KR101856435B1 - 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 히알루론산의 분해를 억제하여, 조직 수복 기간을 향상시키며, 히알루론산 가교제의 독성에 의한 부작용을 방지할 수 있다.
또한, 상기 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물을 포함하는 필러를 제공할 수 있다.

Description

히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물 및 이의 제조 방법{COMPOSITION FOR TISSUE REPAIR TREATMENT COMPRISING HYALURONIC ACID AND THE METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 히알루론산의 분해를 지연시키고, 히알루론산 가교제의 독소 성분에 의한 부작용을 방지할 수 있는 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자 다당이다. 히알루 론산은 포유동물의 피하조직과 연골조직 같은 결합조직에 분포되는 것 외에, 눈의 초자체나 탯줄 등에 존재하며 연쇄구균이나 간균류의 협막 등에도 존재하는 것이 알려져 있다. 히알루론산을 얻기 위한 일반적인 방법으로는 닭 벼슬, 탯줄 등에서 추출하는 방법과, 연쇄구군, 간균을 배양한 후 이것으로부터 추출 정제하는 방법 등이 있다.

우수한 생체적합성을 가지는 천연 히알루론산은 종간 특이성을 갖지 않고 조직이나 장기특이성을 갖지 않으며 피부의 보습력 증진, 피부 탄력 유지 및 피부 손상 시에 피부 하층부의 손상을 줄여주고 피부의 주요구성 성분 인 콜라겐이 세포 사이로의 움직임을 원활하게 하도록 윤활유와 같은 역할도 한다. 그러나 천연 히알루론산을 본연 그대로 사용하게 되면 기계적 물성이 좋지 않을 뿐만 아니라 체내에 존재하는 히알루로니다아제라는 효소에 의해 쉽게 분해되어 제거되기 때문에 다양한 응용에 있어 제한이 따르게 된다. 이와 같은 천연 히알루론산의 단점을 보완하기 위하여 화학적 수식이나 다양한 가교제를 사용한 가교를 통하여 하이드로겔을 형성하는 연구들이 많이 이루어지고 있다.

히알루론산의 화학적 수식과 가교를 통한 하이드로겔 형성은 일반적으로 히알루론산 주쇄에 존재하는 알코올 그 룹과 카르복시산 그룹을 통하여 이루어진다. 히알루론산 주쇄의 카르복시산 그룹은 에스테르화(esterificatio n)에 의한 화학적 수식(D. Campoccia et al., Biomaterials, 19, 1998, 2101-2127)이 주를 이루며, 하이드로겔 형성을 위한 가교반응은 디히드라지드(K. P. Vercruysse et al., Bioconjug. Chem., 8, 1997, 686-694), 디알 데히드(Y. Luo et al., J. Control. Release, 69, 2000, 169-184), 또는 디술파이드(X. Z. Shu et al., Biomacromolecules, 3, 2002, 1304-1311)를 이용한 연구가 진행되었다. 또한, 카르복시산 그룹에 메타크릴아미 드를 도입하여 광가교를 통한 하이드로겔을 제조하는 연구도 진행되었다(Y. D. Park et al., Biomaterials, 24, 2003, 893-900). 한편으로 히알루론산 주쇄의 알코올 그룹은 디비닐술폰(A. Ramamurthi et al., J. Biomed. Master Res., 60, 2002, 195-205) 또는 디글리시딜 에테르(T. Segura et al., Biomaterials, 26, 2005, 359- 371)를 이용한 연구가 진행되었다.

한편, 1980년대 후반에서 1990년대까지 하이드로겔 입자에 관한 연구는 고분자 재료를 마이크로 크기로 입자화하고 표면 및 내부를 화학적으로 개질함으로써 색전술(embolization), 효소고정화(enzyme immobilization), 약 물전달(drug delivery) 등의 분야에 응용되어 왔다. 2000년대에 진입하면서는 나노기술의 발달과 더불어 수용성 고분자를 이용한 나노크기의 입자 제조 및 응용에 관한 연구가 진행되고 있다. 현재까지 하이드로겔 입자에 관한 대부분의 연구는 바이오신약 및 바이오장기 분야에 응용을 목적으로 하여 생분해성 고분자를 사용하며, 비침 습적(non-invasive) 시술을 위해 주입가능형(injectable) 구조로 제조하는 것에 집중되고 있다.

상기 분야는 약물전달시스템, 색전술, 조직공학용 스캐폴드, 벌킹 에이전트(bulking agent) 및 임플란트(implant) 등을 포함한다. 이밖에 단백질의 분리, 농축 및 안정화, 면역검정(immunoassay), 바이오리액터(bioeactor), 센서, 바이오스 페시픽(biospecific) 크로마토그래피, 화장품 충진제(cosmetic filler) 등의 분야에도 폭넓게 사용되고 있다. 이러한 하이드로겔 입자는 에멀젼화, 코아세르베이션, 분무 건조 등의 물리적 방법 및 불균일계 중합과 같은 화학적 방법으로 만들어진다. 그 한가지 예로 w/o 에멀젼을 이용하여 계면에서 일어나는 가교반응을 통하여 다당류로 구성된 벽을 가지는 마이크로캡슐이 제조될 수 있다(M. C. Levy et al., Int. J. Pharm., 62, 1990, 27- 35; PCT/FR93/00237). 상기 방법은 w/o 에멀젼에서 가교제를 함유하는 유기상과 다당류를 함유하는 수성상이 접촉하는 계면에서 발생하는 계면가교 반응을 통해서 계면 부분만이 가교된 수 마이크론 이상의 크기를 가지는 마이크로캡슐을 얻는 방법이다.

이와 같이 여러 분야에서 응용 가능한 하이드로겔 입자 제조기술의 발전과 더불어 다양한 장점들을 가지는 히알루론산을 이용하여 하이드로겔 입자를 제조하는 연구들도 진행되고 있으며, 화학적 가교를 통해 제조되는 대부분의 히알루론산 하이드로겔 입자들이 상기 예를 들어 설명한 바와 같이 w/o 에멀젼을 통하여 제조되어 왔다(V. Dulong et al., Carbohydrate Polymers, 57, 2004, 1-6; Y. H. Yun et al., Biomaterials, 25, 2004, 147- 157).

상기 히알루론산은 2주에서 2달 사이에 매우 빠르게 생체 내 재흡수가 일어나기 때문에 문제가 되었어, 상기와 같이 화학적 가교를 통해 히알루론산 하이드로겔 입자를 제조하여, 판매가 되고 있다. 하지만, 이러한 히알루론산 하이드로겔 입자의 경우에 가교 결합을 위한, 가교 물질로 인해, 독성이 발생하는 문제가 발생하고 있다.

이에, 천연 히알루론산의 단점을 보완하기 위하여 화학적 수식이나 다양한 가교제를 사용한 가교를 통하여 형성한 히알루론산을 독성 없이 이용할 수 있는 방법에 대한 제품의 개발이 필요한 실정이다.

(특허 문헌 1) KR 10-2004-0072008 A1

본 발명의 목적은 히알루론산의 분해를 억제하여, 조직 수복 효과를 향상시킨 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 히알루론산 가교제의 독성에 의한 부작용을 방지할 수 있는 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물을 포함하는 필러를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 수복용 조성물은 가교되지 않은 또는 가교 결합된 히알루론산(Hyaluronic acid) 수용액; 및 병조희풀(Clematis heracleifolia DC.) 추출물을 포함하는 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물에 관한 것이다.

상기 히알루론산(Hyaluronic acid)은 평균 분자량(Mw)이 100만 g/mol 이상일 수 있다.

상기 조직 수복용 조성물은 소엽(Perilla frutescens var. acuta Kudo) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 조직 수복용 조성물은 절굿대(Echinops setifer Iljin) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 필러는 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물을 포함하는 조직 수복용 필러에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 조직 수복용 조성물의 제조 방법은 1) 건조된 병조희풀을 분쇄하는 단계; 2) 상기 분쇄물을 추출하는 추출 단계; 3) 상기 추출물을 감압 농축시켜 병조희풀 농축물을 수득하는 단계; 4) 상기 병조희풀 농축물; 및 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계; 및 및 5) 상기 병조희풀 농축물 및 히알루론산 수용액을 교반하는 단계를 포함하며, 상기 히알루론산은 가교되지 않은 또는 가교 결합된 히알루론산인 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에서 조직 수복이란 상기 조성물의 주입에 의하여 일시적 또는 반영구적으로 얼굴 또는 신체의 주름을 개선 또는 수복하거나, 윤곽 개선, 조직의 부피감을 형성, 또는 흉터 치유 등 조직을 재생하는 것을 의미할 수 있다. 상기 조직은 안면 또는 신체의 일부를 의미하는 것일 수 있다.

상기 조직 수복용　조성물은 시린지에 충진되어 피부층에 주입되는 것일 수 있다.

본 발명에서 히알루론산은 히알루론산 자체는 물론 그의 염 및 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 따라서, 이하에서 사용되는 히알루론산 수용액은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 히알루론산 유도체의 수용액, 및 이들의 혼합물 수용액을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조직 수복용 조성물은 가교되지 않은 또는 가교 결합된 히알루론산(Hyaluronic acid) 수용액; 및 병조희풀(Clematis heracleifolia DC.) 추출물을 포함할 수 있다.

상기 히알루론산은 체내에서 두 가지 경로로 분해되는데 첫째는 히알루로니다제(hyaluronidase)에 의한 분해이고 둘째는 세포 수용체(cell receptor)에 부착되어 세포내로 탐식되어 리소좀(lysosome)내의 효소에 의하여 분해되는 것이다. 히알루론산의 생분해는 매우 빨라서 0.5일 내지 수 일 내에 모두 분해되는 것으로 알려져 있다. 이러한 짧은 생분해를 극복하기 위하여 히알루론산의 가교 결합이 도입되었는데, 가교 결합에 의하여 분자량이 커지면, 우선 백혈구 특히 단핵구에 의한 탐식을 억제할 수 있고, 또한 히알루로니다제의 작용 속도도 감소된다.

이에, 본 발명의 히알루론산은 평균 분자량(Mw)가 100만 g/mol 이상인 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 히알루론산의 평균 분자량이 100만 g/mol 미만인 경우에는 단핵구에 의한 탐식 억제 효과가 미비하여, 조직 수복을 위해 투여 시에, 빠른 생분해로 인해, 조직 수복 효과가 미비할 수 있다.

상기 병조희풀(Clematis heracleifolia DC. )은 숲에 자라는 낙엽관목으로 높이가 1m에 달하고 밑부분은 목질이 발달하지만 윗부분은 죽는다. 잎은 대생하며 3개의 소엽으로 구성되고 소엽은 넓은 난형이며 첨두이고 예저 또는 절저이며 치아상 톱니가 있다. 꽃은 잡성으로서 89월에 핀다. 열매는 수과로서 편평한 타원형이다. 뿌리는 약재로 쓰이는데, 통증과 염증을 가라 앉히는 효능이 있어 통풍관절염에 약용한다. 다만, 병조희풀은 약간의 독성이 있어, 정량 이상을 먹으면 안된다.

상기 병조희풀 추출물은 병조희풀을 용매를 사용하여 추출하여 수득한 추출물을 의미한다.

상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 물이지만, 상기 예시에 국한되지 않는다.

상기 용매를 사용하여 병조희풀 추출물을 제조할 때에 있어서 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 12시간 내지 4일, 바람직하게는 24시간 동안 추출한 추출물 일 수 있다. 여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명에 따른 효과를 나타낼 수 있는 병조희풀 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.

한편 상기 병조희풀 추출물은 병조희풀을 사용하여 추출물을 제조한 뒤 이를 발효한 것일 수 있다. 병조희풀 추출물을 발효하여 경우 세포독성이 낮아 상대적으로 높은 농도에서 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.

상기 발효에 사용하는 미생물로는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir) 등과 같은 유산 바실리, 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코코스 플랜타룸(Lactococcus plantarum), 락토코코스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis), 엔테로코코스파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코코스 파에시늄(Enterococcus faecium), 스트렙토코코스 터모필리우스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 등과 같은 유산 콕사이 및 비피도박테리움 애닐멀스(Bifidobacterium animals), 비피도 박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum),비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도바테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 터모필룸(Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis) 등과 같은 비피도박테리아를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

이에, 본 발명의 조직 수복용 조성물은 히알루론산을 포함하며, 상기 히알루론산 수용액 100 중량부에 대하여, 병조희풀 추출물 0.5 내지 1 중량부로 포함할 수 있다.

상기 병조희풀은 히알루론산의 중량 대비, 소량 포함되어, 히알루로니다아제 저해 작용을 증강시키는 역할을 할 수 있다. 이에, 병조희풀 추출물 0.5 중량부 미만으로 포함할 경우, 히알루로니다아제 저해 작용이 미비하여, 히알루론산의 분해 억제 효과가 미비한 문제가 발생하며, 병조희풀 추출물 1 중량부를 초과하여 포함할 경우, 조직 수복용 조성물을 수 회 투여 시, 병조희풀에 의한 독성이 문제될 수 있다.

상기 히알루론산은 가교되지 않은 또는 가교 결합된 히알루론산을 모두 이용할 수 있다. 조직 수복용 조성물의 경우, 조직 수복 효과의 지속 기간이 필요에 따라, 다를 수 있어, 가교되지 않은 또는 가교 결합된 히알루론산을 모두 사용할 수 있다.

가교되지 않은 히알루론산의 경우, 조직 수복 효과의 지속 시간이 가교 결합된 히알루론산에 비해 짧지만, 본 발명은 히알루로니다아제 저해 작용 효과가 있는 병조희풀을 함께 포함하여, 히알루론산만을 이용하는 조직 수복용 조성물에 비해, 조직 수복 효과를 장시간 유지할 수 있다.

상기 가교 결합된 히알루론산은, 히알루론산간의 가교 결합을 위해 공지된 기술을 모두 사용할 수 있으며, 가교 결합 방식에 제한받지 않는다. 일 예시로, 1% NaOH 수용액에 히알루론산을 녹여, 히알루론산 용액을 제조하고, 가교 결합을 위해, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 혼합하여 혼합 용액을 제조하고, 폴리에틸렌 모올드(PE mold)에 담궈 겔화(gelation) 반응을 통해, 가교 결합된 히알루론산을 제조할 수 있다.

　보다 구체적으로, 가교 결합된 하알루론산을 제조하기 위해 이용되는 가교제는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직한 예로서 부탄다이올 다이글라이시딜 에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글라콜 다이글라이시딜 에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산다이올 다이글라이시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글라이콜 다이글라이시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글라이콜 다이글라이시딜에테르 (polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리터드라메틸렌글라이콜 다이글라이시딜 에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜 다이글라이시딜 에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜 폴리글라이시딜 에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 다이글리세롤 폴리글라이세롤 에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤 폴리그라이딜 에테르(glycerol polyglycidylether), 트리메틸프로판 폴리글라이시딜 에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨 폴리글라이시딜 에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨 폴리글라이시딜 에테르(sorbitol polyglycidyl ether)와 같은 화합물을 들 수 있다.

가교 결합된 히알루론산은 100 ℃이상, 상세하게는 121 ℃ 이상에서 가압멸균하여 최종적으로 생체에 적용할 수 있는 히알루론산 유도체 제조함으로써 조직 수복용 조성물로 사용할 수 있다.

다만 가교 결합된 히알루론산의 경우, 가교 결합을 통해, 조직 수복 효과가 증가하는 이점은 존재하나, 가교 결합 시, 필요한 가교제로 인해, 독성이 문제가 되었다.

이러한 문제를 방지하기 위해, 본 발명은 소엽 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 소엽 추출물은 항염 효과가 우수하여, 가교 결합된 히알루론산의 독성에 의한 염증 반응을 완화시킬 수 있다. 또한, 병조희풀 추출물에 소엽 추출물을 혼합하여 포함하는 경우, 히알루로디나아제 저해 작용 효과를 보다 증강시킬 수 있다.

상기 소엽(Perilla frutescens var. acuta Kudo)은 재배하는 일년초로 높이 6090cm이고 사각이며 곧추 자라고 긴 털이 있다. 잎은 대생하고 잎자루가 길며 난형이고 예두 예저이며 맥 위에 긴 털이 있고 가장자리에 톱니가 있다. 꽃은 연한 자주색으로 89월에 가지와 원줄기 끝에 총상화서로 달린다. 열매는 분과로 꽃받침 안에 들어 있다. 잎은 백로 전후에 채취하여 그늘에서 말려 이용하며, 종자는 결실기에 채취하여 햇볕에 말려 이용할 수 있다. 소엽은 강장 보호, 갱년기 장애, 거담, 건비위, 건위, 경신익지, 고혈압, 관절냉기, 기관식 천식, 담, 몽정, 발산, 사태, 안태 등에 효능이 있는 것으로 알려져있다.

또한, 본 발명은 절굿대(Echinops setifer Iljin) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 절굿대는 햇볕이 잘 드는 풀밭에 자라는 다년초로 높이가 100cm에 달하고 전체가 솜으로 덮여 있는 것 같다. 잎은 호생하고 뿌리에서 돋은 잎은 뒷면에 솜털이 덮여 있으며 줄기에 달린 잎은 장타원형이고 밑부분이 좁아진다. 꽃은 남자색으로 78월 원줄기와 가지 끝에 달린다. 수과는 원통형으로 털이 많다. 각혈, 간경변증, 간염, 간장암, 고혈압, 근골동통, 기관지염, 발모, 배농, 배혈, 생기, 소통하유, 수감, 양모발약 등에 효능이 있는 것으로 알려져있다.

가교 결합된 히알루론산에 의한 염증을 방지하기 위해, 소엽 추출물을 추가로 더 포함할 수 있으며, 소엽 추출물을 단독으로 포함하는 경우에 비해, 혼합사용에 따른 상승효과로, 염증 발생의 매개인자의 발현을 억제하는 효과가 상승한다. 따라서, 보다 적은 함량으로 염증 예방에 우수한 효과를 낼 수 있다.

상기 조직 수복용 조성물은 호랑가시나무(Chinese horned Holly) 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 소엽 추출물에 대하여, 상기 절굿대 추출물 및 호랑가시나무 추출물을 혼합하여 사용하여, 각 추출물의 상호 반응에 의한 상승 작용으로 가교 결합된 히알루론산에 의한 염증 반응의 예방 효과가 상승하게 된다. 즉, 각 추출물의 단순 조합 이상의 상승 효과를 낼 수 있다. 또한, 병조희풀 추출물에 대하여, 상기 소엽 추출물; 절굿대 추출물 및 호랑가시나무 추출물을 혼합 사용함에 따라, 각 추출물의 상호 반응에 의한 상승 작용으로, 히알루로디나아제 저해 작용 효과를 보다 증강시킬 수 있다.

바람직하게는 상기 조직 수복용 조성물은 상기 히알루론산 수용액 100 중량부에 대하여, 병조희풀 추출물 0.5 내지 1 중량부; 소엽 추출물 1 내지 15 중량부; 절굿대 추출물 1 내지 15 중량부; 및 호랑가시나무 추출물 0.5 내지 5 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다.

보다 바람직하게는 상기 히알루론산 100 중량부에 대하여, 병조희풀 추출물 0.5 내지 0.8 중량부; 소엽 추출물 5 내지 10 중량부; 절굿대 추출물 1 내지 5 중량부; 및 호랑가시나무 추출물 1 내지 3 중량부로 포함할 수 있다.

상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 혼합 작용에 의한 보다 높은 상승효과에 의해 항염 효과가 활성화되어, 가교 결합된 히알루론산에 의한 염증 반응을 효과적으로 예방하며, 히알루로디나아제 저해 작용 효과를 보다 증강시킬 수 있다.

상기 호랑가시나무는 묘아자나무라고도 한다. 해변가 낮은 산의 양지에서 자란다. 높이 2 내지 3m이고 가지가 무성하며 털이 없다. 잎은 어긋나고 두꺼우며 윤기가 있고 타원상 육각형이며 각점이 예리한 가시로 되어 있다. 꽃은 4 또는 5월에 피고 향기가 있으며 5 또는 6개가 잎겨드랑이에 산형꽃차례로 달린다. 암술은 암술대가 없고 암술머리는 약간 높아져서 4개로 갈라지고 흑색으로 된다. 열매는 둥글고 지름 8 내지 10mm이며 9 또는 10월에 적색으로 익는다. 종자는 4개씩 들어 있고 난형이며 맥문이 있다.

잎은 거풍, 강장 등에 열매는 자음, 강정 등에 사용한다. 번식은 가을에 익은 종자를 채취하여 봄에 파종한다. 한국의(전북 변산반도 이남), 중국 남부에 분포한다.

상기 조성물은 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제, 국소 마취제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 조직 수복용 조성물의 제조 방법은 1) 건조된 병조희풀(Clematis heracleifolia DC.)을 분쇄하는 단계; 2) 상기 분쇄물을 추출하는 추출 단계; 3) 상기 병조희풀 농축물 및 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계; 및 4) 상기 병조희풀 농축물 및 히알루론산 수용액을 교반하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 1) 및 2) 단계는 병조희풀 추출물을 획득하기 위한 단계로, 병조희풀 이외에 소엽 추출물; 절굿대 추출물; 및 호랑가시나무 추출물은 병조희풀 추출물의 제조 방법과 동일한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 3) 단계에서 병조희풀 추출물 및 희알루론산 수용액과 함께 혼합될 수 있다.

상기 4) 단계는 병조희풀 농축물 및 히알루론산 수용액을 교반하는 단계로, 바람직하게는 4-1) 50 내지 80rpm으로 10 내지 20분 동안 1차 교반하는 단계; 4-2) 120 내지 150 rpm으로 5 내지 10분 동안 2차 교반하는 단계; 및 4-3) 80 내지 100rpm으로 5 내지 10분 동안 3차 교반하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 4-1) 50 내지 80rpm으로 10 내지 15분 동안 1차 교반하는 단계; 4-2) 120 내지 150 rpm으로 5 내지 8분 동안 2차 교반하는 단계; 및 4-3) 80 내지 100rpm으로 5 내지 8분 동안 3차 교반하는 단계를 포함할 수 있다.

보다 상세하게, 병조희풀 추출물; 소엽 추출물; 절굿대 추출물; 호랑가시나무 추출물; 및 히알루론산 수용액을 혼합하기 위해, 1 내지 3 단계의 교반 공정의 순서로 교반 공정을 진행할 수 있다. 단일 속도로 교반 공정을 진행할 경우, 히알루론산 수용액에 상기 천연 추출물이 균일하게 혼합되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 균일하게 혼합되지 않을 경우, 혼합 용액이 뿌옇게 흐려지는 문제가 발생할 수 있다.

이에, 상기 기재한 바와 같이, 교반 시, 1차 교반 단계; 2차 교반 단계 및 3차 교반 단계의 순서로 교반 공정을 진행한다. 1차 교반 종료 후에 보다 고속으로 2차 교반을 진행하며, 상기 2차 교반 공정이 완료된 이후, 1차 교반 및 2차 교반의 중간 속도로 교반공정을 진행하여, 균일하게 혼합된 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물에 의하면 히알루론산의 분해를 억제하여, 조직 수복 기간을 향상시키며, 히알루론산 가교제의 독성에 의한 부작용을 방지할 수 있다.

또한, 상기 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물을 포함하는 필러를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물의 제조 방법에 대한 순서도이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예: 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물의 제조]

1. 히알루론산 수용액(HA)의 제조

0.25 N NaOH 용액에　히알루론산　나트륨을 100 mg/ml 농도로 용해시키고, 여기에 50mM 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 넣고 잘 흔들어주면서 4℃에서 36시간 동안 두었다.

2. 병조희풀 추출물(CH)의 제조

병조희풀을 세척하고 건조한 뒤 이를 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 정제수에 혼합하고 이를 2시간 동안 98 내지 100℃를 유지하고, 이를 냉각시킨 뒤 와트만 여과지로 여과하여 그 여액을 수득하였다.

3. 기타 천연 추출물의 제조

상기 병조희풀 추출물과 동일한 방법으로 각각 소엽 추출물(PF), 절굿대 추출물(ES) 및 호랑가시나무 추출물(BF)을 제조하였다.

4. 조직 수복용 조성물의 제조

히알루론산 수용액(HA), 병조희풀 추출물(CH), 소엽 추출물(PF), 절굿대 추출물(ES) 및 호랑가시나무 추출물(BF)를 하기 표 1과 같은 조성으로 혼합하였다.

이후, 교반 공정을 진행하였으며, 교반 공정은 하기 표 2와 같은 조건 하에서 진행하였다. 실험 번호 TY 1 내지 TY 12는 M 2 교반 공정 조건으로 교반 공정을 진행하였으며, 교반 공정의 차이를 확인하기 위해서, TY 9 조성 범위로 혼합한 조성물을 M 1 내지 M 6의 교반 조건으로 교반하여, 균일하게 교반되었는지 여부를 관찰하였다.

	TY1	TY2	TY3	TY4	TY5	TY6	TY7	TY8	TY9	TY10	TY11	TY12
HA	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
CH	0.3	0.5	0.8	1.0	1.5	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
PF	-	-	-	-	-	0.5	3	5	8	10	15	18
ES	-	-	-	-	-	0.5	1	3	5	10	15	18
BF	-	-	-	-	-	0.1	0.5	1	2	3	5	10

	교반 공정
M1	50 rpm으로 10분 동안 1차 교반 공정을 진행하고, 120 rpm으로 5분 동안 2차 교반 공정을 진행한 후, 100 rpm으로 5분 동안 3차 교반 공정을 진행하였다.
M2	70 rpm으로 10분 동안 1차 교반 공정을 진행하고, 120 rpm으로 5분 동안 2차 교반 공정을 진행한 후, 100 rpm으로 5분 동안 3차 교반 공정을 진행하였다.
M3	80 rpm으로 10분 동안 1차 교반 공정을 진행하고, 140 rpm으로 5분 동안 2차 교반 공정을 진행한 후, 100 rpm으로 5분 동안 3차 교반 공정을 진행하였다.
M4	70 rpm으로 20분 동안 교반 공정을 진행하였다.
M5	100 rpm으로 20분 동안 교반 공정을 진행하였다.
M6	120 rpm으로 20분 동안 교반 공정을 진행하였다.

[제조예 2: 주사 충진 및 멸균]

상기 제조예에서 제조된 결과물을 각각 같은 양으로 주사기에 충진한 후, 고압증기멸균방법으로 멸균하여 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물을 제조하였다.

[실험예 2: 히알루론산 분해 억제 여부 평가]

50 μL의 히알루로니다아제 용액(1 ㎎/mL)(sigma-aldrich)을 마이크로 튜브에 넣고, 실험번호 TY 1 내지 5를 각각 50 μL 가하여 37℃에서 10분간 인큐베이트하였다. 대조군으로 히알루론산 수용액 50 μL를 가하였다. 50 μl의 수산화나트륨 수용액(0.2 M)을 가하여 반응을 멈췄다. 이 용액을 3분간 펄펄 끓인 후, 유수로 냉각하고, 10% p-DMAB(dimethylaminobenzaldehyde)용액을 300 μL 가하여 37℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 실온에 복귀시킨 후, 100 μL씩 96 웰 플레이트(well plate)로 옮겨, POWERSCAN HT를 이용하여 OD585 ㎚를 측정하였다. 대조의 흡광도를 100으로 한 결과는 하기 표 3 및 표 4와 같다.

	대조군	TY 1	TY 2	TY 3	TY 4	TY 5
대조에 대한 히알루로니다아제의 활성(%)	100	98.49	94.24	92.01	93.78	98.56

	TY 6	TY 7	TY 8	TY 9	TY 10	TY 11	TY 12
대조에 대한 히알루로니다아제의 활성(%)	95.14	93.49	90.24	90.41	93.78	94.56	96.77

상기 표 3 및 4에 따르면, 병조희풀 추출물을 본 발명의 범위 내로 포함하지 않을 경우, 히알루로니다아제의 저해 작용이 발휘하지 않음을 확인하였으며, TY 2 내지 4의 범위 내에서 히알루로니다아제 저해 작용이 우수함을 확인하였다.

더불어, 병조희풀 추출물에 천연 추출물을 혼합한, TY 6 내지 12 경우, 각 추출물의 상호 반응에 의한 상승 작용으로, 히알루로디나아제 저해 작용 효과를 보다 증강됨을 확인하였다.

[실험예 2: 가교 결합된 히알루론산의 독성 평가 및 항염 효과에 대한 평가]

1. 히알루론산 수용액에 대한 MTT 평가

히알루론산 수용액의 독성 평가는 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸리엄(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium, MTT) 분석방법을 사용하여 수행하였다. MTT 평가는 히알루론산 수용액으로부터 72 시간 동안 방출되어 나오는 용출물 1ml에 대해서 100㎕에 대한 독성 분석을 진행하였으며, 양성대조군인 테플론(Teflon)에서 방출되어 나오는 용출물에 대한 독성평가 결과를 비교 분석하여 히알루론산 수용액의 독성평가를 수행하였다. 보다 구체적으로, 세포 독성을 평가하기 위해, 히알루론산 수용액에 대하여 버퍼용액에서 72시간 인 비트로(in vitro) 상에서 용출시켜 얻은 용출액 1ml 중 100㎕을 배양 중인 섬유아 세포에 주입 후, 24시간이 지난 후, MTT 분석을 통해 세포 생존성을 정량화하여 평가하였다.

상기 MTT 분석을 통하여, 섬유아 세포의 생존율을 평가한 결과, 양성 대조군과 대비하여, 70%의 세포 생존성을 보이는 결과를 얻었다(p < 0.05).

2. 실험번호 TY 1 내지 12에 대한 MTT 평가

상기 히알루론산 수용액의 MTT 평가와 동일한 방법으로 TY 1 내지 12에 대한 MTT 평가를 진행하였다.

히알루론산 수용액의 MTT 평가를 지수 5로 고정하여 기준으로 삼고, 상기 혼합 추출물 사용에 따른 결과를 이와 비교하여 1 내지 10의 지수로 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 항염 활성이 우수한 것이다.

그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

	HHA	TTY1	TTY2	TTY3	TTY4	TTY5	TTY6	TTY7	TTY8	TTY9	TTY10	TTY11	TTY12
MTT 평가	5	4	5	5	6	5	5	6	9	9	6	6	5

(단위 지수)

상기 표 5에 따르면, 혼합 추출물의 사용에 따른 상승효과가 크게 나타난다는 사실을 확인할 수 있다. TY 1 내지 5의 경우, 항염 효과가 있는 천연 추출물을 포함하지 않아, 히알루론산 수용액만을 단독으로 평가한 경우와, 유사한 수치가 나옴을 확인하였다.

상기 표 5에 나타낸 결과에 의하면, 혼합 추출물에 의하는 경우, 각 추출물의 혼합에 의한 상승 작용으로 단순 조합 이상의 상승 효과가 나타남을 알 수 있었다.

이에 따라, 상기 혼합 추출물을 사용하는 경우, 가교 결합된 히알루론산의 사용에 의한 독성에 대한 우수한 억제 활성을 나타낼 수 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 조직 수복 기간을 늘리기 위해, 가교 결합된 히알루론산을 사용하는 경우, 발생할 수 있는 부작용을 상대적으로 낮은 농도의 천연 추출물을 이용하여, 우수한 항염 효과가 나타남을 알 수 있었다.

[실험예 3: 교반 공정에 따른 균질 혼합 여부 평가]

교반 공정의 차이에 따른 균질 혼합 여부에 대해 육안으로 평가를 진행하였다. 혼합 용액을 투명 용기에 담고, 1일 경과 후, 침전이 발생하는지 여부를 평가하였다. 관찰 결과, X는 침전이 발생하지 않은 것을 의미하고, ○는 침전이 발생한 것을 의미한다.

	침전 발생 여부
M1	X
M2	X
M3	X
M4	○
M5	○
M6	○

상기 표 6에 따르면, M1 내지 M3의 경우에는 1일이 경과한 이후에도 침전이 발생하지 않음을 확인하였다. 다만, M4 내지 M6와 같이, 단계별로 교반 공정을 진행하지 않은 경우에는 1일 경과 후에 침전이 발생함을 확인하였다. 이는 동일 속도로 교반 공정을 진행하는 경우, 균일 하게 혼합되지 않아, 히알루론산과 천연 추출물의 성분 간에 결합이 발생하여, 침전물이 발생하는 것을 알 수 있었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (6)

1. 가교 결합된 히알루론산(Hyaluronic acid);
   병조희풀(Clematis heracleifolia DC) 추출물;
   소엽(Perilla frutescens var acuta Kudo) 추출물;
   절굿대(Echinops setifer Iljin) 추출물; 및
   호랑가시나무(Chinese horned Holly) 추출물을 포함하며,
   히알루론산 100 중량부에 대하여, 병조희풀 추출물 0.8 중량부; 소엽 추출물 5 내지 8 중량부; 절굿대 추출물 3 내지 5 중량부; 및 호랑가시나무 추출물 1 내지 2 중량부로 포함하는
   히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 히알루론산(Hyaluronic acid)은 평균 분자량(Mw)이 100만 g/mol 이상인
   히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 따른 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물을 포함하는
   조직 수복용 필러.
6. 1) 건조된 병조희풀(Clematis heracleifolia DC)을 분쇄하는 단계;
   2) 상기 분쇄물을 추출하여 병조희풀 추출물을 제조하는 단계;
   3) 상기 병조희풀 추출물 및 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계; 및
   4) 상기 병조희풀 추출물, 소엽 추출물; 절굿대 추출물; 및 호랑가시나무 추
   출물 및 히알루론산 수용액을 교반하는 단계를 포함하며,
   상기 히알루론산은 가교 결합된 히알루론산이며,
   상기 4) 단계는
   4-1) 50 내지 80rpm으로 10 내지 20분 동안 1차 교반하는 단계;
   4-2) 120 내지 150 rpm으로 5 내지 10분 동안 2차 교반하는 단계; 및
   4-3) 80 내지 100rpm으로 5 내지 10분 동안 3차 교반하는 단계를 포함하며,
   히알루론산 100 중량부에 대하여, 병조희풀 추출물 08 중량부; 소엽 추출물 5 내지 8 중량부; 절굿대 추출물 3 내지 5 중량부; 및 호랑가시나무 추출물 1 내지 2 중량부로 포함하는
   제 1항에 따른 히알루론산을 포함하는 조직 수복용 조성물의 제조 방법.

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