(Ilshinbiobase Co., Ltd., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 농축 및 동결건조하여 추출수율(extraction yield, %)을 비교하였다.

추출조건의 예비설정에 필요한 기초실험으로써 추출시간과 온도에 따른 영향을 확인하였으며, 추출조건 최적화 실험의 기본조건으로 활용하였다. 추출수율은 추출물을 동결건조한 후, 추출원료 건물량에 대한 고형분의 수율로 나타내었다. 또한, 아가위 열매의 추출공정 최적화를 위해 Box-Behnken design (3 level 3 factor)을 이용하였으며, 에탄올 농도비(10-90%, X1), 추출온도(40-80℃, X2), 추출시간(1-12 hours, X3)을 독립변수로 설정하여 축값을 포함한 3수준(1, 0, 1)에서 실험을 설계하였다(표 3). 추출물의 결과는 추출수율을 종속변수로 하여 실험모델을 작성하고, 모델식의 적합성을 평가하였다.

독립변수	symbol	Levels
독립변수	symbol	-1	0	1
에탄올 농도	X₁	50	70	90
추출 온도(℃)	X₂	46	60	80
추출 시간(min)	X₃	3	6	9

[ 실험예 10: 반응표면분석을 이용한 아가위 열매 초음파 에탄올 추출조건의 최적화]

(1) 용매 선정

추출 용매의 선택은 매개 변수 최적화를 위한 첫 번째 중요한 과정이다. 에탄올 농도에 따른 추출 수율을 조사하기 위해 여러 가지 농도의 에탄올을 사용하였으며, 결과는 도 9와 같았다. 아가위 열매의 수율은 에탄올 농도를 30%(27.56 mg/100g)에서 70%(46.12 mg/100g)까지 하였을 때, 에탄올 농도의 증가에 따라 비례적으로 상승하였다. 그러나 70%부터 90%까지는 증가폭이 매우 작게 나타났다. 수율과 비용을 감안할 때, 70% 에탄올을 적합한 용매로 선정하였다 (도 9).

(2) 용매량

용매와 시료 비율은 상업적인 추출 공정에서 또 다른 주요 요소이다. 일반적으로 용매의 양이 많을수록 성분들을 더 효과적으로 용해할 수 있으며, 추출 수율도 높아지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이것은 용매의 낭비를 초래한다. 반대로 적은 양의 용매를 사용할 경우에는 목적하는 성분의 추출 수율도 낮아지는 결과를 가져온다.

본 발명에서는 최적의 용매와 시료 비율을 산정하였다. 도 10에 아가위나무 열매의 추출 수율에 대한 용매와 시료의 비율 효과를 나타내었다. 다른 조건들을 고정한 조건에서 추출효율은 시료에 대한 용매의 비율이 커질수록 증가하였으며, 특히 5:1(10.2%)에서 20:1(17.2%)의 구간에서 뚜렷하게 나타나, 시료에 대해 15배의 용매량을 최적 조건으로 하였다 (도 10).

(3) 추출시간

추출 시간 또한 추출 수율에 영향을 미친다. 식물 세포에서 목적하는 성분들이 안팎으로 평형을 이루기 전까지는 추출 수율은 시간에 비례하여 증가한다. 하지만, 평형에 도달한 이후에는 더 이상 증가하지 않는다. 추출 수율에 대한 시간의 영향을 조사하기 위해 1~12시간까지 실험하였다. 결과는 도 11과 같았다. 수율은 시간에 따라 빠르게 증가하였으며, 6시간에서 18.7%에 도달하였다(도 11).

(4) 추출 온도

온도는 열에 민감한 성분의 추출 시 중요한 요소이다. 목적하는 성분의 용해 정도는 온도, 용매 확산 속도와 물질 이동 변화의 증가에 따른다. 그 사이에 불순물의 용해도가 증가할 수 있고, 열에 불안정한 성분들이 분해될 수도 있다. 본 실험에서는 추출을 여러 가지 온도(40~80℃)에서 실시하고 다른 조건들은 고정하였다. 아가위 열매의 추출 수율에 대한 온도의 효과는 도 12와 같았다. 수율은 추출 온도가 40℃에서 60℃로 상승했을 때 10.3%에서 16.7%로 급격히 증가하였고, 반면에 온도가 60℃에서 80℃로 상승하였을 때에는 수율에 큰 영향을 미치지 않았다(도 12).

(5) 최적 추출조건 도출을 위한 실험 설계

아가위 열매의 추출조건을 최적화하기 위해서 MiniTab(MiniTab 16, Minitab Inc., State college, PA, USA) 소프트웨어를 통해 반응표면분석법을 사용하였다. 추출조건에 대한 실험계획은 Box-Behnken design을 사용하였으며, 표 4와 같이 에탄올 농도(X1), 추출 온도(X2), 추출시간(X3)을 아가위나무 열매 추출공정에서의 중요 변수로 선택하여 각 독립변수를 1, 0, 1의 3수준으로 부호화하고, 15구간의 추출실험계획을 설정하여 실험계획을 설계하였다.

Run	Coded variable levels			Extraction yield
Run	X₁	X₂	X₃
1	50	40	6	16.1
2	50	60	9	16.0
3	70	60	6	18.8
4	70	40	3	17.2
5	30	80	6	18.2
6	70	80	3	17.6
7	70	60	6	18.8
8	30	60	3	16.6
9	50	60	3	15.9
10	70	60	6	18.8
11	30	40	6	15.0
12	30	60	9	16.8
13	70	40	9	17.5
14	50	80	6	17.3
15	70	80	9	18.1

(6) 최적 추출 조건 도출

Box-Behnken design에 따른 15개 구간에서 아가위나무 열매 추출수율을 측정한 결과는 15.9~18.8%의 범위로 측정되었으며, MiniTab 16 program을 이용하여 각각의 변수의 최적화된 값을 결정하고 변수들 간의 상호작용을 분석하여 3차원 반응표면과 2차원 등고선 그래프로 나타내었다(도 13, 도 14).

본 발명에서 MiniTab 16 program을 사용하여 산출된 아가위나무 열매의 최적 추출조건은 에탄올 농도 75.7%, 추출온도 72℃, 추출시간 6시간10분으로 확인되었으며, 추출 수율의 최대값은 20.14%로 예측되었다 (도 13, 도 14).

Claims

아가위 열매에 75.7 %(v/v) 에탄올 수용액을 추출용매로 하여 72 ℃에서 6시간 10분 동안 초음파를 가하여 추출하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물의 제조방법.
아가위 열매에 75.7 %(v/v) 에탄올 수용액을 추출용매로 하여 72 ℃에서 6시간 10분 동안 초음파를 가하여 추출하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물의 제조방법.
삭제
삭제