KR101487431B1 - 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 마이크로 코팅 생균제의 제조 방법 - Google Patents

식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 마이크로 코팅 생균제의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)에서 추출하여 분리한 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 미생물 생균제 제조방법에 관한 것으로, 유산균 등 식용미생물의 생균제 제조시에 미생물 배양 공정 후에 회수한 고농도 균체액 또는 동결건조하여 획득한 기존의 생균제 분말에 대하여 마과 작물에서 자체 분리한 식물성 뮤신 성분과 식품원료로 널리 상용화되어 있는 수용성 식이 섬유소를 동결보호제 및 미세코팅 결합제로 혼합 첨가하여 생균제의 생산 수율을 향상시키고, 내산성, 내담즙성 및 장내정착성을 개량시키는 것을 확인함으로써, 상기 생균제가 경구섭취시의 생리기능 효과를 극대화시키고 유통 과정 중의 생균의 생존력이 강화된 미생물 생균제 제조공정에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 마이크로 코팅 생균제의 제조 방법{The manufacturing method of microcoated probiotics to use vegetable mucin and soluble dietry fiber}
본 발명은 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)에서 추출하여 분리한 뮤신(mucin) 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 미생물 생균제 제조방법에 관한 것이다.
유산균 생균제는 장내 유해균을 억제하고 장관운동을 활성화시켜 변비나 설사증을 개선시켜 배변활동을 원활히 해주는 생리활성에 의해 건강기능식품이나 정장용 의약품, 사료첨가제 등에 널리 사용되고 있다. 최근에는 장내 면역증강 기능과 함께 항고지혈, 항아토피, 다이어트 효과, 항당뇨 등 다양한 생리활성 기능이 밝혀지고 있어 전통적인 발효유 생산 종균으로서의 활용과 함께 건강식품 소재로서 산업적 활용이 증가하고 있는 추세에 있다. 국내 외에 상용화되어 있는 유산균은 유산구균(락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 등), 유산간균(락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가제리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 등), 비피더스균(비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) 등)로서 다양한 균종으로 구성되어 있으며 유아 및 성인의 분변, 동물의 분변, 김치, 장류, 발효 유제품, 야채류, 과실류, 원유, 식물체 등 다양한 소재에서 분리되어 사용되고 있다. 유산균 생균제의 제조 공정은 통상적으로 생균체의 고농도 배양, 동결건조 분체화 및 안정제 투입, 제형 성형 등의 단계별 공정을 거치게 되는데 각각의 균종 및 균주 별로 세부적인 배양 배지 조성 및 배양 조건, 동결보호제 및 안정제 조성에 관련한 최적화 실험을 거쳐 각개 균주에 적합한 생산조건 및 공정을 선택하여 사용하고 있다. 생균제가 갖는 여러 장점에도 불구하고 생균체의 위산 및 담즙산에 의한 사멸 현상, 고온, 고압 및 습기에 노출시의 사멸 현상, 장기간 유통 과정 중의 사멸 현상은 생균제의 안정적인 산업적 활용이나 경구섭취시의 효능발휘에 장애가 되고 있다. 생균제 본래의 생리활성 기능성을 유지하고 배가시키기 위해서는 내산성, 내담즙성, 유통 안정성 등을 개선하여 경구 섭취시에 높은 장내 정착성을 유지하는 것이 필수적이므로 관련 업계에서는 생존 특성이 우수한 균주의 개발과 함께 우수한 동결보호제 및 안정제 조성, 다양한 코팅제 제조 방법 등을 도입하여 생균제의 품질 개선에 활용하고 있다.
　
뮤신(mucin)은 보습제와 같은 화장료 원료나 식품소재로 사용되고 있는 달팽이 유래의 점액성 물질이나 사람이나 동물의 위나 장점막에 존재하는 동물성 기원의 점액성 물질을 칭하는 용어로 사용되었으나, 최근에는 식물체에서도 유사한 물성을 지닌 고분자 점질물들이 많이 발견되고 있으므로 그 기원과 관계없이 고점성을 지닌 고분자 물질로서의 뮤코-다당류(muco-polysaccharide)를 총칭하는 관용어로 사용되고 있다. 식물성 기원의 뮤신 물질은 주로 마과 작물이나 연근 작물에서 쉽게 발견되며 이들 성분의 물성 특징은 사람이나 동물의 위벽 및 장관벽을 보호해주는 동물성 뮤신 성분과 유사한 특성을 지니며 위 및 장관 보호, 면역증강이나 감염방어, 피부세포 재생능, 피부의 염증 및 자극완화, 피부 보습작용과 같은 생리활성을 지니고 있다. 마과 작물 중 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.) 유래의 뮤신 성분은 기존의 장마 작물에 비교하여 5배 이상의 점질물 함량을 보유하고 있어 식품 및 화장료 산업에 있어 유용한 생리활성 소재로 활용될 수 있다.
식이 섬유소는 사람의 소화효소로 분해시키기 어려운 난소화성 고분자 물질로서 식물체의 세포벽 성분을 지칭하는 용어인데 장관운동을 활성화하고 배변활동을 증진시키며 중금속을 배출시키는 등의 작용이 있으며, 콜레스테롤이나 혈당을 조절하는 작용도 있어 다이어트용 제품, 프로바이오틱스 이용 완제품이나 여러 건강기능식품 제품에 주원료나 부원료로서 첨가하여 널리 사용되고 있다. 널리 상용화되어 있는 수용성의 식이섬유소로는 폴리-덱스트로스(poly-dextrose), 치커리 파이버(chicory fiber) 추출물, 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin), 펙틴(pectin) 등 여러 식이 섬유소가 있는데, 이들 성분은 강한 섬유상 구조를 지닌 셀룰로오스(cellulose)와 같은 불용성 식이섬유와 달리 고체상의 결정 구조에서는 여러 세포가 붙어 있도록 접착제 역할을 하면서도 액상조건에서는 물에 잘 녹아서 팽윤되는 성질을 지니고 있다. 이러한 수용성 식이섬유의 물성 특성을 이용하여 미생물 생균제의 제조시에 코팅제로 함께 사용하는 경우 생균제 내 여러 성분의 결합제 역할을 하여 미세코팅 조직의 형성에 기여함과 동시에 경구섭취시에는 장관에 도달하여 장관운동을 활성화시킴으로써 생균제의 효능효과를 보조해주는 작용을 함께하게 되므로 유산균 등 식용미생물의 생균제 제조 공정에 유용하게 활용되어 질 수 있다.
이에, 본 발명자들은 미생물 생균제의 코팅 방법을 찾기 위하여 노력하던 중, 유산균 등 식용미생물의 생균제 제조시에 미생물 배양 공정 후에 회수한 고농도 균체액 또는 동결건조하여 획득한 기존의 생균제 분말에 대하여 마과 작물에서 자체 분리한 식물성 뮤신 성분과 식품원료로 널리 상용화되어 있는 수용성 식이 섬유소를 동결보호제 및 미세코팅 결합제로 혼합 첨가하여 사용하면 생균제의 생산 수율을 향상시키고, 내산성, 내담즙성 및 장내정착성을 개량시켜 경구섭취시의 생리기능 효과를 극대화시키고 유통 과정 중의 생균의 생존력을 강화시키는 미생물 생균제 제조방법을 구축할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기존의 생균제 분말에 대하여 마과 작물에서 분리한 식물성 뮤신 성분과 식품원료로 널리 상용화되어 있는 수용성 식이 섬유소를 동결보호제 및 미세코팅 결합제로 혼합 첨가하여, 생균제의 생산 수율을 향상시키고, 내산성, 내담즙성 및 장내정착성이 개량된 미생물 생균제 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식용 미생물을 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)에서 분리한 식물성 뮤신 성분과 식품원료로 널리 상용화되어 있는 수용성 식이 섬유소를 동결보호제 및 미세코팅 결합제로 혼합 첨가하여 제조한 식물성 미생물 코팅제 및 이를 이용한 마이크로 코팅 생균제, 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)에서 추출하여 분리한 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 미생물 생균제 제조방법은 생균제의 생산 수율을 향상시키고, 내산성, 내담즙성 및 장내정착성을 개량시키는 것을 확인함으로써, 상기 생균제가 경구섭취 시의 생리기능 효과를 극대화시키고 유통 과정 중의 생균의 생존력이 강화된 미생물 생균제의 제조공정에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.) 추출 수용성 뮤신의 제조 공정도를 나타낸 도이다.
도 2는 둥근마 추출 뮤신 성분의 겔 여과 크로마토그램(Gel filtration chromatogram) 및 분자량별 표준 덱스트란(Dextran)의 용출곡선을 나타낸 도이다.
도 3은 둥근마 뮤신 및 수용성 식이섬유소를 이용한 생균제 제조 공정도을 나타낸 도이다.
도 4는 둥근마 뮤신 및 수용성 식이섬유소에 의한 유산균 생균체의 마이크로 코팅 성상을 전계방사형 주사전자현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 5는 둥근마 뮤신 및 수용성 식이섬유소에 의한 유산균 생균체의 수용액 상에서의 pH에 따른 제타-포텐셜 관찰을 나타낸 도이다.
도 6은 둥근마 뮤신 및 수용성 식이 섬유소에 의한 유산균 생균체의 경구투여에 따른 실험동물 분변 중의 유산균 수의 증강 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 코팅 생균제 투여에 따른 분변 내 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 활성 변화의 관찰을 나타낸 도이다.
도 8은 코팅 생균제 투여에 따른 분변 내 트립토파나제(Tryptophanase) 활성 변화의 관찰을 나타낸 도이다.
도 9는 코팅 생균제 투여에 따른 분변 내 유레이즈(Urease) 활성 변화의 관찰을 나타낸 도이다.
도 10은 코팅 생균제 투여에 따른 분변 내 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 활성 변화의 관찰을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 식용 미생물을 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소로 코팅한 생균제를 제공한다.
상기 식용 미생물은 유산균, 곡균, 고초균, 담자균 또는 효모균으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 유산균은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가제리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 식물성 뮤신은 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)로부터 추출된 것을 포함하고, 상기 식물성 뮤신은
1) 둥근마에 물을 용매로 가한 후, 압축 여과하여 둥근마 추출물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 둥근마 추출물을 동결건조하는 단계로 제조되는 것을 포함한다.
또한, 단계 2)의 동결건조된 둥근마 추출물을 유기용매로 침적하여 겔 여과 또는 막분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 수용성 식이 섬유소는 치커리 파이버(chicory fiber), 폴리-덱스트로스(poly-dextrose), 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin), 펙틴(pectin) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소는 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합된 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소는 1:1 내지 1:3의 비율로 포함하는 식물성 미생물 코팅제를 제공한다.
상기 식물성 뮤신은 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)로부터 추출된 것을 포함한다. 또한, 상기 식이 섬유소는 치커리 파이버(chicory fiber), 폴리-덱스트로스(poly-dextrose), 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin), 펙틴(pectin) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소는 1:2의 비율로 혼합된 것이 바람직하고, 상기 미생물은 유산균, 곡균, 고초균, 담자균 또는 효모균으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 유산균은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가제리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 식용 미생물을 배양하여 미생물 균체액을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조한 미생물 균체액과 식물성 뮤신 및 식이 섬유소를 혼합하는 단계; 및
3) 단계 2)의 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 혼합된 미생물 균체액을 동결건조한 후, 분체화하는 단계를 포함하는 생균제 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 식용 미생물은 유산균, 곡균, 고초균, 담자균 또는 효모균으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 단계 2)의 식물성 뮤신은 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)로부터 추출된 것을 포함한다. 또한, 상기 단계 2)의 수용성 식이 섬유소는 치커리 파이버(chicory fiber), 폴리-덱스트로스(poly-dextrose), 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin), 펙틴(pectin) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 단계 2)의 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소는 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합된 것이 바람직하고, 상기 마이크로 코팅 또는 미세캡슐화(microencapsulation)란 일반적으로 영양성분, 유익균 등의 특정 조건에 불안정한 물질을 위산, 열, 염도, 수분 등으로부터 보호하거나 용해성, 분산성을 높이기 위하여 지방, 젤라틴, 당질 등의 보호물질을 사용하여 미세 포장하는 기술을 말하는 것으로, 본 발명에서는 ‘코어’로서 유산균을, 코팅제로서 마추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용하여 위산에 의해 사멸되는 유산균을 최소화한 방법을 말한다. 상기 마추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소로 코팅된 유산균이 포함된 제품 내의 생균체들은 위산 및 소화효소에 의해 사멸되지 않고 장관에 도달되어 소장 및 대장 내에서의 유산균의 활성화를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)에서 얻어진 뮤신 성분 내 고분자 물질의 분포를 표준 덱스트란(dextran)을 사용하여 얻은 지표물질의 표준곡선과 비교시 70 kDa과 476 kDa의 2종의 물질 분포를 확인하였고, 이때, 전당과 단백질의 분석 피크가 일치하는 분포가 나타났는데 이를 통하여 둥근마 뮤신 성분 내 고분자 물질은 당과 단백질체가 강하게 결합되어 있는 당단백체로서의 뮤코-다당류(muco-polysacharide) 성분임을 확인하였다(도 2참조).
또한, 본 발명에 제조방법에 따른 마추출 뮤신 및 수용성 식이섬유소를 이용한 생균제 제조 후, 분체화한 생균제의 성상을 전자현미경으로 관찰한 결과 양호한 코팅 피복 성상을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명에 제조방법에 따른 마이크로 코팅한 유산균 생균제와 대조구 분말의 생균수를 비교 분석하여 생균제 제조공정상의 생산성 개선 효과를 확인한 결과, 각 실험구에서의 유산균 회수율은 비코팅 대조구에 비교하여 대략 24~33% 정도 회수율이 증가하는 경향을 확인하였다(표 2 참조). 또한, 본 발명에 제조방법에 따른 마이크로 코팅한 유산균 생균제를 장용성 제제로서의 방출특성을 확인하기 위하여 제타-포텐셜을 pH를 달리하여 가면서 측정한 결과, 실험구 모두 모두 산성의 조건에서는 제타-포텐셜의 절대값이 낮은 반면 중성 및 알칼리 조건에서는 제타-포텐셜의 절대값이 증가하는 경향을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 뮤신 및 식이섬유소 마이크로 코팅 생균제를 pH 2.4의 인공위액 조건에서 노출시킨 후 생균수를 측정하여, 위액 조건 중에서의 생균체의 안정성을 확인한 결과, 비코팅 대조 실험구의 경우에는 강산성의 인공위액 조건에 노출 시킨 후 생균체의 생존율은 반응 전에 비교하여 13.6% 정도로 감소하는 경향을 확인하였고, 본 발명의 뮤신 및 식이섬유소 마이크로 코팅 생균제의 경우에는 대조 실험구에 비교하여 전반적으로 생존율이 크게 향상되는 경향을 나타내어 위액조건에서의 생균체 안정성이 개선되는 경향을 확인하였다(표 3 참조). 또한, 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 장내 조건에서의 용출성을 판단하기 위하여 인공장액 용액을 사용하여 확인한 결과, 마이크로 코팅 생균제의 용출성은 초기에는 약간 감소하는 경향을 나타냈으나 장액조건에서의 노출 시간이 증가함에 따라 용출성이 증가되는 경향을 나타내었으며 비코팅한 대조구의 생균제와 거의 유사한 용출 특성을 확인하였다(표 4참조). 또한, 뮤신 및 식이섬유소로 마이크로 코팅된 생균제의 장기간 유통시 생균의 안정성을 검토하기 위하여 가속시험 안정성을 확인한 결과, 비코팅 대조구의 생균제와 비교시에는 개선된 생균 안정성을 확인하였다(표 5 참조). 또한, 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 정장성을 확인하기 위하여, 생균제 투여 기간 중의 분변 내 유산균 수의 변화를 확인한 결과, 분변 내 유산균의 수는 비투여군에 비해 투여군에서 급격히 지수적인 증가 경향을 나타냈는데, 이는 생균제 경구 투여의 결과로서 볼 수 있으며 비코팅 생균제의 투여군과 비교시에는 코팅 생균제 투여군에서 보다 급격하게 분변 내 유산균의 증가 경향을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 경구투여 실험기간 중 1주 단위로 분변을 채집하여 분변 내에 존재하고 있는 여러 효소 활성 중에서 유해 미생물에 의해 생산되고 발암물질이나 여러 장내 유해물질의 생성을 촉진하는 반응에 관련되어 장관 내 유해효소로서 널리 알려져 있는 β-glucuronidase, Tryptophanase, Urease, β-glucosidase의 활성을 측정하여 코팅 생균제의 급여에 따른 장내 유해효소의 감소경향을 관찰하였고, 특히 식물성 뮤신 및 수용성 식이섬유소로 결합 코팅시킨 생균제 투여군에서 효소활성이 보다 더 감소되는 경향을 확인하였다(도 7 내지 도 10 참조).
따라서, 본 발명의 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)에서 추출하여 분리한 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 미생물 생균제 제조방법은 생균제의 생산 수율을 향상시키고, 내산성, 내담즙성 및 장내정착성을 개량시키는 것을 확인함으로써, 상기 생균제가 경구섭취 시의 생리기능 효과를 극대화시키고 유통 과정 중의 생균의 생존력이 강화된 미생물 생균제 제조공정에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 생균제를 유효성분으로 함유하는 장관 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 생균제를 유효성분으로 하는 복합조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 구강, 설하, 비강, 직장 또는 피하 내로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르나, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 정상인(표준 체중 60 kg)을 기준으로 10 내지 1000 mg 투여범위 내에서 1일 1회 내지 3회 나누어 투여될 수 있으나, 반드시 이제 제한되는 것은 아니며 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 생균제를 유효성분으로 함유하는 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 생균제를 혼합한 조성물은 장관 면역 증진을 목적으로 상기 복합조성물을 식품, 음료 등의 건강기능식품이나 일반 식품에 첨가할 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 생균제를 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품이나 일반 식품 중의 상기 복합조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 복합조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당 등 모노사카라이드, 예를 들어, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 생균제는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 생균제는 천연 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 생균제를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 둥근마 ( Dioscorea opposita Thunb .) 덩이뿌리에서 점질성 뮤신( mucin ) 성분의 분리 및 제조
둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)(춘천지역농가, 한국)를 세척 후에 박피하여, 70% 에탄올 용액에 1시간 이상 침지하여 살균하였다. 상기 박피 및 살균된 둥근마 시료를 습식분쇄기에서 미세한 입자로 습식분쇄를 하여, 10배량의 무균수를 가하여 강하게 교반하여 균질화하고, 압착 여과하여 불용성 섬유소를 제거한 1차 추출용액을 제조하였다. 상기 불용성 섬유소가 제거된 1차 추출 용액을 2 내지 10℃의 저온실에서 24시간 이상 방치하여 자연침적시키거나 원심분리하여 불용성의 잔류 전분질을 완전히 제거한 상등액을 취하여 2차 추출액을 제조한 후, 동결건조 및 분체화하여 '둥근마 추출 수용성 뮤신 동결건조 분말'을 획득하였다(도 1).
상기 과정을 통하여 수득한 둥근마 추출 동결건조 분말은 뮤신 성분이 주요 성분으로서 수용성 및 점질성 물성 거동을 나타냄으로서, 추가적인 완전 정제 공정 없이도 생균제 생산과 관련한 실제 공정에 있어 동결보호제 및 생균 코팅제로 용이하게 사용할 수 있다. 또한, 상대적인 비교를 위하여 열풍건조하여 획득한 분말시료는 물에서의 용해도 및 점질성 특성을 상실하여 본 발명에서 얻고자 했던 동결보호제 및 생균체 결합제로서의 역할을 수행하기에 적합하지 않은 것을 확인하였다.
한편, 둥근마 추출 뮤신 내에 존재하는 점질성 고분자 물질의 분포 및 함량을 조사하기 위하여, 상기 2차 추출액에 대하여 3배량의 에탄올을 가하여 유전상수의 차이에 의하여 고분자 물질을 응집시켰다. 상기 응집물을 회수하여 5배량의 무균수를 가하여 용해시킨 후, 상온에서 감압 농축하여 잔류 에탄올을 제거시키고 동결건조 분말화하여 부분정제 뮤신 분말을 수득하였다.
뮤신 성분 내 고분자 물질의 분포 및 분자량을 조사하기 위하여 Sepharose CL-4B 컬럼(GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 충진한 유리 컬럼(주입 부피: 10% crude mucin 용액 2 ㎖, 용출속도: 2 ㎖/min.)을 이용하여 젤 필트레이션(gel filtration)을 수행한 후 각 분획을 취하여 전당 및 단백질을 분석하여 함량이 높은 분획을 수집하여 모은 후 동결건조 하여 2차 정제 분말 시료를 수득하였다. 분자량별 분획이 이루어지는 2차 정제 뮤신을 실제 생산공정에서 대량으로 획득하고자 하는 경우에는 대용량의 젤여과 컬럼을 구성하는 비용을 고려할 때 통상적인 생물공정에서 분자량별 분획생산에 널리 사용되고 있는 한외여과에 의한 막분리 공정을 함께 사용할 수 있다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 2차 정제 과정에서 얻어진 뮤신 성분 내 고분자 물질의 분포는 여러 분자량의 표준 덱스트란(dextran)(40 kDa, 200 kDa, 500 kDa 및 2000 kDa)을 사용하여 얻은 지표물질의 표준곡선과 비교시 70 kDa과 476 kDa의 2종의 물질 분포를 나타내었다. 이때, 전당과 단백질의 분석 피크가 일치하는 분포가 나타났는데 이를 통하여 둥근마 뮤신 성분 내 고분자 물질은 당과 단백질체가 강하게 결합되어 있는 당단백체로서의 뮤코-다당류(muco-polysacharide) 성분임을 확인하였다. 통상적으로 당과 단백질체에는 다양한 작용기가 존재하고 있어 동결시 발생하는 얼음 입자에 의한 미생물이나 조직 세포의 상해를 방어할 수 있으며, 강한 점성을 보유하고 있는 뮤신 성분 내 고분자 물질의 물성 특성은 생균제 내 입자간에 강력한 결합제로서 작용할 수 있으므로 둥근마 추출 뮤신 성분은 우수한 동결보호제 기능과 함께 유용한 생균체 결합제로서의 역할을 동시에 기대할 수 있음을 확인하였다(도 2).
한편, 젤 여과를 통하여 획득한 2종의 2차 정제물 분획은 별도 수집하여 모은 후 각 고분자 물질을 구성하는 단위성분의 종류와 결합방식, 분지구조, 그에 따른 유변학적 물성 거동을 밝히는 유용한 시료로 사용할 수 있으나 미생물 생균제의 품질개량에 관련한 본 발명의 목적과는 크게 부합하지 않으므로 단위성분의 구성 및 구조특성을 밝히는 작업은 더 이상 수행하지 않았다.
생균체의 동결보호 효과를 강화시키거나 균체 및 세포간의 결합조직 형성에 사용할 수 있는 수용성 뮤신은 습식분쇄 후 1차 및 2차 여과를 거쳐 불용성 섬유질과 잔류 전분질을 제거하여 곧 바로 동결건조 분말화한 것과 여과 공정을 거친 후 에탄올이나 아세톤과 같은 유기용매 침적공정을 통하여 부분정제한 후, 동결건조 분말화한 것과 젤 여과 또는 한외 여과와 같은 막 분리 공정을 추가하여 분리한 2종의 정제 뮤신 성분을 모두 선택적으로 사용할 수 있다.
< 실시예 2> 둥근마 추출 수용성 뮤신 및 식이 섬유소를 피복 코팅한 유산균 생균제의 제조
둥근마 추출 뮤신 및 널리 상용화되어 있는 수용성 식이 섬유소로서 치커리 파이버, 폴리-덱스트로즈, 난소화성 덱스트린을 미생물 동결보호제 및 코팅피복 결합제로서 대표적인 유산간균 균종인 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균체액에 혼합 첨가하여 유산균 프로바이오틱스 제제를 제조하였다. 생산 공정 중에 미생물의 고농도 배양 및 균체 회수방법은 상기 균종에 최적화된 각각의 배지 조건 및 배양조건, 균체 회수공정을 사용하였으며, 생물공정상의 보편타당한 통상적인 생산방법을 사용하였다.
구체적으로, 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)균의 배양 후 회수된 균체액에 대하여 1:3의 부피비(실시예; 균체액 5L: 동결보호제 및 코팅제 조성액 15L) 비율로 동결보호제 및 코팅제 액을 혼합하고 균질화하여 동결건조한 후 분체화하여 생균제를 제조하였다. 마추출 뮤신 및 식이섬유소 성분은 물에 완전히 용해시킨 후 살균하여 냉각시키고 회수균체액에 혼합 및 균질화하여 코팅결합제를 형성시킨 후 동결건조하여 분체화하였다. 동결건조 과정에서 물이 제거되면서 미생물 생균체들은 마추출 뮤신 및 식이섬유소의 점착성 특징 때문에 서로 부착하여 강하게 결합한 형태를 지니면서 피복되는 마이크로 캡슐화 조직을 형성하게 된다. 동결건조 케이크를 건식분쇄한 후, 전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, S4300, HITACHI, 일본)으로 입자의 성상을 관찰한 결과 생균체들이 양호하게 피복된 입자 성상을 관찰할 수 있었다. 이때, 대조구로는 미생물의 동결보호제로서 널리 사용되고 있는 트레할로즈(Trehalose)를 단독으로 사용한 것과 마추출 뮤신 성분 및 수용성 식이섬유소를 혼합하여 사용한 것을 같은 벳치에서 생산한 동일한 균체 회수액에 대하여 동일한 비율로 동일한 공정 내에서 제조하였다.
또한, 코팅제의 제조 실험에 사용한 마추출 뮤신 및 수용성 식이섬유소를 이용한 제조공정도는 도 3에 나타내었고, 동결보호제 및 코팅제 세부 조성의 예는 하기 [표 1]에 나타내었다.
그 결과, 도 3 내지 도 4에 나타낸 바와 같이, 마추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용하여 미생물 코팅제를 형성시킨 후, 분체화한 생균제의 성상을 전자현미경으로 관찰한 결과 양호한 코팅 피복 성상을 확인하였다(도 3 및 도 4).
아울러, 본 발명에서는 유산균으로서 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균체액을 사용한 코팅 예를 들었으나 이러한 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 생균제 코팅 방법은 유산균을 포함하여 곡균, 고초균, 담자균, 효모균 등 식용 가능한 모든 미생물 종에 사용이 가능하다.
마추출 뮤신 및 수용성 섬유소 코팅액 조성
구 분 식물성 뮤신 및 식이섬유소 코팅액 조성비(w/v %)
대조구
( 비코팅 ) 		Trehalose 30
실험구 1 마추출 뮤신 10
치커리 파이버 20
실험구 2 마추출 뮤신 10
폴리덱스트로즈 20
실험구 3 마추출 뮤신 10
난소화성 덱스트린 20
< 실험예 1> 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이섬유소 마이크로 코팅 유산균 생균제 제조시의 생산성 개선 효과 확인
상기 <실시예 2>에서 수득한 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용하여 마이크로 코팅한 유산균 생균제와 대조구 분말의 생균수를 비교 분석하여 생균제 제조공정상의 생산성 개선 효과를 확인하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 실험구에서의 유산균 회수율은 비코팅 대조구에 비교하여 대략 24~33% 정도 회수율이 증가하는 경향을 보였으며, 생균수에 있어서 1011cfu/g 이상의 고농도 범위에서의 분석치 임을 감안할 때 매우 의미있는 생산성 개선효과로 평가할 수 있었는데 이는 작용기를 많이 보유하고 있고 얼음의 동결입자에 대하여 완충하는 고분자 점질물로서의 뮤신 및 식이섬유소의 물성 특성이 생균체의 급속동결 및 동결건조 공정 중에 동결보호제로서의 작용을 보다 강화시킨 결과로 판단되었다(표 2).
본 발명에서는 균종이 많은 관계로 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균종에 대한 실험 예만 들어 설명하였으나 프로바이오틱스 제제로서 국내 외 유통 중인 여러 유산간균, 유산구균 및 비피더스균, 효모, 곡균, 고초균 등 당사에서 생산 중인 다양한 균종에 대하여 동일한 제조공정을 사용하여 지속적으로 검토한 결과 모든 미생물 균종에서 유사한 경향으로 생산성 개선 효과가 관찰되었다.
둥근마 추출 뮤신 및 수용성 섬유소 첨가물 조성에 따른 생균 수율 개선 효과
구분 배양액
( cfu /㎖) 		원말
( cfu /g) 		수율(%)
대조구 7.0×109 3.1×1011 44.3
실험구 1 7.0×109 5.3×1011 75.7
실험구 2 7.0×109 5.4×1011 77.1
실험구 3 7.0×109 4.9×1011 70.0
비고 실험 균종: Lactobacillus acidophilus
** 500L 배양시 5Kg의 비율로 생균제 원말 수득
< 실험예 2> 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 제타-포텐셜( zeta - potential ) 확인
상기 <실시예 2>에서의 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 섬유소 코팅 생균제와 대조구의 수용액상에서의 제타-포텐셜을 pH를 달리하여 가면서 측정하였다. 수용액 상에서 입자 표면은 + 또는 - 전하로 하전되어 있는데, 반대전하를 띤 이온들이 고농도로 결합하고 있는 내부 고정층과, 같은 전하와 반대 전하의 이온들이 균형을 이루고 함께 존재하는 외부 이온확산층의 2중층 구조를 형성하게 된다. 이때 입자에 가까운 쪽의 고정층은 입자와 함께 거동하는 특성을 나타내고, 이온확산층은 용매와 함께 거동하는 특성을 나타내게 된다. 고정층과 이온확산층 사이에 존재하고 있는 미끄러지는 경계면 근처의 전하를 측정한 것이 제타-포텐셜이며, 같은 전하로 하전된 입자 사이의 척력 또는 반발력의 척도가 되고 있다. 일반적으로, + 또는 - 전하와 관계없이 제타-포텐셜의 절대값이 클수록 입자간 반발력이 커지고 분산성이 좋아져서 입자의 용해도가 커지는 반면에, 제타-포텐셜의 절대값이 낮아질수록 입자간의 응집이나 침전되는 현상이 발생하여 입자의 용해도가 낮아지는 특성을 나타내게 된다. 유산균 제제와 같은 경구섭취용 미생물 생균제의 경우에 산성조건인 위산이나 담즙산 용액에 노출되는 경우에 산성용액 내에서의 생균제 입자의 용해도가 높아 생균체의 용출 및 방출성이 큰 성상을 지니고 있으면 생균이 강산 조건에서 쉽게 사멸되어 본래의 생리기능을 발휘할 수 없게 된다. 반면에 중성 pH 근처의 장액 조건에서 생균제 입자는 보다 용이하게 용해되어 입자 내의 생균체를 신속하게 방출하여 장내 정착성을 강화시키는 장용성 거동을 지니고 있어야 본래의 생균제 경구섭취의 효과를 크게 기대할 수 있다. 즉, 생균제 입자의 제타-포텐셜 값이 산성조건에서는 낮고 중성 이상의 조건에서 높은 경향을 나타낸다면 위산이나 담즙산에 노출시에는 생균제 입자 사이에 서로 응집하는 불용성 거동을 하여 입자 내 미생물 생균체가 산성용액에 노출되어 사멸하는 현상을 방어하게 되고, 소장 및 대장에 도달시에는 중성 pH의 조건에서 입자의 분산성 및 용해도가 높아져 생균을 신속하게 방출하여 장내에 고농도로 정착하게 함으로서 생균제 본연의 생리기능을 극대화시킬 수 있다. 따라서, 미생물 생균제 입자의 수용액상에서의 pH에 따른 제타-포텐셜 값은 생균제의 내산성 및 내담즙성과 장용성 거동을 유추할 수 있는 척도로 사용할 수 있다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 실험구 1 에서 3은 모두 산성의 조건에서는 제타-포텐셜의 절대값이 낮은 반면 중성 및 알칼리 조건에서는 제타-포텐셜의 절대값이 증가하는 경향을 확인하였다. 이것은 산성의 조건에서는 - 전하를 띤 이온량이 적으므로 코팅체 입자의 제타-포텐셜값이 낮아 코팅입자는 응집된 상태로 존재하지만, pH가 증가할수록 2중층의 경계면에 OH- 이온의 하전된 전하량이 증가하게 되어, 중성 및 알카리성 조건에서는 입자간의 척력이 강해지고 분산성이 높아지므로 입자의 용해도가 높아지는 것을 나타내는 것이라 볼 수 있다. 이러한 본 발명의 실험구 1에서 3의 제타-포텐셜의 분석 결과로부터, 마추출 식물성 뮤신 및 수용성 식이섬유로 마이크로 코팅된 생균제의 경구투여시 강산성의 위액 및 담즙산에 노출된 조건에서는 코팅 미생물제의 입자들은 응집하여 낮은 용해도 특성을 나타내어 생균체의 방출을 억제하는 반면에, 중성 pH의 장에 도달하면 입자간 분산성이 높아져 높은 용해도 특성을 나타내어 신속하게 생균체를 방출시킴으로서 장용성 제제가 갖추어야 할 이론적인 방출거동 특성을 정확하게 보유하고 있다고 평가할 수 있었다. 한편, 대조실험구로서 동결보호제로서 트레할로스(Trehalose) 만으로 조성한 경우에는 실험구 1에서 3의 경우와 비교할 때 산성조건에서는 제타-포텐셜의 값이 상대적으로 높았고, 중성 이상의 pH 조건에서는 제타-포텐셜의 값이 상대적으로 낮아 장용성 제제로서의 방출특성 거동이 미약함을 확인하였다(도 5).
이상의 결과에서 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소로 마이크로 코팅한 미생물제제는 경구섭취시에 일반적인 미생물제보다 내산성 및 내담즙성과 장용성 방출 거동이 강화됨으로써 장내정착성이 향상되어 보다 용이하게 본래의 생리활성 기능을 발휘할 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 3> 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 인공 위액 내에서의 안정성 확인
상기 <실시 예 2>의 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제를 pH 2.4의 인공위액 조건에서 노출시킨 후, 생균수를 측정하여, 위액 조건 중에서의 생균체의 안정성을 확인하였다.
구체적으로, 인공위액 조건은 식품 붕해도 시험 상의 인공위액 조건을 사용하였으며(염화나트륨 2.0 g, 묽은 염산 24.0 ㎖/ℓ, pH 1.2), 10% 농도로 생균제 분말을 첨가한 후 위 수축 운동을 고려하여 분당 100회의 왕복운동을 실시하였고, 인공위액에서의 노출시간은 2시간 동안 30분 간격으로 시료를 채집하여 생균수를 측정하였다. 대조구 시료로는 코팅처리하지 않은 생균제와 비교하였으며 모든 시료액은 인공위액 조건 노출 후에 pH를 7.0으로 재조정 후 통상적인 생균수 정량방법에 따라 분석하였다.
그 결과, 표 3에 나타나는 바와 같이, 비코팅 대조 실험구의 경우에는 강산성의 인공위액 조건에 노출을 시킨 후, 생균체의 생존율은 반응 전에 비교하여 13.6% 정도로 감소하는 경향을 확인하였다. 한편, 본 발명의 뮤신 및 식이섬유소 마이크로 코팅 생균제의 경우에는 대조 실험구에 비교하여 전반적으로 생존율이 크게 향상되는 경향을 나타내어 위액조건에서의 생균체 안정성이 개선되는 경향을 확인하였다. 강산성의 위액 조건에서 생균체의 안정성이 상대적으로 증가한 것은 사용된 코팅제가 산성의 수용액 상태에서는 응축하여 결정 상태를 유지하는 효과와 마이크로 코팅 성분의 완충작용에 의한 것으로 판단되며, 실제 생체 내 경구섭취 시에 위를 통과하는 동안의 생균체 사멸 현상의 개선에 크게 기여할 수 있음을 확인하였다(표 3).
인공 위액 조건에서의 생균 안정성 관찰

구 분 		검출 시간대별 생균수( cfu / ml )
최 종
생존율(%)
0분 30분 60분 90분 120분
비코팅 대조구 3.1×1010 9.7×109 6.3×109 5.5×109 4.2×109 13.6
실험구 1 5.3×1010 4.6×1010 3.3×1010 2.8×1010 2.2×1010 41.5
실험구 2 5.4×1010 4.9×1010 4.1×1010 3.3×1010 2.9×1010 53.7
실험구 3 4.9×1010 4.1×1010 3.7×1010 3.1×1010 2.4×1010 48.9
< 실험예 4> 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 인공 장액 내 용출성 확인
둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 장내 조건에서의 용출성을 판단하기 위하여 인공장액 용액(pH 6.80. 2N 인산이수소칼륨시액 250 ㎖, 0.2N 수산화나트륨시액 118 ㎖/ℓ)을 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에서의 생균제를 10% 농도로 인공장액 용액에 투입한 후 장내 연동운동 조건을 고려하여 분당 100회 회전진탕하였으며, 20분 단위로 상층액을 취하여 생균의 검출 정도를 관찰하였다. 인공장액 조건에 노출시의 생균체 방출 거동을 관찰하기 위하여 회전진탕액의 상등액을 채집한 후 채집액 내의 생균수를 측정하여, 인공장액조건에서의 생균체의 방출성을 확인하였다.
그 결과, 표 4에 나타나는 바와 같이, 코팅되지 않은 대조구와 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 피복 코팅 생균제의 장액 조건에서의 용출성을 비교해서, <실시예 2>의 마이크로 코팅 생균제의 용출성은 초기에는 약간 감소하는 경향을 나타냈으나 장액조건에서의 노출 시간이 증가함에 따라 용출성이 증가되는 경향을 나타내었으며 비코팅한 대조구의 생균제와 거의 유사한 용출 특성을 확인하였다. 이와 같이 pH 6.8의 장액 조건에서 뮤신 및 식이 섬유소로 강하게 피복된 생균제에서도 비코팅 대조구와 비교시 거의 동일한(신속한) 용출특성이 관찰됨으로써, 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 생체 내 경구 투여 시에 위액 조건을 견뎌내고 장내에 도달한 코팅 생균제 내의 생균체는 장액조건에서는 신속히 방출됨으로써 생균제 본래의 생체 내 생리활성 효능 발휘가 보다 강화될 수 있음을 확인하였다(표 4).
인공 장액 조건에서의 생균체 방출성 관찰

구 분 		검출 시간대별 생균수( cfu / ml )
원 생균수 20분 40분 60분 80분
비코팅 대조구 3.1×1010 2.9×1010 3.1×1010 3.1×1010 3.1×1010
실험구 1 5.3×1010 4.3×1010 5.0×1010 5.3×1010 5.3×1010
실험구 2 5.4×1010 5.1×1010 5.4×1010 5.4×1010 5.4×1010
실험구 3 4.9×1010 4.2×1010 4.8×1010 4.8×1010 4.8×1010
< 실험예 5> 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 가속시험 안정성 확인
둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소로 마이크로 코팅된 생균제의 장기간 유통시 생균의 안정성을 검토하기 위하여 가속시험 안정성을 평가하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>의 마이크로 코팅 생균제를 100g 단위로 Al 파우치 포장지에 각각 소분하여 밀봉포장하였으며, 40℃, 상대습도 70% 조건에서 보존하면서 2주 간격으로 생균수를 비코팅 대조구의 생균제와 비교 측정하여 생균제의 가속시험 안정성에 관련한 개선 효과를 관찰하였다. 통상적으로 생균체에 대하여 가혹한 조건이 가해지는 가속시험 상태에서는 락토코커스 락티스(L. lactis), 엔테로코커스 페시움(E. faecium), 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis)와 같은 유산구균 종들의 생균제에서는 그 경향이 덜하긴 하지만 대부분의 유산간균, 비피더스균 종들의 생균제에서는 생균체는 지수적 경향으로 사멸하는 현상을 나타낸다.
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 가속시험 조건에서 뮤신 및 식이섬유소로 피복 코팅된 생균제의 경우에도 가혹한 조건에서의 장기 보존시에 사멸하여 가는 현상을 완전히 방어할 수는 없었으나 비코팅 대조구의 생균제와 비교시에는 매우 개선된 생균 안정성을 확인하였다(표 5).
가속시험 조건(40℃, 상대습도 70%)에서의 생균체 안정성 관찰

구 분 		검출기간( Week )별 생균수 ( CFU /g)
최 종
생존율(%)
0 2 4 6 8
비코팅 대조구 3.1×1011 1.2×1011 6.5×1010 1.1×1010 2.7×109 0.8
실험구 1 5.3×1011 3.6×1011 1.0×1011 7.7×1010 4.9 ×1010 9.3
실험구 2 5.4×1011 3.9×1011 1.7×1011 9.4×1010 6.7×1010 12.4
실험구 3 4.9×1011 2.7×1011 1.2×1011 7.8×1010 5.3×1010 11.0
따라서, 본 발명에 따른 <실시예 2>의 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소로 마이크로 코팅한 생균제들은 전체적으로 비코팅 생균제에 비교하여 인공 위액 조건에서 생균체의 사멸 현상이 억제되어 안정적으로 유지되고 인공 장액조건에서는 신속한 방출 특성을 나타내는 장용성 제제로서의 물성 거동을 나타냈으며, 가속시험 보존시험에서도 보다 개선된 생균 안정성 특성을 발휘하고 있어 생균제의 품질 개량 및 경구섭취시 효능강화에 크게 기여할 수 있음을 확인하였다.
< 실험예 6> 둥근마 추출 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 정장성 확인
둥근마 추출 식물성 뮤신 10%, 폴리덱스트로즈 7%, 치커리 파이버 7%, 난소화성 덱스트린 7%로 조성한 코팅액을 사용하여 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 등 3종 유산균의 코팅제제를 제조하여 동일한 비율로 혼합제제를 제조한 후 실험동물에 4주간 경구섭취시키면서 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 마이크로 코팅 생균제의 정장성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험동물로는 생후 4주된 Sprague-Dawley 종 수컷 흰쥐 15마리를 실험 시작 전 2주 동안 고형배합사료를 먹이면서 실험실 환경에 적응시켜 사용하였으며 이들을 체중에 따라 5마리씩 3군으로 나누었는데, 한 군은 대조군(Blank)으로 생균제를 투여하지 않았으며 한 군은 비코팅 생균제 투여군(non-coated)으로 나머지 한 군은 코팅제 투여군(MF-coated)으로 하였다. 모든 군은 자유롭게 식이와 식수를 먹게 하고 대조군은 그냥 생리 식염수를, 생균제 투여군은 각 흰쥐 한 마리당 1×108개의 생균 농도로 매일 일정한 시간에 인위적인 경구 투여를 실시하였다. 생균제의 경구투여와 체중의 측정은 매일 항상 일정한 시간에 실시하였으며 식이와 식수 급여량의 측정은 일주일에 3회 측정하였다. 각 실험군 별로 매일의 식이 섭취 및 식수 섭취에는 유의적인 차이가 없었으며, 각 실험군에 따른 실험기간 동안의 체중의 증가에도 유의적인 차이는 없었다.
생균제 투여 기간 중 1주일 간격으로 각 실험군의 분변을 채집하여 분변의 수분함량과 pH를 측정하였고, 분변 중의 유산균 수를 측정하여 생균제 투여에 따른 유산균의 증가 경향을 관찰하였다. 각 실험군에 있어 실험종료 시점에서의 분변 내 수분 함량은 약 0.2g 정도였고, pH는 중성 근처로서 실험군이나 경구투여 기간에 따른 유의적인 차이는 발견되지 않았다. 생균제 투여 기간 중의 분변 내 유산균 수의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 분변 내 유산균의 수는 비투여군에 비해 투여군에서 급격히 지수적인 증가 경향을 나타냈는데, 이는 생균제 경구 투여의 결과로서 볼 수 있으며 비코팅 생균제의 투여군과 비교시에는 코팅 생균제 투여군에서 보다 급격하게 분변 내 유산균의 증가 경향을 확인하였다(도 6).
따라서, 실험동물에서의 인위적인 생균제 경구투여는 장내 유산균총의 증가 경향으로 나타나며 내산성이 개선된 장용성 방출 거동을 보유하고 있는 뮤신 및 식이섬유소 코팅 생균제의 경구 투여가 비코팅 생균제에 비교하여 보다 양호한 장내정착성을 보유하고 있음을 확인하였다.
또한, 경구투여 실험기간 중 1주 단위로 분변을 채집하여 분변 내에 존재하고 있는 여러 효소 활성 중에서 유해 미생물에 의해 생산되고 발암물질이나 여러 장내 유해물질의 생성을 촉진하는 반응에 관련되어 장관 내 유해효소로서 널리 알려져 있는 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase), 트리토파나제(Tryptophanase), 유레이즈(Urease), 베타-글루코시다제(β-glucosidase)의 활성을 측정하여 코팅 생균제의 급여에 따른 장내 유해효소의 감소경향을 관찰하였다. 이때, 각 효소의 활성은 통상적인 실험법에 따라 하기와 같이 측정하였다:
1) β- glucuronidase 활성
① 생균제를 4주간 경구투여하면서 1주 간격으로 분변을 채집하여 pH 6.5의 인산 완충용액(phosphate buffer)에 현탁하여 조효소액으로 사용하였다.
② 기질 용액으로서 2 mM의 p-nitrophenyl-β-D-glucuronide 용액 0.8 ㎖ 과 조효소액 0.2 ㎖을 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 0.5N-NaOH를 가하여 반응을 중지한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 분변 내 효소 활성을 측정하였다.
2) Tryptophanase 활성
① 생균제를 4주간 경구투여하면서 1주 간격으로 분변을 채집하여 pH 6.5의 phosphate buffer에 현탁하여 조효소액으로 사용하였다.
② complete reagent[pyrophosphate 2.75 mg,　 EDTA.2Na 19.6 mg, 10 mg of BSA in 100 ㎖ of 0.05M patassium phosphate (pH 7.5)] 0.2 ㎖, 20 mM 트리토판(tryptophan) 0.2 ㎖, 조효소액 0.1 ㎖을 혼합하여 37℃에서 1시간 반응하였다.
③ 2 ml의 발색 시약(color reagent)(p-dimethylaminobenzaldehyde 14.7 g, H2SO4 52 ㎖, 95% ethanol 948 ㎖)를 가한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 550 nm에서 흡광도 측정하였다.
3) Urease 활성
① 생균제를 4주간 경구투여하면서 1주 간격으로 분변을 채집하여 pH 6.5의 phosphate buffer에 현탁하여 조효소액으로 사용하였다.
② pH 7.0, 20 mM의 phosphate buffer에 유레아(urea)를 4 mM의 농도로 용해시켜 제조한 기질 용액 0.3 ㎖와 조효소액 0.1 ㎖을 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1N H2SO4 용액을 0.1 ㎖을 가하여 반응을 중지하였다.
③ 용액 1(phenol 5g, sodium nitroprusside 25 mg, 증류수 500 ㎖과 용액 2(NaOH 2.5g, Na2HPO4.12H2O 26g, NaOCl 5 ㎖, 증류수 495 ㎖)를 각각 1 ㎖ 씩 가하고 60℃에서 20분간 반응시키고 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4) β- glucosidase 활성
① 생균제를 4주간 경구투여하면서 1주 간격으로 분변을 채집하여 pH 6.5의 phosphate buffer에 현탁하여 조효소액으로 사용하였다.
② 기질로서 2mM의 p-nitrophenyl-β-D-glucucopyranoside 0.8 ㎖과 조효소액 0.2 ㎖을 혼합하여 37℃에서 15분간 반응하였다.
③ 0.5N-NaOH를 가하여 반응을 중지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7 내지 도 10에 나타낸 바와 같이, 각각의 효소별로 시험 방법에 따라 분변 내 유해효소의 반응에 의해 발생되는 흡광도를 관찰한 결과 유산균 생균제를 투여하지 않은 군에 비하여 경구 투여군에서 유해 효소 활성이 감소되는 현상이 4종의 효소분석에서 모두 나타났으며 특히 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소로 결합 코팅시킨 생균제 투여군에서 효소활성이 보다 더 감소되는 경향을 확인하였다(도 7 내지 도 10).
이는 코팅 생균제의 경구투여시에 장관 안에 유산균이 급속하게 증가하는 경향과 일치하는 것으로서 유산균의 신속한 장내 정착에 따라 유해효소를 발생시키는 장내 유해균이 감소되는 현상에 의한 것으로 해석할 수 있다.
이상과 같은 실험 동물을 이용한 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 코팅 유산균 생균제의 정장성 평가 실험에서 유산균 생균제의 인위적인 경구투여는 실험 동물의 분변 내 유산균 수의 급격한 증가와 유해효소 활성의 감소 효과를 가져왔다. 분변 내의 유산균과 같은 유익 미생물의 분포도와 유해효소들의 분포도는 장내 건강 상태를 평가할 수 있는 지표로 볼 수 있는데 특히, 비코팅 생균제의 급여 결과에 비교하여 코팅 생균제에서의 급여 효과가 크게 강화되어 나타난 결과는 당 발명에 의한 식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소 코팅 유산균 생균제의 내산성 강화 및 장용성 방출 거동에 따른 장내정착성의 개선을 의미하고 있는 것으로서 인체에서의 경구투여시에도 보다 개량된 생균제의 정장성 효능효과 발휘를 기대할 수 있었다.

Claims (13)

  1. 유산균, 곡균, 고초균, 비피더스균 및 효모균으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 식용 미생물을 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)로부터 추출된 식물성 뮤신과 치커리 파이버(chicory fiber), 폴리-덱스트로스(poly-dextrose) 및 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 수용성 식이 섬유소로 코팅한 생균제.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유산균은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가제리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생균제.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 식물성 뮤신은
    1) 둥근마에 물을 용매로 가한 후, 압축 여과하여 둥근마 추출물을 제조하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 둥근마 추출물을 동결건조하는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 생균제.
  6. 제 5항에 있어서, 단계 2)의 동결건조된 둥근마 추출물을 유기용매로 침적하여 겔 여과 또는 막분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 식물성 뮤신, 및 수용성 식이 섬유소를 1:1 내지 1:3(w/v)의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 생균제.
  9. 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)로부터 추출된 식물성 뮤신, 및 치커리 파이버(chicory fiber), 폴리-덱스트로스(poly-dextrose) 또는 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 식이 섬유소를 1:1 내지 1:3(w/v)의 비율로 포함하는 유산균, 곡균, 고초균, 비피더스균 및 효모균으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 식물성 미생물 코팅제.
  10. 1) 유산균, 곡균, 고초균, 비피더스균 또는 효모군으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 식용 미생물을 배양하여 미생물 균체액을 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 제조한 미생물 균체액과 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)로부터 추출된 식물성 뮤신, 및 치커리 파이버(chicory fiber), 폴리-덱스트로스(poly-dextrose) 및 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 식이 섬유소를 혼합하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 식물성 뮤신, 및 식이 섬유소를 혼합된 미생물 균체액을 동결건조한 후, 분체화하는 단계를 포함하는 생균제 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제 1항의 생균제를 유효성분으로 함유하는 건강식품 조성물.
  13. 제 1항의 생균제를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.
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