KR20230036755A - 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 증숙 발효 추출물 - Google Patents

색소침착 방지 또는 자외선 보호용 증숙 발효 추출물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 증숙 발효 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 아치오테 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와 티로시나제 활성과 멜라닌 생성 감소능을 발현하는 효과가 있다.

Description

색소침착 방지 또는 자외선 보호용 증숙 발효 추출물 {STEAM FERMENTATION EXTRACT FOR PREVENTING PIGMENTATION OR PROTECTING UV}
본 발명은 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 증숙 발효 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아치오테(Bixa orellana)를 포함하는 추출물을 유효성분으로 하여 색소침착 방지능, 자외선 보호능을 발현하는 조성물에 관한 것이다.
피부 색상은 피부에 존재하는 갈색 색소인 멜라닌의 양 및 유형에 의해 일차적으로 결정된다. 적은 양의 멜라닌은 밝은 피부 색상을 야기하는 반면, 많은 양의 멜라닌은 짙은 피부 색상을 야기한다. 또한, 피부의 과도한 색소침착은 피부 내 멜라닌의 과발현 또는 축적에 의해 야기된다. 그 결과, 멜라닌 생성에 관여하는 경로는 생성된 수준을 감소시키도록 하는 많은 억제제에 대한 표적이 되어 왔다. 멜라닌 경로에 관여된 주요 효소 중 하나는 티로시나아제이다.
멜라닌의 합성은 전구체 프로오피오멜라노코르틴으로부터 생성되는 멜라닌세포 자극 호르몬 및 부신피질자극 호르몬 펩티드를 포함하는 호르몬 조절 하의 과정이다. 이것은 UVB-방사에 의해 야기되는 DNA 손상 등에 의해 촉진되며, 이후 오랜 시간 태양에 대한 노출은 피부에서 많은 생화학적 반응을 유도하여 일광화상 및 태닝을 야기할 수 있다. 태양에 대한 노출의 다른 결과는 시간에 따라 축적된다. 상기 변화는 검버섯 발달을 야기하고 불균일한, 얼룩덜룩한 피부톤이 될 수 있어 피부 내 색소 함량의 발현을 변형하기 위한, 균일한 피부톤 또는 피부톤의 라이트닝을 촉진하기 위한 능력이 요구된다.
이로 인해 효과적인 조성물을 개발하고자 하는 노력이 티로시나아제의 활성 억제제에 집중되었다. 예를 들어, 다양한 티로시나아제 억제제, 예컨대 그 중에서도 히드로퀴논, C, 시스테인, 코즈산, 아르부틴 및 글루타티온이 국소 조성물에 제안되어 왔다. 또한, 다양한 피부과학적 조성물이 기미, 주근깨, 백반증, 얼룩백색증, 페닐케톤뇨증, 등에서 관찰되는 것과 같은 색소 질환의 외양 개선을 위해, 및/또는 화장 목적을 위해 제안되어 왔다.
또한, 피부 표백 조성물의 사용이 널리 확산된다. 그러나, 이들은 멜라닌을 파괴하거나 이의 형성을 억제한다. 이중 많은 것은 퍼옥시드, 산 또는 포름알데히드, 또는 티올화 물질과 같은 유해한 화학물질을 함유한다.
비정상 색소와 관련된 질환에 대항하거나 피부톤을 라이트닝하기 위해, 피부에 국소 적용되는 경우 티로시나아제 활성을 감소시켜 따라서 멜라닌 생성을 제한할 수 있는 다양한 화합물이 제안되었으나 특정 국소 작용제의 자극성 부작용 등이 문제점으로 대두되고 있다.
한편, 아치오테(Bixa orellana)는 빅사케아에(Bixaceae) 과, 빅사(Bixa) 속에 속하는 관목이다. 이 관목의 추출물의 미용 적용에서 미백 효과에 대해서는 일본특허 제08-012563호에 기재되어 있다. 종자의 기름진 추출물은 보습제로서의 용도가 프랑스특허 제2798591호에 기재되었다. 그러나, 색소침착 방지 또는 자외선 보호와 관련하여 아치오테(Bixa orellana)에 대해 개시되거나 공개된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 아치오테(Bixa orellana), 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)를 사용한 혼합물로부터 색소침착 방지효과, 자외선 보호 효과를 발현할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 아치오테(Bixa orellana)를 포함하는 고상의 증숙 건조물에 발효균주를 접종하여 얻어진 증숙 발효 추출물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소침착 방지능, 자외선 보호능을 발현하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기 설명된 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
아치오테(Bixa orellana), 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)를 이용한 고상의 증숙 건조물에 발효균주를 접종하여 얻어진 고상의 증숙 건조물에 발효균주를 접종하여 얻어진 증숙 발효 추출물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물을 제공한다.
상기 아치오테(Bixa orellana), 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)는 아치오테(a) : 레이스 플라워(b) : 민감초(c)가 1:0.25~2:0.5~1.0 중량비를 만족할 수 있다.
상기 증숙 발효 추출물은 90 내지 110℃에서 1 내지 48시간 증숙한 증숙물을 35 내지 75℃에서 1 내지 24시간 건조시켜 수분함량이 10% 이하인 증숙 건조물의 발효 추출물일 수 있다.
상기 발효균주는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 증숙 발효 추출물은 환류추출 용매를 사용하여 리플럭스 하에 70 내지 100℃ 에서 2 내지 5 시간 동안 추출할 수 있다.
상기 환류추출 용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을, 발효물 무게 대비 5 내지 20배로 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과, 티로시나제 활성과 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 발현하는 아치오테 유래 증숙 발효 추출물을 유효성분으로 하는 색소침착 방지 및 자외선 보호를 위한 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 수득된 샘플(BAG-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(BAG-1 내지 BAG-3)의 4종에 대한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성을 대비한 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 수득된 샘플(BAG-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(BAG-1 내지 BAG-3)의 4종에 대한 티로시나제 활성을 대비한 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 수득된 샘플(BAG-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(BAG-1 내지 BAG-3)의 4종에 대한 멜라닌 생성정도를 대비한 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 수득된 샘플(BAG-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(BAG-1 내지 BAG-3)의 4종에 대한 세포독성을 대비한 그래프이다.
이하 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 점을 감안하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 아치오테(Bixa orellana), 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)를 이용한 증숙 발효 추출물의 분말이나 추출물을 제조할 경우 그 분말이나 추출물이 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화능과, 티로시나제 활성에 따른 멜라닌 생성 감소능을 동시에 발현함으로써, 색소 침착 방지 및 자외선 보호를 위한 조성물을 제공할 수 있다.
에탄올 상온교반 추출물, 에탄올 발효 추출물, 혹은 증숙 추출물 등은 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와, 티로시나제 활성에 따른 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 나타내지 않았으며, 또한 아래의 실험예에서 제시되어 있지 않지만, 아치오테(Bixa orellana)의 함량, 레이스 플라워(Ocimum Ocimum basilicum basilicum)의 함량, 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)의 합량이 1:0.25~2:0.5~1.0의 중량비를 만족하지 못하는 경우에도 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와, 티로시나제 활성에 따른 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 나타내지 않거나 효과가 감소하였다.
본 발명의 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와, 티로시나제 활성에 따른 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 구현하는 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물은 아치오테(Bixa orellana)에 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)의 1:0.25~2:0.5~1.0의 중량비로 혼합한 다음 수득한 고상물(solid phase product)의 증숙 건조물에, 발효균주를 접종하여 얻어진 증숙 발효 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 기재에서 유효성분은 달리 특정하지 않는 한, 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 기재에서 추출물은 달리 특정하지 않는 한, 추출 대상인 그 고상물 자체를 추출용매를 이용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초임계 추출, 초고압 추출 등의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합, 정치시켜 얻은 분획물, 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다.
상기 고상물은 아치오테(Bixa orellana)와, 레이스 플라워(Ammi majus) 그리고 민감초(Glycyrrhiza glabra)를 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에 파쇄한 다음 증숙에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 아치오테, 레이스 플라워, 민감초는 달리 특정하지 않는 한, 다양한 기관 또는 부분(예 잎, 가지, 꽃, 뿌리, 줄기, 열매 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 각각의 잎 또는 열매로부터 얻은 추출물이고, 가장 바람직하게는 각각의 잎으로부터 얻은 추출물을 의미한다.
본 발명에서 레이스 플라워(Ammi majus)는 미나리과의 아미근속에 속하는 식물로, 잎과 열매는 백반증 등 피부질환 치료에 효능을 갖는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 민감초(Glycyrrhiza glabra)는 한약재료로서 사용되는 식물이며, 트리터펜(triterpene)계 사포닌, 글리시리진(Glycyrrhizin), 리퀴리틴(Liquiritin), 아스파라긴(Asparagin), 글루탐산(Glutamic acid) 및 포도당 등을 함유하고 있다. 감초의 감미 성분인 글리시리진산의 2-글루쿠론(glucuron)산 배당체인 글리시리진은 약물중독, 식물중독 또는 체내대사물의 중독에 대한 해독 작용뿐만 아니라 세균 소독 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 분쇄물 형태 그대로, 또는 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용될 수 있으며, 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용할 경우 보관의 유용성 및 유효성분의 증대 효과를 제공할 수 있다.
본 기재에서 증숙 추출물은 달리 특정하지 않는 한, 90 내지 110℃, 또는 95 내지 105℃에서 1 내지 48시간, 또는 1 내지 10시간 동안 증숙한 증숙물을 35 내지 75℃, 또는 40 내지 60℃에서 1 내지 24시간, 또는 6 내지 15시간 동안 건조시켜 수분함량이 10% 이하인 증숙 건조물일 수 있다. 이 경우에 유효성분의 증대 효과를 제공할 수 있어 바람직하다.
이때 상기 증숙을 위해 통상의 증숙 장치를 사용할 수 있으며, 건조를 위해 열풍 건조기 등의 통상의 건조 장치를 이용할 수 있고, 수분함량 조절을 위한 건조를 위해 동결 건조기 등의 통상의 건조 장치를 이용할 수 있다.
본 발명의 증숙 추출물은 바람직하게는 건조 전처리를 통해 수분함량을 20% 이하로 조절한 것을 상기 증숙건조에 이용하여 수득한 것이 바람직하다.
상기 증숙건조는 필요에 따라서는, 다단계로 수행할 수 있다. 일례로 1차 증숙건조에서 증숙시간을 6 내지 15시간으로 하고, 2차 증숙건조에서 증숙시간을 8 내지 15 시간으로 하고, 3차 증숙건조에서 증숙시간을 8 내지 12 시간으로 하여 수행할 수 있다.
상기 증숙건조물은 발효균주를 접종한다.
본 발명에서, 상기 발효균주는 아래의 실시예에서 사용된 Bifidobacterium longum(KACC 20597), Lactobacillus acidophilus(KACC 12419), Leuconostoc mesenteroides)(KACC 12312)의 혼합물인 것인 색소침착 방지 및 자외선 보호용 조성물을 제공하기에 바람직하며, 이외에도 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 등도 대체 혹은 배합하여 사용할 수 있고, 사용량은 104 내지 107 CFG/g, 구체적인 예로 105 내지 106 CFG/g 범위 내일 수 있다.
본 발명에서, 상기 접종 후의 배양은 15 내지 45℃, 또는 25 내지 45℃에서 수행될 수 있다. 배양온도가 상기 범위보다 낮을 경우 발효 속도가 느려지거나 원치않는 부산물이 생겨날 수 있으며, 배양 온도가 상기 범위보다 높은 경우에도 발효 미생물의 사멸에 따라 마찬가지로 발효 속도가 느려지거나 원치않는 발효 부산물이 생겨날 수 있다. 배양 시간은 1일 내지 7일 정도, 또는 2일 내지 5일 정도 수행될 수 있다.
또한, 추출의 온도 및 압력 조건에 따라 유효성분의 성질 변화가 가능하다. 예를 들어 증숙 발효 추출액을 저온조건으로 추출한 경우, 유효성분에 대한 용해력이 떨어져 추출물 중 당의 농도가 높아지게 되고, 유효성분 추출조건에 적합한 고온조건으로 추출하는 경우에도 추출 초반부의 추출물을 분획하여 별도 구분하면 후반부 추출물에 비해 유효성분 농도가 높아지게 된다. 이런 추출 방법에서 분획시점을 조정하여 유리지방산 함량과 유효성분 함량의 조절이 가능한데, 유리지방산 함량이 낮은 즉, 산가가 낮은 추출물을 얻기 위해서는 원료의 유리지방산 함량이 낮거나 유효성분의 함유량이 높은 분획구간을 섞어 농축 정도를 낮추는 방법이 있다.
원료의 유리지방산 함량은 원산지나 작황에 따라 차이가 발생하며 보통 낮은 산가의 원료는 높은 가격으로 형성되어 있기 때문에 원료 경쟁력에서 떨어지게 된다. 게다가 유리지방산이 없는 원료는 없기 때문에 추출물 농축 분획구간에는 유리지방산이 농축되어 낮은 산가의 원료를 사용하는 규격을 설정하고 제품을 만든다고 해도 어느 농도 이상의 유효성분 함량을 충족하면서 산가 규격을 충족시키는 것이 쉬운 일은 아니다. 이에 증숙 발효 추출액을 이용하여 고농도 분획물을 만드는 공정이 산업적 안정성을 갖기 위해서는 리플럭스 하에 반복 추출(환류 추출이라고도 함)하여 유리지방산을 제거하는 기술이 필요하다.
상기 환류 추출은 70 내지 100℃ 하에, 또는 85 내지 95℃ 하에 12시간 이하, 또는 3 내지 10시간 동안 반복하여 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.
상기 환류추출할 경우, 발효물에 추출용매를 공급하여 처리 효율을 높이는 것이 바람직하며, 이때 사용가능한 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 이때 추출용매를 상기 발효물의 무게 대비 5 내지 20배, 또는 8 내지 15배로 포함할 수 있다.
전술한 유리지방산은 제거하되 유효성분 손실은 없으며 효능에 영향을 주지 않는 정제 공정이 필요하며, 이를 위하여 미세 여과막을 사용하여 여과한 다음 감압 농축하여 유리지방산을 제거하는 방법이 바람직하고, 보다 우수한 효능효과를 제공하도록 미세 여과막은 1.0 ㎛ 이하, 바람직하게는 0.45 ㎛ 이하의 여과막을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
전술한 정제 공정을 거쳐 유효 추출물을 수득할 수 있다.
본 기재에서 유효 추출물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압농축 등의 방식으로 환류 추출용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고상의 추출물이 포함된다.
본 기재에서, 결과 추출물의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 환(pills) 형태, 과립 형태, 가루 형태를 비롯한 분말 또는 기타 추출물 형태일 수 있다.
본 기재에 따른 추출물 제조방법은, 일례로 아치오테(Bixa orellana)와, 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)를 깨끗이 세정한 다음 수득된 고상물 또는 그 건조물을 증숙 건조하는 단계; 및 증숙 건조물을 발효균주로 접종하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 기재에서 상기 아치오테(Bixa orellana)와, 레이스 플라워(Ammi majus) 그리고 민감초(Glycyrrhiza glabra)은 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에(고상물의 수분 함량이 10%(w/w) 이하가 되도록 분쇄물 형태로) 10 내지 50 메쉬, 구체적으로는 30 내지 50 메쉬로 파쇄하여 표면적을 높인 다음 발효 전처리에 사용될 수 있다.
필요에 따라서는 95℃ 이하, 또는 50 내지 90℃에서 36시간 이상, 또는 48시간 이상 건조한 다음 분쇄할 수 있다.
상기 고상물은 환류 추출하기에 앞서 발효추출 단계를 수행할 수 있다.
본 기재에서 사용되는 고상물에는 특별한 제한이 없으며, 해당 발효추출 단계는 고상물 또는 그 건조물('고상의 건조물'이라고도 함)의 표면에 있는 미생물, 잔류농약, 보존제 등의 유해물질을 제거하기 위한 처리, 추출 면적을 증가시키기 위한 처리 등을 포함할 수 있다.
상기 발효추출할 경우, 발효균주로는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
이어서, 발효 추출물을 환류 추출용매를 이용하여 리플럭스 하에 반복 환류추출을 수행할 수 있다. 이때 70 내지 100℃ 하에, 구체적으로 85 내지 95℃ 하에 12시간 이하, 구체적인 예로 1 내지 6시간 동안 반복 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.
상기 증숙 발효 추출물은 앞서 설명한 정제 및 감압 농축하여 환류 추출용매를 제거하고 유효 추출물을 분리해낼 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 유효성분 이외에 피부 관련 활성을 보강 또는 추가하기 위하여 당업계에 공지된 피부 미백 성분, 피부 주름 개선 성분, 피부 탄력 개선 성분, 자외선 보호 성분, 피부 보습 성분 등을 포함하여 제조될 수 있다.
상기 피부 미백 성분으로 알부틴, 나이아신아마이드, 아스코빌글루코사이드, 알파-비사보롤, 유용성 감초 추출물 등을 들 수 있다.
상기 피부 주름 개선 성분으로 레티놀, 레티닐 팔미테이트, 아데노신, 폴리에톡실레이티드아마이드 등을 들 수 있다.
상기 자외선 보호 성분으로서는 드로메트리졸, 드로메트리졸트리실록산, 디갈로일트리올리에이트, 디메치코디에칠벤잘말로네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 소나무 껍질 추출물 등의 복합물, 포스파티딜세린, 핑거루트 추출 분말, 홍삼과 산수유 등의 복합 추출물 등을 들 수 있다.
상기 보습 성분으로 AP 콜라겐 효소 분해 펩타이드, 콜라겐 펩타이드, N-아세틸글루코사민, 곤약 감자 추출물, 민들레 등의 복합 추출물, 쌀겨 추출물, 옥수수 배아 추출물, 저분자 콜라겐 펩타이드, 지초 추출 분말, 포스파티딜세린, 히알루론산 등을 들 수 있다.
기타 피부 미백 성분, 주름 개선 성분, 자외선 보호 성분, 피부 보습 성분들에 대해서는 화장품법에 따른 기능성화장품공전(식약처고시 "기능성화장품 기준 및 시험방법"), 건강기능식품에 관한 법률의 건강기능식품공전(식약처고시 "건강기능식품 기준 및 규격)을 참조할 수 있다. 이러한 성분들은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 유효성분을 제품 유형, 제품의 제형 등에 따라 색소침착 방지효과, 자외선 보호 효과 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 함량 (유효량)으로 포함할 수 있는데, 해당 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 15 wt% 범위 내에서 결정될 수 있다.
본 발명에서 유효량은, 달리 특정하지 않는 한 그 적용 대상인 포유동물, 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 색소침착 방지효과, 자외선 보호 효과등 의도한 의료적/화장품학적 효과 등을 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 발모효과 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다.
제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성, 모발 멜라민 합성 등을 나타내는 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 수행되는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 기능상의 구분에 있어서 제조/유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 건강기능식품에 관한 법률에 따른 건강기능 식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해되는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 복용되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시, 식품첨가물 기준 및 규격)에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 화학적 합성품, 천연 첨가물, 혼합 제제류로 구분하여 한정적으로 규정되어 있다.
이들 식품첨가물은 기능적 측면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수도 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다.
합성 풍미제도 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.
산미료로는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타 식품첨가물과 관련하여서는 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 약제학적 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 약제학적으로 허용이란, 달리 특정하지 않는 한 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 적합한 담체로는, 일례로 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다.
주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다.
비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001 mg/kg 내지 10 g/kg 범위, 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 화장료 조성물, 식품 조성물, 약제학적 조성물은 해당 분야에 공지된 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에서 통상적으로 행하여지는 해당 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
본 기재의 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물을 설명함에 있어서, 명시적으로 기재하지 않은 다른 조건이나 장비 등은 당업계에서 통상적으로 실시되는 범위 내에서 적절히 선택할 수 있고, 특별히 제한되지 않음을 명시한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정하는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1> 증숙발효 아치오테 추출물의 제조
(1) 아치오테(Bixa orellana) 잎, 레이스 플라워(Ammi majus) 잎 및 민감초(Glycyrrhiza glabra) 잎을 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 100 ℃로 6시간 증숙한 다음 50 ℃에서 12시간 동안 자연건조 시켰다.
(2) 건조된 원료를 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(3) 상기 혼합한 증숙 건조물에 Bifidobacterium longum(KACC 20597), Lactobacillus acidophilus(KACC 12419), Leuconostoc mesenteroides)(KACC 12312)을 각각 106 CFU/g의 농도로 접종하여 37 ℃에서 3일간 발효시킨 다음 원심분리하여 상등액을 취하였다.
(4) 그런 다음 증숙 발효물 총 무게 대비 10 배의 70% 에탄올을 투입하고 90 ℃에서 8시간동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.
(5) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 증숙발효 아치오테 추출물(샘플 BAG-4)을 제조하였다.
<비교예>
<비교예 1> 상온교반 아치오테 추출물의 제조
(1') 아치오테(Bixa orellana) 잎, 레이스 플라워(Ammi majus) 잎 및 민감초(Glycyrrhiza glabra) 잎을 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조시켰다.
(2) 건조된 원료를 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(4') 상기 고상의 건조물 총 무게 대비 10 배의 70% 에탄올을 투입하고 상온에서 200 rpm으로 12시간, 총 3회 반복하여 추출하였다.
(5) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 진공 및 상압에서 농축하여 상온교반 아치오테 추출물(샘플 BAG-1)을 제조하였다.
<비교예 2> 초음파 아치오테 추출물의 제조
(1') 아치오테(Bixa orellana) 잎, 레이스 플라워(Ammi majus) 잎 및 민감초(Glycyrrhiza glabra) 잎을 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조시켰다.
(2) 건조된 원료를 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(4”) 상기 고상의 건조물 총 무게 대비 10 배의 70% 에탄올을 투입하고 40 kHz로 2시간 초음파 추출하였다.
(5) 수득된 초음파 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 진공 및 상온에서 농축하여 초음파 아치오테 추출물(샘플 BAG-2)을 제조하였다.
<비교예 3> 증숙 아치오테 추출물의 제조
(1) 아치오테(Bixa orellana) 잎, 레이스 플라워(Ammi majus) 잎 및 민감초(Glycyrrhiza glabra) 잎을 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 100 ℃로 6시간 증숙한 다음 50 ℃에서 12시간 동안 자연건조 시켰다.
(2) 건조된 원료를 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(4') 증숙 건조물 총 무게 대비 10배의 70% 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.
(5) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 진공 및 상온에서 농축하여 증숙 아치오테 추출물(샘플 BAG-3)을 제조하였다.
<실험예>
<실험예 1> 항산화활성 시험1
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(BAG-1~4)에 대한 항산화 시험으로 시료의 라디칼 소거능을 평가할 수 있는 ABTS법 및 DPPH법 radical 소거능 실험을 수행하였다.
(1-1) ABTS 라디칼 소거활성
샘플들(BAG-1 내지 BAG-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 암실에서 12시간동안 상온에서 반응시켜 ABTS 양이온을 형성시킨다. 이후 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.02가 되도록 에탄올을 넣어 조절하였다.
96 웰 플레이트에 검액 100 ㎕와 조제한 ABTS 용액 100 ㎕를 가하여 7 분간 실온에서 반응하여 734 nm에서 측정한다. 공시험액과 비교하여 ABTS 소거율을 다음과 같이 백분율(%)로 구하고 하기 도 1에 나타내었다.
ABTS radical 소거능 (%) = [Control - (Sample - Blank)]/Control Х 100
(단, Control : ABTS reagent의 흡광도, Sample : Sample + ABTS reagent의 흡광도, Blank : Sample + Blank의 흡광도)
(1-2) DPPH 라디칼 소거활성
샘플들(BAG-1 내지 BAG-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 96 웰 플레이트에 검액 100 ㎕와 0.2 mM DPPH 100 ㎕를 넣고 30분 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정한다. 공시험액과 비교하여 DPPH radical 소거율을 다음과 같이 백분율(%)로 구하고 하기 도 1에 나타내었다.
DPPH radical 소거능 (%) = [Control - (Sample - Blank)]/Control Х 100
(Control : DPPH reagent의 흡광도, Sample : Sample + DPPH reagent의 흡광도, Blank : Sample + Blank의 흡광도)
하기 도 1에서 보듯이, ABTS radical 분석 결과 대조군인 아스코르브산이 500 ㎍/mL에서 98.2%로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 실시예 1에 따른 샘플(BAG-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 72.3%로 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(BAG-3), 비교예 2에 따른 샘플(BAG-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(BAG-1)의 순서로 500 ㎍/mL에서 각각 68.3%, 64.3%, 59.4%를 나타내었다.
또한, DPPH radical 분석 결과, 전술한 ABTS 분석결과와 같은 경향을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 1에 따른 샘플(BAG-4), 비교예 3에 따른 샘플(BAG-3), 비교예 2에 따른 샘플(BAG-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(BAG-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 각각 75.2%, 71.2%, 67.2%, 63.8%를 나타내었다. 이때 대조군인 아스코르브산은 500 ㎍/mL에서 97.9%로 분석되었다.
<실험예 2> 항산화활성 시험2
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(BAG-1~4)에 대한 항산화 시험으로 SOD 유사활성 및 크산틴 산화효소(Xanthine oxidase) 저해 활성 실험을 수행하였다.
(2-1) SOD 유사활성
샘플들(BAG-1 내지 BAG-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 검액 0.2 mL에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer 2.6 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를 첨가하여 25 ℃에서 10분간 반응한다. 1 N HCl 0.1 mL를 반응시킨 액에 가하여 정지시킨다. 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 흡광도를 측정하여 구한다. 공시험액과 비교하여 SOD 유사활성을 백분율(%)로 구하고 하기 표 1에 나타내었다.
(2-2) 크산틴 산화효소 저해활성
샘플들(BAG-1 내지 BAG-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검색을 조제한다. 검액 1.0 mL에 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 mL, 1 mM xanthine 0.2 mL를 첨가한다. 이후 0.2 U/mL xanthine oxidase 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시킨다. 생성된 uric acid를 292 nm에서 흡광도를 측정하여 구한다. 공시험액과 비교하여 Xanthine oxidase 저해활성을 백분율(%)로 구하고 하기 표 1에 함께 나타내었다.
Extract SOD-like activity(%) Xanthin oxidase Inhibition(%)
100 μg/mL 250 μg/mL 500 μg/mL 100 μg/mL 250 μg/mL 500 μg/mL
Control 94.2±3.8 95.1±3.3 96.9±4.3 98.1±4.1 98.9±3.7 99.1±3.5
BAG-1 11.3±1.8 17.4±1.2 21.8±1.1 14.1±1.8 19.1±2.9 25.2±2.8
BAG-2 12.6±1.5 19.5±2.7 24.3±2.9 16.2±1.9 20.5±1.7 26.5±3.0
BAG-3 15.7±1.7 21.1±1.9 29.4±2.1 19.2±2.1 22.4±1.7 28.4±2.7
BAG-4 19.2±2.6 24.5±2.3 32.1±2.5 22.7±1.1 26.1±2.1 31.4±2.6
*대조군: 아스코르브산
상기 표 1에서 보듯이, SOD 유사활성 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(BAG-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 32.1 %로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(BAG-3), 비교예 2에 따른 샘플(BAG-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(BAG-1)의 순서로 500 ㎍/mL에서 29.4 %, 24.3 %, 21.8 %를 나타내었다. 모든 실험물질은 농도의존성으로 소거활성이 분석되었으며, 대조군인 ascorbic acid보다는 모두 낮은 것으로 분석되었다.
또한, 크산틴 산화효소 저해활성 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(BAG-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 31.4 %로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(BAG-3), 비교예 2에 따른 샘플(BAG-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(BAG-1)의 순서로 500 ㎍/mL에서 28.4 %, 26.5 %, 25.2 %를 나타내는 것으로 분석되어, 전술한SOD 유사활성의 분석 결과와 동일한 경향성을 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 멜라민 시험1
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(BAG-1~4)에 대한 티로시나제 활성 실험을 수행하였다. Tyrosinase는 melanin 생합성에 관여하는 효소로, 미백 성분들은 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다.
구체적으로, 악성흑색종 세포(B16F10, ATCC)를 1Х104 cell/ml 씩 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 조건하에서 24 h 전 배양 후 100 nM α-MSH가 포함된 배지로 교환하였다. 이후 농도별 샘플들(BAG-1 내지 BAG-4)과 대조군(물)을 각각 첨가하여 3일간 배양하고 10 mM PBS로 세척 하였으며, 1% Triton X-100을 함유한 10 mM PBS에 현탁 시킨 후, 5분간 원심 분리하여 상층액을 활성측정 효소액으로 사용한다. 96 well plate에 이 효소액을 40 ㎕ 넣고 기질인 2 mg/mL 농도의 3,4-Dihydroxyphenylalanine(L-dopa) 100 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응을 진행시킨 뒤, ELISA reader를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정 하였다. tyrosinase의 활성도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하여 하기 도 2에 나타내었다.
하기 도 2에서 보듯이, 티로시나제 활성 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(BAG-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 54.1 %로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(BAG-3), 비교예 2에 따른 샘플(BAG-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(BAG-1)의 순서로 500 ㎍/mL에서 57.5 %, 64.2 %, 65.6 %를 나타내었다. 모든 실험물질은 농도의존적으로 티로시나제의 활성을 저해시켰으며, 대조군 대비 모두 감소한 것으로 분석되었다.
<실험예 4> 멜라닌 시험2
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(BAG-1~4)에 대한 멜라닌 생성 정도를 확인하는 실험을 수행하였다. Melanin은 자외선에 노출 되거나 외부 자극에 의하여 생성되며 기지, 주근깨, 검버섯 등 피부장애 및 노화를 유발시킨다. Melanin은 tyrosinase 효소의 생합성을 통하여 생성되며, tyrosinase의 활성을 억제하는 것으로 Melanin 생성을 억제할 수 있다.
구체적으로, 실험물질(BAG-1~4)을 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제 한다. 악성흑색종 세포(B16F10, ATCC)를 1Х104 cell/ml 씩 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 조건하에서 24 hr 전 배양 후 100 nM α-MSH가 포함된 배지로 교환하였다. 이후 농도별 실험물질과 대조군(물)을 각각 첨가하여 3일간 배양하고 10 mM PBS로 세척 하였으며, 1% Triton X-100을 함유한 10 mM PBS에 현탁 시킨 후, 5분간 원심 분리하여 상등액을 제거한다. 이후 1 N NaOH 200 ㎕를 첨가하고 55 ℃에서 2 hr 방치하여 멜라닌을 녹여내어 405 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성량(%)을 계산하여 하기 도 3에 나타내었다.
하기 도 3에서 보듯이, 멜라닌 생성량 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(BAG-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 대조군 대비 43.2 %로 가장 낮게 확인되었고, 비교예 3에 따른 샘플(BAG-3), 비교예 2에 따른 샘플(BAG-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(BAG-1)의 순서로 500 ㎍/mL에서 46.4 %, 50.2 %, 52.1 %를 나타내었다.
모든 샘플들이 대조군 대비 멜라닌 생성량이 감소한 것을 알 수 있었으며, 상기 분석결과는 전술한 티로시나제 저해 활성의 경향성과 일치한 것으로 확인되었다.
<실험예 5> 안전성 시험
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플(BAG-1~4)에 대한 안전성을 평가하기 위하여 마우스흑색종 세포에 실험물질(BAG-1~4)의 세포독성을 확인하기 위하여 MTS 분석을 진행하였다. 실험물질의 농도는 100 내지 500 ㎍/mL로 설정하였으며, 마우스흑색종 세포(B16F10, ATCC) 세포를 배양하여 시험물질의 세포독성을 확인하였다.
구체적으로는, 마우스흑색종 세포(B16F10, ATCC)를 1Х104 cell/ml씩 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 조건하에서 24 hr 전 배양 후 100 nM 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)과 100 내지 500 ㎍/mL 농도의 샘플들(BAG-1~4)과 대조군(물)을 첨가하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 MTS 시약 20 ㎕를 넣고 2시간 동안 배양 후, microplate reader를 이용하여 570 nm에서 ELISA reader (EpochTM 2, BioTek, USA)로 흡광도를 측정하였다.
세포생존율(cell viability)을 하기 식 1을 사용하여 계산하고, 하기 도 4에 결과를 나타내었다.
[식 1]
세포 생존율(%) = [(Exp. - Blank)/Control] Х 100
(상기 식 1에서, Exp: 세포를 포함한 추출물의 흡광도, Blank: 세포를 포함하지 않은 추출물의 흡광도, Control: 세포를 포함한 증류수의 흡광도이다.)
하기 도 4에서 보듯이, 마우스흑색종 세포에서 세포독성 분석 결과, 모든 농도에서 세포생존율이 95 % 이상인 것을 확인하였다.
따라서, 실시예 1에 따른 샘플(BAG-4), 비교예 3에 따른 샘플(BAG-3), 비교예 2에 따른 샘플(BAG-2), 비교예 1에 따른 샘플(BAG-1)에서는 100 내지 500 ㎍/mL농도에서 모두 세포독성이 없는 것을 알 수 있다.
결론적으로, 아치오테(Bixa orellana), 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)를 이용한 고상의 증숙 건조물에 발효균주를 접종하여 얻어진 증숙 발효 추출물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 경우, 수득된 조성물은 ABTS, DPPH 자유 라디칼 소거활성과 SOD 유사활성이 우수하여 항산화 효과가 탁월하며, 티로시나제 활성과 멜라닌 생성 감소 등으로 색소침착 방지효과, 자외선 보호 효과를 필요로 하는 적용처에 적합함을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 아치오테(Bixa orellana), 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)를 이용한 고상의 증숙 건조물에 발효균주를 접종하여 얻어진 고상의 증숙 건조물에 발효균주를 접종하여 얻어진 증숙 발효 추출물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아치오테(Bixa orellana), 레이스 플라워(Ammi majus) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra)는 아치오테(a) : 레이스 플라워(b) : 민감초(c)가 1:0.25~2:0.5~1.0 중량비를 만족하는 것인 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 증숙 발효 추출물은 90 내지 110℃에서 1 내지 48시간 증숙한 증숙물을 35 내지 75℃에서 1 내지 24시간 건조시켜 수분함량이 10% 이하인 증숙 건조물의 발효 추출물인 것인 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 발효균주는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 중에서 선택된 1종 이상인 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 증숙 발효 추출물은 환류추출 용매를 사용하여 리플럭스 하에 70 내지 100℃ 에서 2 내지 5 시간 동안 추출한 것인 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 환류추출 용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을, 발효물 무게 대비 5 내지 20배로 포함하는 것인 색소침착 방지 또는 자외선 보호용 조성물.
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