KR20180031917A - 미생물을 이용한 생물전환 화합물의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 미생물을 이용하여 각종 화합물 및 추출물에 대한 생물전환 화합물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법을 이용하면 다양한 화합물 및 추출물을 기질로 하여 빠른 시간 내에 생물전환 화합물을 간편하게 생산할 수 있으며, 생성된 생물전환 화합물은 분리 및 정제가 용이하다.

Description

미생물을 이용한 생물전환 화합물의 생산 방법{A METHOD FOR PRODUCING BIOCONVERSION DERIVATIVES USING MICROORGANISMS}
본 발명은 다양한 미생물을 이용하여 각종 화합물 및 추출물에 대한 생물전환 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
현대 사회는 환경의 변화로 인하여 신종 감염증과 같은 난치병이 증가하고 있으며, 다양한 성인병으로 고통 받는 현대인이 늘어나고 있는 실정이다. 그러나 천연물 화학에 있어서 새로운 기능성 물질을 확보하는 것이 점점 어려워지고 있으며, 신규 화합물을 탐색할 수 있는 새로운 기술이 필요한 상황이다.
생물전환(bioconversion)이란 미생물이 가지고 있는 효소적 기능을 이용하여 전구물질로부터 원하는 산물을 제조하는 방법을 말하며, 미생물 발효 또는 효소처리 등의 생물학적 방법을 통해 물질의 구조적 변화를 유도한다. 상기 변화로 인하여 유효성분의 함량이 증가하거나 흡수율이 개선되고, 새로운 기능성분의 생성된다. 이러한 생물전환 기술은 항생제, 스테로이드를 포함한 의약품 및 의약품 원료물질의 생산뿐만 아니라 아미노산, 비타민 등의 유용 물질의 생산에 널리 이용되고 있다.
일 예로 홍삼의 조에탄올 추출물(crude extract)로부터 진세노사이드의 일종인 화합물 K를 생산할 수 있는 신규한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 HJ-014(KACC93219P)가 알려져 있으며(특허문헌 1), 이소플라본 아글리콘(aglycone) 제조에 유용하게 이용될 수 있는 이소플라본 전환능이 우수한 유산균이 알려져 있다(특허문헌 2).
그러나 기존의 생물전환 기술은 미생물을 배지에서 배양한 후 유도체를 수거하는 방법을 이용하기 때문에 시간 및 비용이 많이 소모되고, 원하는 유도체 이외의 화합물들이 생성되며, 목적 유도체의 분리 및 동정에 복잡한 과정이 필요한 문제점이 있었다.
본 발명자들은 미생물을 배지에서 배양하지 않으면서 기존에 존재하는 천연 화합물, 식물 추출물 및 미생물 추출물 등을 이용하여 다양한 생물전환 화합물을 제조할 수 있는 생물전환 방법을 개발하였다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0086498호 대한민국 공개특허 제10-2015-0079234호
본 발명의 일 양상은
a) 미생물을 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계;
b) 상기 배양한 미생물을 글리세롤 및 비이온성 계면활성제 중 어느 하나와 인산을 포함하는 완충용액에 현탁시키는 단계;
c) 상기 현탁액과 기질을 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 기질로부터 생성된 생물전환 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 생물전환(bioconversion) 화합물의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은
a) 미생물을 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계;
b) 상기 배양한 미생물을 글리세롤 및 비이온성 계면활성제 중 어느 하나와 인산을 포함하는 완충용액에 현탁시키는 단계;
c) 상기 현탁액과 기질을 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 기질로부터 생성된 생물전환 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 생물전환 화합물의 생산 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "생물전환 화합물"이란 미생물을 이용하여 기질로부터 인산화(phosphorylation) 또는 글리코실화(glycosylation) 등의 구조적 변화를 유도한 화합물을 의미한다. 인산화란 인산화효소(kinase)의 작용에 의하여 인산기(phosphoric acid group, HOPO(OH)O-)가 기질의 수소 원자와 치환됨으로써 기질에 결합하는 것을 의미하며, 글리코실화란 기질에 단당체, 다당체 등의 당류(saccharide)가 첨가되는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서의 용어, "기질(substrate)"이란 효소와 작용하여 화학 반응을 일으키는 특정한 반응 분자나 분자그룹을 말하며, 본 발명에서는 상기 생물전환 화합물의 생성에 있어 전구물질이 되는 화합물 및 추출물을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 기질이 미생물 세포의 내부로 들어간 후 효소와 작용하고, 그 결과 생물전환 화합물이 생성되어 미생물 세포의 외부로 방출된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 a)의 배양 배지(culture medium)는 당업계에서 미생물 배양에 사용되는 공지의 것을 이용할 수 있으며, 글루코스(glucose), 펩톤(peptone) 및 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 4% 글루코스, 0.5% 펩톤 및 0.5% 효모 추출물을 포함하는 배지를 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 a) 단계의 미생물은 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 써모필러스(Streptococcus salivarius subsp . Thermophiilus), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 락티스 변종 락티스(Kluyveromyces lactis var. lactis), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) 및 아스퍼질러스 우사미 시로수사미(Aspergillus usamii mut . Shiro-susamii)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 미생물들은 단독으로 또는 2종 내지 3종의 미생물을 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "완충용액(buffer, 버퍼)"은 외부에서 산이나 염기가 추가되었을 때 영향을 크게 받지 않고 수소이온 농도를 일정하게 유지하는 용액을 말한다. 일반적으로 약한 산과 그 염의 혼합용액, 또는 약한 염기와 그 염의 혼합용액이 완충작용을 하며, 본 발명에서는 인산(phosphoric acid) 및 인산염(phosphate)이 완충작용을 하고 있다. 본 발명에서 인산 완충용액은 pH 5 내지 9 범위인 것이 바람직하며, pH 6.5 내지 8 범위인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 b) 단계의 완충용액은 5 내지 200 mM의 인산염을 포함하는 것이 바람직하며, 10 내지 100 mM의 인산을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 인산염의 농도가 상기 범위보다 낮을 경우 완충 능력이 떨어지고, 인산염의 농도가 상기 범위보다 높을 경우에는 완충용액의 pH가 감소하게 된다. 인산화된 생물전환 화합물의 합성에 있어 미생물은 상기 인산 완충용액의 인산기(phosphoric acid group)를 이용할 수 있으며, 미생물이 자체 생산한 인산기를 이용할 수도 있다.
또한, 상기 b) 단계의 완충용액은 글리세롤 또는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하며, 글리세롤은 0.1 내지 5%인 것이 바람직하고, 0.5 내지 4%의 글리세롤을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 글리세롤은 미생물 세포를 보호하여 상기 c) 단계에서 기질이 미생물 세포 내부로 잘 들어갈 수 있도록 돕는 역할을 한다. 본 발명의 생물전환 방법은 생물전환시에 미생물 배양 배지를 따로 첨가하지 않기 때문에 미생물은 상기 글리세롤을 글루코스로 전환하여 탄소원으로 사용할 수 있다. 아울러, 상기 글리세롤은 글리코실화된 생물전환 화합물의 합성에 있어 당류를 공급하는 역할을 할 수 있다.
또한, 상기 b) 단계의 비이온성 계면활성제는 지방산 모노글리세린 에스테르, 지방산 폴리글리콜에스테르, 지방산 소르비탄에스테르 및 지방산 자당에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 지방산 소르비탄에스테르에는 트윈 20(tween 20), 트윈 40, 트윈 60 및 트윈 80이 있으며, 상기 트윈 80은 0.01 내지 0.5%로 포함되는 것이 바람직하고, 0.03 내지 0.3%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 비이온성 계면활성제는 기질이 미생물 내부로 쉽게 들어갈 수 있도록 돕는 역할을 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "현탁액(suspension)"은 완충용액에 미생물이 분산되어 있는 상태를 의미하며, 구체적으로는 상기 a) 단계의 미생물이 글리세롤 및 트윈 80 중 어느 하나와 인산을 포함하는 완충용액에 분산되어 있는 것을 말한다. 또한, 본 명세서의 용어, "PG 버퍼"는 인산과 글리세롤을 포함하는 완충용액(phosphate glycerol buffer)을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 c) 단계에서 기질은 화합물, 식물 추출물 및 미생물 추출물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 화합물은 플라보노이드(flavonoid), 스틸베노이드(stilbenoid) 및 비타민(vitamin)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 플라보노이드 화합물에는 크리신(chrysin), 제니스테인(genistein), 포르모노네틴(formononetin), 퀘르세틴(quercetin), 바이칼레인(baicalein), 바이칼린(baicalin), 나린제닌(naringenin), 망고스틴(mangostin) 및 플로레틴(phloretin)이 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 스틸베노이드 화합물에는 레스베라트롤(resveratrol)이 있고, 비타민에는 레티노산(retinoic acid) 및 아스코르브산(ascorbic acid)이 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 식물 추출물은 식물의 전체 또는 부분에서 수득한 추출물을 의미하고, 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것일 수 있다. 상기 식물 추출물은 구기자 추출물인 것이 바람직하다.
상기 미생물 추출물은 미생물 배양액 자체 또는 미생물 배양액을 원심분리하여 회수한 미생물 균체를 분쇄하여 수득한 것으로, 방선균 추출물을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 "방선균(Actinomyces)"이란 균사를 방사상으로 신장하여 사상체 형태로 자라는 세균을 말하며, 토양에 일반적으로 존재한다. 동물에 병원성이 없는 스트렙토마이세스(Streptomycetaceae)과 및 병원성이 있는 악티노마이세스과 (Actinomycetaceae)가 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 c) 단계에서 현탁액과 기질을 접촉시키는 단계는 20 내지 40℃의 온도에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 25 내지 35℃의 온도이다. 온도가 20℃보다 낮을 경우 미생물의 대사활동이 저해되어 생물전환이 원활히 이루어지지 않을 수 있으며, 온도가 40℃보다 높을 경우 미생물 세포 내에 존재하는 효소가 활성을 잃을 수 있다.
또한, 상기 c) 단계에서 현탁액과 기질을 접촉시키는 단계는 24시간 내지 72시간 동안 이루어지는 것이 바람직하며, 40시간 내지 60시간 동안 이루어지는 것이 더욱 바람직하다. 접촉 시간이 24시간보다 짧을 경우 미생물 세포 내로 들어간 기질이 효소와 반응하는 시간이 부족하여 생물전환이 충분하게 이루어지지 않을 수 있다. 반면에, 72시간 이상 현탁액과 기질을 접촉시키는 것은 기질이 소모되어 충분히 생물전환이 이루어진 상태이기 때문에 비효율적이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 d) 단계에서 생성된 생물전환 화합물은 아세톤, 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 다이클로로메테인 및 에틸아세테이트와 같은 유기용매를 이용하여 회수할 수 있으며, 아세톤을 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 미생물 현탁액과 기질의 접촉이 끝난 후 아세톤을 첨가하여 볼텍싱(vortexing)하고, 상온에서 방치한 후 원심분리하여 상등액을 수거 및 농축하는 방법으로 생물전환 화합물을 수거할 수 있다.
본 발명의 미생물 생물전환 방법을 이용하면 다양한 화합물 또는 추출물을 기질로 하여 빠른 시간 내에 생물전환 화합물을 간편하게 생산할 수 있으며, 생성된 생물전환 화합물은 분리 및 정제가 용이하다.
도 1은 화합물 라이브러리, 미생물 추출물 및 식물 추출물을 기질로 하는 미생물 생물전환 방법의 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 크리신을 서로 다른 미생물 각각 또는 미생물을 조합하여 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 3은 미생물 KCTC 13416, 3101 및 13588을 조합하여 크리신과 배양한 후 생성된 생물전환 화합물의 HPLC 및 LCMS 분석 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 4는 미생물 KCTC 13588 및 13416을 조합하여 제니스테인과 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 5는 미생물 KCTC 13588 및 13416을 조합하여 레스베라트롤과 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 6은 미생물 KCTC 13588 및 13416을 조합하여 포르모노네틴과 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 7은 미생물 KCTC 13588 및 13416을 조합하여 레티노산과 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 8은 미생물 KCTC 13588 및 13416을 조합하여 아스코르브산과 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 9는 미생물 KCTC 13588 및 13416을 조합하여 구기자 추출물과 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 10은 미생물 KCTC 13588 및 13416을 조합하여 방선균 추출물과 배양한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 11은 PG 버퍼의 조성 변화에 따른 생물전환 화합물의 생성여부를 실험한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미생물 배양
하기 표 1의 식용 미생물을 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에서 분양 받아 GPY 배지(4% 포도당, 0.5% 펩톤 및 0.5% 효모 추출물) 500 ㎖에서 각 미생물의 생육 온도에 맞추어 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득하였다.
KCTC No. 균 주 명 배양 온도 산소 요구성
1 KCTC 3783 Streptococcus salivarius subsp . Thermophilus 37℃ 호기성
2 KCTC 27259 Schizosaccharomyces pombe 25℃ 호기성
3 KCTC 17704 Kluyveromyces lactis var. lactis 25℃ 호기성
4 KCTC 17803 Saccharomyces carlsbergensis 25℃ 호기성
5 KCTC 3116 Pediococcus pentosaceus 30℃ 호기성
6 KCTC 3101 Pediococcus acidilactici 37℃ 호기성
7 KCTC 13186 Leuconostoc citreum 28℃ 호기성
8 KCTC 13416 Lactobacillus sakei 37℃ 호기성
9 KCTC 3625 Bacillus coagulans 37℃ 호기성
10 KCTC 13588 Bacillus amyloliquefaciens 30℃ 호기성
11 KCTC 46039 Aspergillus oryzae 24℃ 호기성
12 KCTC 6089 Aspergillus niger 26℃ 호기성
13 KCTC 3769 Lactococcus lactis subsp . lactis 30℃ 호기성
14 KCTC 6957 Aspergillus usamii mut . Shiro - susamii 24℃ 호기성
실시예 2: 각종 기질에 대한 생물전환 화합물의 생성여부 확인
상기 표 1의 미생물에 의한 생물전환 화합물의 생성여부를 확인하기 위하여 다양한 화합물들을 이용하여 하기와 같이 실험하였다.
상기 실시예 1에서 수득한 미생물 펠렛을 PG 버퍼(50 mM phosphate pH 7.2 및 2% 글리세롤)로 세척하고, PG 버퍼 5 ㎖에 현탁시켰다. 이후 상기 미생물 현탁액에 기질을 첨가하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였으며, 기질로는 크리신(chrysin), 제니스테인(genistein), 레스베라트롤(resveratrol), 포르모노네틴(formononetin), 레티노산(retinoic acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 구기자 추출물 및 방선균 추출물을 이용하였다. 구기자 추출물은 건조된 진도산 구기자 10 g을 믹서기를 이용하여 파쇄하고, 메탄올 500 ㎖를 첨가하여 3일 동안 추출한 후 고압 농축하여 제조하였다. 방선균 추출물은 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 노카디아 시리아시게오르지카(Nocardia cyriacigeorgica) KCTC 39250 균주를 구입하여 배양한 후 파쇄하여 제조하였다.
배양이 끝난 후 상기 배양액에 아세톤 3 ㎖를 첨가하고, 3분 동안 볼텍싱(vortexing)하여 현탁시킨 후 상온(room temperature)에 2시간 동안 방치하였다. 이후 상기 배양액과 아세톤의 혼합 용액을 원심분리하여 상등액을 수거하고, 수거한 상등액을 농축하여 80% 메탄올에 용해시킨 후 HPLC(high performance liquid chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피) 및 LCMS(liquid chromatography-mass spectrometry, 액체 크로마토그래피-질량 분석법)로 생물전환 화합물의 생성여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 것과 같이 배양하는 미생물의 종류에 따라 크리신에서 생성되는 생물전환 화합물의 양 및 종류가 상이한 것을 확인할 수 있었으며, 도 3에 나타난 것과 같이 LCMS로 분석한 결과 인산화 및 글리코실화된 형태의 크리신이 각각 생성된 것을 알 수 있었다. 또한, 도 4 내지 도 8에 나타난 것과 같이 제니스테인과 같은 다른 기질들도 미생물과의 배양에 의하여 생물전환 화합물이 생성된 것을 확인할 수 있었다.
아울러, 도 9에 나타난 것과 같이 구기자 추출물을 기질로 이용한 경우 미생물과의 배양 전에는 존재하지 않던 피크가 새로 생긴 것을 확인하여 생물전환 화합물이 생성되었음을 알 수 있었다. 또한, 도 10에 나타난 것과 같이 미생물 추출물을 이용한 경우에도 생물전환 화합물들이 생성된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 버퍼 조성에 따른 생물전환 화합물의 생성 여부 확인
PG 버퍼의 조성을 변화시킬 경우에도 미생물에 의한 생물전환이 일어나는지 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
PG 버퍼에서 글리세롤 대신 트윈 80(tween 80)을 0.1% 농도로 첨가한 버퍼를 이용하고, 기질로는 제니스테인, 미생물은 KCTC 13588 및 KCTC 13416을 조합하여 이용하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 생물전환 화합물을 생산하였다.
그 결과 도 11에 나타난 것과 같이 트윈 80을 첨가한 경우와 비교하여 글리세롤을 첨가한 버퍼를 이용한 경우에 생물전환 화합물의 생산 정도가 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다(A- 트윈80+미생물+제니스테인; B- 트윈80+제니스테인; C- 글리세롤+미생물+제니스테인; 및 D- 글리세롤+제니스테인).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는 생물전환(bioconversion) 화합물의 생산 방법:
    a) 미생물을 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계;
    b) 상기 배양한 미생물을 글리세롤 및 비이온성 계면활성제 중 어느 하나와 인산을 포함하는 완충용액에 현탁시키는 단계;
    c) 상기 현탁액과 기질을 접촉시키는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계의 기질로부터 생성된 생물전환 화합물을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 미생물은 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 써모필러스(Streptococcus salivarius subsp . Thermophiilus), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 락티스 변종 락티스(Kluyveromyces lactis var. lactis), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) 및 아스퍼질러스 우사미 시로수사미(Aspergillus usamii mut . Shiro-susamii)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 완충용액은 인산염을 5 내지 200 mM 포함하는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 완충용액은 글리세롤을 0.1 내지 5% 포함하는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 비이온성 계면활성제는 지방산 모노글리세린 에스테르, 지방산 폴리글리콜에스테르, 지방산 소르비탄에스테르 및 지방산 자당에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 지방산 소르비탄에스테르는 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60 및 트윈 80으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 트윈 80은 0.01 내지 0.5% 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 기질은 화합물, 식물 추출물 및 미생물 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 화합물은 플라보노이드, 스틸베노이드 및 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 현탁액과 기질을 접촉시키는 단계는 20 내지 40℃의 온도에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 현탁액과 기질을 접촉시키는 단계는 24시간 내지 72시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계에서 생물전환 화합물을 회수하는 단계는 아세톤, 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 다이클로로메테인 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매를 이용하는 특징으로 하는 생물전환 화합물의 생산 방법.

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