KR20220147429A - 구슬말 추출물의 생물전환산물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 구슬말 추출물의 생물전환산물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 구슬말 추출물을 바실러스 sp. JD3-7로 생물전환한 생물전환산물 또는 상기 생물전환산물의 추출물을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이와 관련된 구슬말 추출물의 생물전환 방법 및 여기에 사용되는 발효균주인 바실러스 sp. JD3-7 균주에 관한 것이다.
본 발명의 항균용 조성물은 기존에 거의 활용되지 못했던 생물자원인 구슬말을 활용한 것으로, 프로피오니박테리움 아크네스, 대장균 및 살모넬라 엔테리카에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있다. 특히 여드름의 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스에 대해 높은 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 피부에도 안전하게 사용할 수 있어 기능성, 특히 여드름의 예방, 치료 또는 개선 용도의 화장료의 천연항균소재로서 유용할 것이다.
본 발명의 항균용 조성물은 기존에 거의 활용되지 못했던 생물자원인 구슬말을 활용한 것으로, 프로피오니박테리움 아크네스, 대장균 및 살모넬라 엔테리카에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있다. 특히 여드름의 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스에 대해 높은 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 피부에도 안전하게 사용할 수 있어 기능성, 특히 여드름의 예방, 치료 또는 개선 용도의 화장료의 천연항균소재로서 유용할 것이다.
Description
본 발명은 구슬말 추출물의 생물전환산물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 구슬말 추출물을 바실러스 sp. JD3-7로 생물전환한 생물전환산물 또는 상기 생물전환산물의 추출물을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이와 관련된 구슬말 추출물의 생물전환 방법 및 여기에 사용되는 발효균주인 바실러스 sp. JD3-7 균주에 관한 것이다.
항균제는 세균의 성장을 억제하거나 죽이는 약제를 말하며, 다양한 분야에서 사용되고 있다. 특히, 식품, 화장품 및 의약품의 변질을 막고 그것을 사용 또는 보존하는 동안 그 순도를 유지시키기 위해 항균제가 사용되고 있는데, 이 경우 인체에 해가 없어야 하는 것이 필수조건이며 그 첨가로 인해 품질을 손상시키지 않아야 한다.
항균제는 천연물질을 이용하는 천연항균제와 합성화합물을 이용하는 합성항균제로 구분할 수 있는데, 천연항균제의 경우 천연물질의 한계성인 색상, 냄새, 안정성, 항균 스펙트럼, 제형화 용이성, 경제성 등 여러 측면에서의 문제점이 있어 대부분 상용화되지 못하고 있으며, 합성항균제의 경우 지질 친화성이 커 식품으로 섭취하였을 때 체내 지방조직에 축적됨으로 장기적으로 독성을 유발할 가능성이 있고, 환경에 악영향을 미칠 수 있는 문제, 천연 유래의 제품을 선호하는 소비자의 인식 변화에 따른 문제도 있다. 이에 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있으며 용이하게 제조할 수 있는 새로운 천연항균소재의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 구슬말(Nostoc commune)은 구슬말과(Nostocaceae)의 구슬말속(Nostoc)에 속하는 남세균으로, 구슬 모양의 세포가 한 줄로 연결되어 엉키고 점액질로 싸여 덩어리를 이룬다. 토양, 축축한 바위, 호수나 분수의 바닥 따위에서 쉽게 발견되며 그 양 또한 상당한 생물자원이지만, 아직까지 이를 활용하는 기술은 거의 전무한 상태이다.
본 발명자는 거의 활용되고 있지 못하는 생물자원인 구슬말을 유용하게 활용할 수 있는 방법, 특히 천연항균제로서의 가능성에 초점을 두어 구슬말을 활용하는 방법에 관해 연구하였다.
Shiels, K., N. Browne, F. Donovan, P. Murray and S.K. Saha. 2019. Molecular Characterization of Twenty-Five Marine Cyanobacteria Isolated from Coastal Regions of Ireland. Biology 8:59.
Katoh H., J. Furukawa, K. Tomita-Yokotani, Y. Nishi. 2012. Isolation and purification of an axenic diazotrophic drought-tolerant cyanobacterium, Nostoc commune, from natural cyanobacterial crusts and its utilization for field research on soils polluted with radioisotopes. Biochimica et Biophysica Acta 1817: 1499-1505.
HaeRi Choi, Jin-Soo Park, Kyu-Min Kim, MinSun Kim, Kwang-Wook Ko, Chang-Gu Hyun, Joon Woo Ahn, Joo-Hyun Seo, Seung-Young Kim. 2018. Enhancing the antimicrobial effect of genistein by biotransformation in microbial system. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 63: 255-261.
따라서 본 발명의 주된 목적은 구슬말을 활용한 새로운 천연항균소재로서 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있는 새로운 항균용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 제조할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 제조하는데 필요한 새로운 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 구슬말 추출물을 바실러스 sp. JD3-7로 생물전환한 생물전환산물 또는 상기 생물전환산물의 추출물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균용 조성물에 있어서, 상기 구슬말 추출물은 구슬말로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것이 바람직하다.
본 발명의 항균용 조성물에 있어서, 상기 생물전환산물은 상기 구슬말 추출물이 10 내지 500㎎/ℓ로 포함되고 상기 바실러스 sp. JD3-7의 균체가 포함되고 pH 완충제가 포함되고 pH가 6.5 내지 8인 조성물을 1시간 내지 10일 동안 20 내지 40℃로 항온처리하여 수득되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항균용 조성물에 있어서, 상기 생물전환산물의 추출물은 상기 생물전환산물의 에틸아세테이트 추출물인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항균용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 구슬말 추출물과 바실러스 sp. JD3-7의 균체를 혼합하여 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계; 및 상기 생물전환 반응용 조성물을 항온처리하는 단계;를 포함하는 구슬말 추출물의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 구슬말 추출물의 생물전환 방법에 있어서, 상기 구슬말 추출물은 구슬말로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것이 바람직하다.
본 발명의 구슬말 추출물의 생물전환 방법에 있어서, 상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계는 상기 구슬말 추출물이 10 내지 500㎎/ℓ로 포함되고 pH 완충제가 포함되고 pH가 6.5 내지 8인 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 구슬말 추출물의 생물전환 방법에 있어서, 상기 항온처리하는 단계는 상기 생물전환 반응용 조성물을 1시간 내지 10일 동안 20 내지 40℃로 항온처리하는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC 92346P로 기탁된 바실러스 sp. JD3-7 균주를 제공한다.
본 발명의 항균용 조성물은 기존에 거의 활용되지 못했던 생물자원인 구슬말을 활용한 것으로, 프로피오니박테리움 아크네스, 대장균 및 살모넬라 엔테리카에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있다. 특히 여드름의 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스에 대해 높은 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 피부에도 안전하게 사용할 수 있어 기능성, 특히 여드름의 예방, 치료 또는 개선 용도의 화장료의 천연항균소재로서 유용할 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 구슬말(Nostoc commune)의 사진 및 이의 현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 바실러스 sp. JD3-7에 의한 제니스테인(genistein)의 생물전환 물질의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 바실러스 sp. JD3-7의 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 제작한 이웃-결합 계통수(neighbor-joining phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 생물전환산물의 프로피오니박테리움 아크네스 CCARM 0081에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 생물전환산물의 프로피오니박테리움 아크네스 CCARM 9089에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 생물전환산물의 대장균 ATCC 25922에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 살모넬라 엔테리카 ATCC 14028에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 8은 바실러스 sp. JD3-7의 수탁증이다.
도 2는 바실러스 sp. JD3-7에 의한 제니스테인(genistein)의 생물전환 물질의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 바실러스 sp. JD3-7의 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 제작한 이웃-결합 계통수(neighbor-joining phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 생물전환산물의 프로피오니박테리움 아크네스 CCARM 0081에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 생물전환산물의 프로피오니박테리움 아크네스 CCARM 9089에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 생물전환산물의 대장균 ATCC 25922에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 살모넬라 엔테리카 ATCC 14028에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 8은 바실러스 sp. JD3-7의 수탁증이다.
본 발명의 항균용 조성물은 구슬말 추출물을 바실러스 sp. JD3-7로 생물전환한 생물전환산물 또는 상기 생물전환산물의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 구슬말 추출물의 추출 원료인 구슬말(Nostoc commune)은 구슬말과(Nostocaceae)의 구슬말속(Nostoc)에 속하는 남세균으로, 바람직하게는 국립대전현충원 묘역에서 채집되는 것이며, 올리브그린 내지 암녹색을 띄고, 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 서열을 갖는 것이다.
본 발명에서 구슬말 추출물은 구슬말을 추출 원료로 사용하여 추출한 것으로, 열탕 추출, 초음파 추출, 환류 추출 등 당업계의 통상적인 추출 방법으로 제조될 수 있다. 바람직하게는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출한 것이며, 보다 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것이며, 보다 바람직하게는 물 또는 물과 에탄올의 혼합 용매로 추출한 것이며, 보다 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합 용매로 추출한 것이다. 상기 물과 에탄올의 혼합 용매는 바람직하게는 10 내지 99%(v/v)의 에탄올 용액이고, 보다 바람직하게는 30 내지 90%(v/v)의 에탄올 용액이고, 보다 바람직하게는 40 내지 90%(v/v)의 에탄올 용액이고, 보다 바람직하게는 50 내지 90%(v/v)의 에탄올 용액이고, 보다 바람직하게는 60 내지 80%(v/v)의 에탄올 용액이고, 보다 바람직하게는 65 내지 75%(v/v)의 에탄올 용액이다.
본 발명에서 상기 구슬말 추출물 제조 시 바람직하게는 채취한 구슬말을 건조하여 사용하며, 보다 바람직하게는 구슬말을 건조한 다음 분말화하여 사용한다. 또한 추출물 제조 시 용매의 양은 추출 원료, 즉 구슬말의 중량(예를 들어, 건조 중량) 10g 기준 바람직하게는 20㎖ 내지 10ℓ, 보다 바람직하게는 100㎖ 내지 5ℓ, 보다 바람직하게는 500㎖ 내지 2ℓ로 한다. 추출온도는 바람직하게는 0 내지 100℃, 보다 바람직하게는 5 내지 90℃, 보다 바람직하게는 10 내지 80℃로 한다. 특히 용매로 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하는 경우, 추출온도는 바람직하게는 5 내지 35℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30℃, 보다 바람직하게는 15 내지 25℃로 한다. 또한 용매로 물을 사용하는 경우, 추출온도는 바람직하게는 40 내지 80℃, 보다 바람직하게는 50 내지 70℃, 보다 바람직하게는 55 내지 65℃로 한다. 추출시간은 바람직하게는 1시간 내지 10일 동안, 보다 바람직하게는 12시간 내지 5일 동안, 보다 바람직하게는 1일 내지 2일 동안으로 한다.
본 발명의 추출물은 상기와 같은 추출 과정 이후 여과, 농축, 감압건조, 동결건조 등의 과정을 추가로 거친 것일 수 있다.
본 발명의 생물전환에 사용되는 균주인 바실러스 sp. JD3-7은 제주도의 콩 재래 간장으로부터 분리된 것으로 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 92346P로 기탁되어 있다. 본 발명의 균주는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefacience), 바실러스 시아멘시스(B. siamensis) 및 바실러스 벨레젠시스(B. velezensis)와 같은 계통으로 분류되며, 특히 바실러스 시아멘시스와 유사한 것으로 분류되지만, 생화학적 특성에서 명확한 차이가 있다(표 2). 본 발명의 균주는 구슬말 추출물을 생물전환시켜 기존에(생물전환하기 전의 구슬말 추출물에서) 없던(예를 들어, 실시예에 기재된 항균 활성 실험을 통해 확인되지 않았던) 항균 활성이 나타나도록 하거나, 기존에 상대적으로 낮았던 항균 활성이 높게 나타나도록 할 수 있으며, 이러한 점에서 기존의 유사한 다른 균주들과 차별화된다.
본 발명의 바실러스 sp. JD3-7은 바실러스 속의 미생물을 배양하는 통상의 배양조건에 따라 배양할 수 있다. 예를 들어 LB(Luria Bertani) 배지 또는 NB(nutrient broth) 배지에서 25 내지 35℃의 온도조건으로 배양할 수 있다.
본 발명에서 생물전환산물은 구슬말 추출물을 바실러스 sp. JD3-7로 생물전환한 것으로, 미생물을 사용하여 대상 물질을 생물전환하기 위해 사용되는 통상의 생물전환 방식을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어 구슬말 추출물과 바실러스 sp. JD3-7이 혼합된 조성물, 즉 생물전환이 이루어지도록 하기 위한 생물전환 반응용 조성물을 제조하고, 이 조성물을 항온처리하는 방식으로 수득할 수 있다. 이때 구슬말 추출물은 상기 생물전환 반응용 조성물에 바람직하게는 10 내지 500㎎/ℓ, 보다 바람직하게는 20 내지 400㎎/ℓ, 보다 바람직하게는 30 내지 300㎎/ℓ, 보다 바람직하게는 50 내지 200㎎/ℓ로 포함된다. 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물의 초기 pH를 맞추고 이후 반응 시 조성물 중의 pH 변화를 조절할 수 있도록 pH 완충제가 포함된다. 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물의 초기 pH가 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 7.5가 되도록 pH 완충제가 포함되고, 생물전환 반응 중에 상기 pH가 유지될 수 있도록 pH 완충제가 포함된다. 생물전환산물을 수득하기 위한 생물전환 반응용 조성물의 항온처리는 바람직하게는 1시간 내지 10일 동안, 보다 바람직하게는 12시간 내지 7일 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 5일 동안, 보다 바람직하게는 2 내지 4일 동안의 항온처리 시간으로 수행하며, 바람직하게는 20 내지 40℃, 보다 바람직하게는 25 내지 35℃, 보다 바람직하게는 27 내지 33℃, 보다 바람직하게는 29 내지 31℃의 항온처리 온도로 수행한다.
본 발명에서 생물전환산물의 추출물은 생물전환산물로부터 항균 특성을 나타낼 수 있는 특정 물질 또는 특정 물질들의 조합을 추출할 수 있는 통상의 추출 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 통상의 추출 용매를 사용하여 상기 생물전환산물로부터 추출물을 제조하고 항균 활성을 확인하는 방법, 예를 들어 본 명세서의 실시예에 개시된 항균 활성 측정 방법으로 이 추출물의 항균 활성을 확인하는 방법으로 수득할 수 있다. 바람직하게는 에틸아세테이트를 용매로 사용하여 추출한 것이다.
본 발명의 항균용 조성물은 상기와 같은 생물전환산물 또는 생물전환산물의 추출물 만으로 이루어질 수 있으며, 이 밖에 다른 성분을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물은 상기 생물전환산물 또는 생물전환산물의 추출물을 바람직하게는 0.1중량% 이상, 보다 바람직하게는 1중량% 이상, 보다 바람직하게는 10중량% 이상, 보다 바람직하게는 20중량% 이상, 보다 바람직하게는 50중량% 이상으로 포함한다.
본 발명의 항균용 조성물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 식품 위생과 관련된 균주인 대장균(Escherichia coli), 식중독 원인균인 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)에 대한 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있다. 따라서 상기와 같은 미생물에 대한 항균 활성이 필요한 분야, 특히 식품이나 화장품 분야에서 항균소재로 사용될 수 있을 것이다. 특히, 본 발명의 항균용 조성물은 실제로 피부 등 인체에 적용 시 안전한 것으로 나타났으므로, 화장품의 항균소재로서 유용할 것이다.
이에 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 항균용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 항균용 조성물만으로 이루어질 수 있으며, 이 밖에 화장품학적으로 허용된 성분을 더 포함할 수 있다. 화장품학적으로 허용된 성분을 포함하는 경우, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 항균용 조성물을 예를 들어 0.01 ~ 50중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 기능성 화장료 조성물일 수 있으며, 바람직하게는 여드름의 예방, 치료 또는 개선용 화장료 조성물이다.
본 발명은 또한 구슬말 추출물에 항균 활성을 부여하거나 항균 활성을 높일 수 있는 구슬말 추출물의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 생물전환 방법은 구슬말 추출물과 바실러스 sp. JD3-7의 균체를 혼합하여 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계; 및 상기 생물전환 반응용 조성물을 항온처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때의 구슬말 추출물, 바실러스 sp. JD3-7, 생물전환 반응용 조성물, 항온처리 등에 관한 구체적인 사항은 상기 항균용 조성물에 대한 구체적인 사항을 참조할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물 및 방법의 각 구성에 대한 바람직한 것으로 제시된 사항들은 본 발명의 기대 효과, 예를 들어 항균 활성, 예를 들어 프로피오니박테리움 아크네스, 대장균 및 살모넬라 엔테리카에 대한 항균 활성, 사용상의 안전성, 예를 들어 인체 적용 상의 안전성 등의 기대 효과를 위한 바람직한 사항으로, 반드시 본 발명을 제한하기 위해 제시되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 방법
1-1. 구슬말 채집 및 동정
국립대전현충원 일부 묘역에서 구슬말을 채집하였다. 이 구슬말은 올리브그린 내지 암녹색으로 잔디 부근에 착생하며, 광학현미경 하에서 원형의 세포가 여러 개 연결된 다수의 사상체(trichome)가 점액질에 둘러싸여 군체를 형성하였다. 사상체 중에는 일반 세포보다 크기가 큰 이형세포(heterocyst)가 관찰되었다.
분자생물학적 확인을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 시료 일부를 취하여 멸균수로 세척한 후, 균질기(homogenizer)로 파쇄하였다. 10% Chelex 100 용액 100㎕와 혼합하여 99℃에서 30분간 가열하였다. 얼음에서 식힌 후, 원심분리하여 상등액을 DNA 주형으로 사용하였다(Walsh et al. 1991). 남조류 특이적 프라이머 CYA106F(CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA, Nubel et al. 1997)와 FDSKS_CyaR1(CACCTTCCGGTACGGCTACCTTG, Shiels et al. 2019)를 이용하여 16S rRNA 유전자 부위를 증폭하였다. 증폭된 약 1.3kb의 DNA 단편을 제노텍(주)에 의뢰하여 최종 1,288bp의 염기서열 정보를 확보하였다. 최종 확보된 1,288bp의 염기서열 정보를 토대로 NCBI 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행한 결과, Nostoc commune HK-02(Katoh et al. 2012)와 99.6% 일치하였다. 이러한 결과를 종합하여 국립대전현충원 묘역에서 확보한 남조류를 구슬말(Nostoc commune)로 동정하였다.
구슬말의 16S rRNA 유전자 염기서열(1,288bp)(서열번호 1):
5'-CCTGGAACGGTGGCTAATACCGGATGTGCCGAAAGGTGAAAGATTAATTGCCTGGAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTAGGTGTGGTAAAGGCGCACCTAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATGACGGTACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGCTGTGTAAGTCTGCTGTTAAAGAGTCTAGCTCAACTAGTAAGAGCAGTGGAAACTACACGGCTAGAGTACGTTCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGCTCTGCTAGGCCGTAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTANATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTCGCGAATCTTCTCGAAAGGGAAGAGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGCCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTCCGGACAGAGGGCAGCAAGCGGGCGACCGCAAGCAAATCCCGGAAACCGGAGCTCAGTTCAGATCGCAGGCTGCAACTCGCCTGCGTGAAGGAGGAATCGCTAGTAATTGCAGGTCAGCATACTGCAGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTAGTGCCCGAAGTCATTACTCCAACTGTCAAAAGAGGAGGATGCCTAAGGCAGGACTG-3'
1-2. 구슬말 추출물 제조
1-2-1. 구슬말 주정 추출물 제조
상기 1-1의 구슬말을 건조한 분말 10g을 추출탱크에 투입하고, 70%(v/v) 에탄올 1ℓ를 첨가한 다음 실온에서 24시간 동안 추출하여 1차 추출물을 회수하였다. 이후 추출탱크에 70%(v/v) 에탄올 1ℓ를 추가로 첨가하고 실온에서 24시간 동안 추출하여 2차 추출물을 회수하였다. 회수한 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합하고 5.0㎛의 공극 크기를 갖는 필터(TOYO, 일본)로 여과하여 잔류 고형물을 제거하였다. 여과된 추출물을 진공 농축하여 다음의 생물전환에 사용하였다. 이렇게 제조한 추출물을 'NE'로 나타낸다.
1-2-2. 구슬말 열수 추출물 제조
상기 1-1의 구슬말을 건조한 분말 10g을 추출탱크에 투입하고, 1차 증류수 1ℓ를 첨가한 다음 60℃에서 48시간 동안 추출하여 1차 추출물을 회수하였다. 이후 추출탱크에 1차 증류수 1ℓ를 추가로 첨가하고 60℃에서 48시간 동안 추출하여 2차 추출물을 회수하였다. 회수한 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합하고 5.0㎛의 공극 크기를 갖는 필터(TOYO, 일본)로 여과하여 잔류 고형물을 제거하였다. 여과된 추출물을 진공 농축하여 다음의 생물전환에 사용하였다. 이렇게 제조한 추출물을 'NW'로 나타낸다.
1-3. 생물전환
1-3-1. 발효균 준비
제주도 콩 재래 간장을 연속 희석법으로 10-1 ~ 10-5까지 희석한 다음 각각의 희석액 100㎕를 LB(Luria Bertani) 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 11개의 균주를 순수 배양하였으며 박테리아 유니버셜 프라이머인 27F, 518F, 800R, 1492R로 각 콜로니의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, 모두 바실러스(Bacillus) 속의 균주로 분류되었다.
분리된 11 균주를 이용하여 최 등(Choi et al., 2018)에 의해서 기술된 제니스테인(genistein)을 기질로하는 생물전환법을 토대로 생물전환을 수행한 후 각각의 상층액을 농축하여 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 결과 생물전환능이 가장 우수한 균주 JD3-7을 선발하였다(도 2).
최종 선발된 바실러스 sp. JD3-7 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열(1429bp)의 상동성 검색과 이웃-결합 계통수(neighbor-joining phylogenetic tree) 제작 결과를 토대로 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefacience), 바실러스 시아멘시스(B. siamensis) 및 바실러스 벨레젠시스(B. velezensis)와 같은 계통으로 분류되었다(표 1 및 도 3).
| 균주명 | 유사도(%) |
| Bacillus siamensis KCTC 13613 (AJVF01000043) | 99.93 |
| Bacillus velesensis CR-502 (AY603658) | 99.93 |
| Bacillus subtilis NCIB 3610 (ABQL01000001) | 99.79 |
| Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 (FN597644) | 99.72 |
| Bacillus nematocida B-16 (AY820954) | 99.72 |
| Bacillus nakamurai NRRL B-41091 (LSAZ01000028) | 99.65 |
20NE API 키트를 사용하여 JD3-7 균주의 생화학적 특성 또한 조사하였으며, 이의 결과를 바실러스 시아멘시스와 비교하여 아래 표 2에 나타내었다.
| 효소 | JD3-7 | B. siamensis PD-A10 |
| Alkaline phosphatase | + | + |
| Esterase (C4) | + | + |
| Esterase Lipase (C8) | + | + |
| Lipase (C14) | - | - |
| Leucine arylamidase | - | - |
| Valine arylamidase | - | - |
| Cystine arylamidase | - | - |
| Trypsin | + | - |
| α-chymotrypsin | - | - |
| Acid phospatase | + | - |
| Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase | + | + |
| α-galactosidase | - | - |
| β-galactosidase | - | - |
| β-glucuronidase | - | - |
| α-glucosidase | +- | - |
| β-glucosidase | +- | - |
| N-asetyl-β-glucosaminidase | - | - |
| α-mannosidase | - | - |
| α-fucosidase | - | - |
| Nitrate reduction | + | + |
| Urease | + | + |
| Gelatinase | + | + |
JD3-7 균주를 영양배지(beef extract 3.0g/ℓ, peptone 5.0g/ℓ) 1ℓ에서 20시간 배양한 후 5,000rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 균체를 수득하였다. 이 균체를 구슬말 추출물의 생물전환에 사용하였다.
1-3-2. 구슬말 추출물의 생물전환
상기 1-3-2에서 수득한 바실러스 sp. JD3-7 균체를 PG 완충액(50mM phosphate, pH 7.2, 2% glyerol)로 2회 세척한 후 PG 완충액 50㎖에 현탁시켜 균체현탁액을 준비하였다. 상기 1-2-1에서 수득한 구슬말 주정 추출물(NE) 또는 상기 1-2-2에서 수득한 구슬말 열수 추출물(NW) 10㎎과 균체현탁액 100㎖을 혼합하고 72시간 동안 30℃로 항온처리하였다. 항온처리가 완료된 후 원심분리하여 균체가 제거된 상등액을 취하고, 이 상등액 50㎖을 100㎖의 에틸아세테이트로 2회 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 감압농축한 후 DMSO에 100㎎/㎖이 되도록 용해시켜 이후 항균활성 실험을 위한 시료를 준비하였다.
NE의 생물전환 시료는 NE-BC로 명명하였고, NW의 생물전환 시료는 NW-BC로 명명하였다. 또한 음성대조군으로 사용하기 위해 구슬말 추출물을 첨가하지 않고 상기와 같은 생물전환 과정을 거친 시료도 준비하였으며, 이를 PG-BC로 명명하였다.
1-4. 항균 활성 평가
1-4-1. 사용 균주 및 배지
항균 활성 실험의 지시균으로 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) CCARM 0081, 프로피오니박테리움 아크네스 CCARM 9089, 대장균(Escherichia coli) ATCC 25922 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) ATCC 14028를 사용하였다.
CCARM 0081 및 9089는 LB 배지(tryptone 10.0g, yeast extract 5.0g, sodium chloride 10.0g)를 사용하여 37℃에서 18시간 동안 혐기조건 배양하였고, ATCC 25922 및 ATCC 14028은 LB 배지를 사용하여 37℃에서 18시간 동안 호기 조건에서 배양하였다.
1-4-1. 항균 활성 측정
균의 생장을 억제하는 최소농도를 의미하는 최소 억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 지시균을 각각 최적 생육조건에서 배양하여 사용하였으며, 600nm에서 흡광도를 측정하여 OD값이 0.08 ~ 0.13인 균을 1x104 cfu/㎖로 조정한 후 사용하였다. 항균 활성 시험은 96-웰을 사용한 연속희석법을 이용하여 진행하였으며, 시료의 농도 범위를 10㎎/㎖부터 최저 농도인 0.04㎎/㎖까지로 설정하여 2배수로 희석하여 실험하였다. 음성대조군으로는 구슬말 추출물을 첨가하지 않고 생물전환 과정을 거친 시료인 PG-BC를 사용하였으며, 양성대조군으로는 암피실린(ampicillin)을 사용하였다. 또한, 상기 1-3-2에서 수득한 생물전환 시료 NE-BC 및 NW-BC 뿐만 아니라 상기 1-2-1 및 1-2-2에서 수득한 추출물 시료(생물전환하지 않은 것) NE 및 NW에 대한 항균 활성도 측정하였다. 18시간 동안 배양한 후 600nm에서 흡광도를 측정하여 최소억제농도를 결정하였다.
1-5. 피부 안전성 평가
상기 1-3-2의 NE-BC 시료, 즉 구슬말 주정 추출물의 생물전환 시료의 피부 안정성에 대해 평가하였다. 평가 시험은 세명대학교 화장품임상연구지원센터에 의뢰하였다.
1-5-1. 시험 대상자 선정
선정기준을 만족하고 제외기준에 해당사항이 없는 성인을 대상으로 선정하였다. 시험 제품의 유효성을 평가하기 위해 문서화된 정보를 시험 대상자에게 제공하고 시험책임자 등이 구두로 자세하게 설명한 다음 시험 대상자의 자유로운 의사에 의해 대상자가 되기를 서면으로 동의한 경우 시험에 참여하도록 하였다.
시험 대상자는 선정기준에 적합하며, 제외기준이 적용되지 않는 자로 30명을 선정하여 시험하였다(근거: 관련규정 식품의약품안전처 고시 제2019-47호 '기능성 화장품 심사에 관한 규정' 제5조1항 나목 2절 가 '별표1'의 '독성시험법 7항 인체사용시험' 참조).
1-5-2. 시험 방법
시험 부위는 등 부위로 하였다. 시험 대상자를 대상으로 IQ Ultra를 이용하여 피부 첩포 시험을 실시하였다. IQ Ultra에 증류수를 이용하여 10%로 희석시킨 시험 제품 6㎕를 적하하였다. 첩포는 24시간 동안 부착하였고, 패치 제거 30분 후, 패치 제거 24시간 후, 패치 제거 48시간 후에 2명의 전문가에 의하여 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준에 따라 자극 정도를 관찰하였다.
2. 결과
2-1. 프로피오니박테리움 아크네스 CCARM 0081에 대한 항균 활성
CCARM 0081에 대한 MIC 측정 결과, PG-BC 및 NW는 항균 효과를 나타내지 않았으며, NE의 경우 10㎎/㎖의 높은 농도에서 효과를 나타낸 반면, NW-BC는 0.625㎎/㎖, NE-BC는 0.156㎎/㎖의 농도에서 효과를 나타내었다. 이는 생물전환과정에서 미생물 대사에 의해 천연물 내 성분이 변환되어 항균 활성이 새롭게 나타나거나 향상됨을 의미한다. 특히, 시료 중 NE-BC가 가장 높은 항균 활성을 나타내었다(도 4).
2-2. 프로피오니박테리움 아크네스 CCARM 9089에 대한 항균 활성
CCARM 9089에 대한 MIC 측정 결과, PG-BC, NW 및 NE의 경우 항균 활성을 나타내지 않았다. 반면, NW-BC는 0.625㎎/㎖, NE-BC는 0.313㎎/㎖의 농도에서 항균 활성을 나타내었다. 이는 생물전환과정에서 미생물 대사에 의해 천연물 내 성분이 변환되어 항균 활성이 새롭게 나타나거나 향상됨을 의미한다. 또한 CCARM 0081에서와 마찬가지로 NW-BC보다 NE-BC가 더 큰 항균 활성을 나타내었다(도 5).
2-3. 대장균 ATCC 25922에 대한 항균 활성
ATCC 25922에 대한 MIC 측정 결과, PG-BC, NW 및 NE의 경우 항균 활성을 나타내지 않았다. 반면, NW-BC 및 NE-BC는 각각 2.5㎎/㎖, 1.25㎎/㎖의 농도에서 효과를 나타내었다. 이는 생물전환과정에서 미생물 대사에 의해 천연물 내 성분이 변환되어 항균 활성이 새롭게 나타나거나 향상됨을 의미한다. 또한 NW-BC보다 NE-BC가 더 큰 항균 활성을 나타내었다(도 6).
2-4. 살모넬라 엔테리카 ATCC 14028에 대한 항균 활성
ATCC 14028에 대한 MIC 측정 결과, PG-BC, NW 및 NE의 경우 항균 활성을 나타내지 않았다. 반면, NW-BC 및 NE-BC는 각각 5㎎/㎖, 2.5㎎/㎖의 농도에서 효과를 나타내었다. 이는 생물전환과정에서 미생물 대사에 의해 천연물 내 성분이 변환되어 항균 활성이 새롭게 나타나거나 향상됨을 의미한다. 또한 NW-BC보다 NE-BC가 더 큰 항균 활성을 나타내었다(도 7).
2-5. 피부 안전성
인체적용시험에 참여한 시험 대상자는 평균 연령 42.4±4.6세인 30명의 건강한 성인 여성으로, 참여한 시험 대상자 30명이 중도탈락 없이 최종 시험을 완료하였다. 시험 대상자의 주관적인 피부 상태(표 3), 시험 대상자 생활 습관(흡연 및 음주 유무)(표 4), 피부 민감도 여부(표 5)는 아래의 표 3 내지 5와 같다.
평가기준에 따라 평가 후 평균 자극 지수를 계산식에 따라 계산하고 판정 기준에 따라 피부 자극 강도를 평가하였다. 제품에 따른 safety zone, 시험 대상자 20% 초과 빈도로 자극 유발 제품, 매회 판독 시 +2 이상 자극 반응이 총 시험 대상자의 10% 이상에서 관찰되는 시험 제품 등 3가지 기준에 따라 최종 피부 자극 유발 여부를 판정하여 제품의 적부를 최종적으로 예측하여 표 6에 나타내었다.
인체적용시험 결과 패치 제거 후 30분, 24시간, 48시간 모두에서 자극이 관찰되지 않았다(패치 제거 30분 후에서 ±가 0명, +가 0명, ++가 0명, +++가 0명 관찰되었으며, 패치 제거 24시간 후에 ±가 0명, +가 0명, ++가 0명, +++가 0명 관찰되었고, 패치 제거 48시간 후에는 ±가 0명, +가 0명, ++가 0명, +++가 0명 관찰되었다). 평균 피부반응도는 0.00으로 피부 첩포시험(Patch Test)의 판정기준에 따라 무자극으로 판정되었다.
또한, 피부 일차 자극 시험에 사용되는 폐쇄첩포시험을 실시할 경우 3가지 최종 판정 기준에서 적합한 것으로 나타났기 때문에 자극 유발 가능성이 낮은 안전한 제품군으로 분류될 수 있었다.
<110> National Institute of Biological Resources
<120> Anti-microbial composition comprising bioconversion product of
Nostoc commune extract or extract thereof
<130> ALP21010
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1288
<212> DNA
<213> Nostoc commune
<400> 1
cctggaacgg tggctaatac cggatgtgcc gaaaggtgaa agattaattg cctggagatg 60
agctcgcgtc tgattagcta gtaggtgtgg taaaggcgca cctaggcgac gatcagtagc 120
tggtctgaga ggacgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 180
gcagcagtgg ggaattttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaatac cgcgtgaggg 240
aggaaggctc ttgggtcgta aacctctttt ctcagggaag aaaaaaatga cggtacctga 300
ggaataagca tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga tgcaagcgtt 360
atccggaatg attgggcgta aagcgtccgc aggtggctgt gtaagtctgc tgttaaagag 420
tctagctcaa ctagtaagag cagtggaaac tacacggcta gagtacgttc ggggcagagg 480
gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgtag agatcaggaa gaacaccggt ggcgaaggcg 540
ctctgctagg ccgtaactga cactgaggga cgaaagctag gggagcgaat gggattanat 600
accccagtag tcctagccgt aaacgatgga tactaggcgt ggcttgtatc gacccgagcc 660
gtgccgtagc taacgcgtta agtatcccgc ctggggagta cgccggcaac ggtgaaactc 720
aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagtatgt ggtttaattc gatgcaacgc 780
gaagaacctt accaaggctt gacatgtcgc gaatcttctc gaaagggaag agtgccttcg 840
ggagcgcgaa cacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 900
agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgttttt agttgccagc attaagttgg gcactctaga 960
gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcagc atgcccctta 1020
cgccttgggc tacacacgta ctacaatgct ccggacagag ggcagcaagc gggcgaccgc 1080
aagcaaatcc cggaaaccgg agctcagttc agatcgcagg ctgcaactcg cctgcgtgaa 1140
ggaggaatcg ctagtaattg caggtcagca tactgcagtg aattcgttcc cgggccttgt 1200
acacaccgcc cgtcacacca tggaagctgg tagtgcccga agtcattact ccaactgtca 1260
aaagaggagg atgcctaagg caggactg 1288
Claims (10)
- 구슬말 추출물을 바실러스 sp. JD3-7로 생물전환한 생물전환산물 또는 상기 생물전환산물의 추출물을 포함하는 항균용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 구슬말 추출물은 구슬말로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것인, 항균용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 생물전환산물은 상기 구슬말 추출물이 10 내지 500㎎/ℓ로 포함되고 상기 바실러스 sp. JD3-7의 균체가 포함되고 pH 완충제가 포함되고 pH가 6.5 내지 8인 조성물을 1시간 내지 10일 동안 20 내지 40℃로 항온처리하여 수득되는 것인, 항균용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 생물전환산물의 추출물은 상기 생물전환산물의 에틸아세테이트 추출물인, 항균용 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
- 구슬말 추출물과 바실러스 sp. JD3-7의 균체를 혼합하여 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계; 및
상기 생물전환 반응용 조성물을 항온처리하는 단계;를 포함하는 구슬말 추출물의 생물전환 방법. - 제6항에 있어서,
상기 구슬말 추출물은 구슬말로부터 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것인, 구슬말 추출물의 생물전환 방법. - 제6항에 있어서,
상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계는 상기 구슬말 추출물이 10 내지 500㎎/ℓ로 포함되고 pH 완충제가 포함되고 pH가 6.5 내지 8인 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계인, 구슬말 추출물의 생물전환 방법. - 제6항에 있어서,
상기 항온처리하는 단계는 상기 생물전환 반응용 조성물을 1시간 내지 10일 동안 20 내지 40℃로 항온처리하는 단계인, 구슬말 추출물의 생물전환 방법. - 수탁번호 KACC 92346P로 기탁된 바실러스 sp. JD3-7 균주.
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| KR20190068110A (ko) * | 2017-12-08 | 2019-06-18 | 광주여자대학교 산학협력단 | 바실러스 배양액에서 추출한 항균활성을 가진 화장료 조성물 |
| KR101999309B1 (ko) * | 2018-12-31 | 2019-07-12 | (주)유앤아이제주 | 흰들버섯 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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