KR20060119869A - 점막 면역 부활 작용을 갖는 유산균 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064) 및 락토바실루스 ONRIC b0240(FERM BP-10065)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유산균 및 이 유산균을 함유하는 점막 면역 부활 작용을 갖는 조성물, 특히 음식품 또는 의약품으로서의 상기 조성물을 제공하는 것이며, 상기 유산균 및 이것을 포함하는 조성물은 우수한 점막 면역 부활 작용을 발휘할 수 있어 생체 방어 기구의 강화에 유용하다.
락토바실루스, 유산균, 점막 면역, IgA

Description

점막 면역 부활 작용을 갖는 유산균 {Lactic Acid Bacteria Having Mucosal Immunopotentiation Effect}
본 발명은 유산균 및 이것을 함유하는 조성물, 특히 점막 면역을 부활할 수 있는 유산균 및 이것을 함유하는 음식품에 관한 것이다.
절임류, 김치, 빵, 술, 된장, 간장 등의 식물성 식품으로부터 많은 유산균이 검출되고 있다. 도꾜 농업 대학 오까다 사나에 교수는 식물성 식품으로부터 검출되는 유산균을 식물성 유산균이라고 하여, 발효유, 치즈 등의 동물성 식품 유래의 유산균과는 구별할 것을 장려하고 있다(문헌 [Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, Vol.13, No.1, pp.23-36(2002)). 이것은 식물성 유산균과 동물성 유산균이 생육 환경에 있어서 상이하고, 특히 식물성 유산균은 상기 균을 이용할 수 있는 당의 종류가 많으며, 항균 물질 내성, 효소 내성, 산소 내성 등의 점에서 보다 가혹한 환경에 적응할 수 있는 능력을 갖는 것에 기초하고 있다.
본 발명자들은 상기 식물성 유산균에 대하여 연구를 거듭하고, 우선 락토바실루스ㆍ플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 속하는 하나의 유산균(ONC141주)을 개시제 (starter)로서 제조한 발효유가 인간의 위장 내 세균총을 개선하는 것(문헌 [구메무라 메구미, 도바 마사미찌, 소가와 요시로, 시미즈 세이찌, 가와구찌 신조, 「장내 세균학 잡지」, 15, 15(2001)]), 변비 기미의 성인의 배변 회수를 증가시키는 것(문헌 [도바 마사미찌, 구메무라 메구미, 무네유끼 사또시, 소가와 요시로, 요시자와 히사오, 야지마 요이찌, 마쯔다 유따까, 이지마 하지메, 「장내 세균학 잡지」, 15, 21(2001)]) 및 병원성 살모넬라균(S. typhimurium)의 경구 감염에 대한 숙주의 저항성을 증강하는 것(IgA 생산 항진 작용, 위장관 점막 활성화 작용)(이께나가 다께시, 야마히라 사또꼬, 나찌 히데끼, 도바 마사미찌, 오까마쯔 히로시, Milk Science, Vol.51, No.1, pp.27-32(2002)])을 보고하였다.
상기 ONC141주(발효유)에서 보여지는 살모넬라 감염의 숙주 저항성의 증강 효과는 이제까지 알려져 있는 식물성 유산균 및 동물성 유산균 중에서도 탁월한 것이며, 따라서 상기 주는 점막 면역 기능을 높여 인간의 생체 방어에 대한 유용성이 높은 것이라고 여겨졌다.
본 발명의 목적은 본 발명자들의 앞선 연구에 관한 유산균에 비하여 한층 더 우수한 점막 면역 부활 작용, 생체 방어 기구의 향상 작용 등을 발휘할 수 있고, 프로바이오틱으로서 유용한 새로운 유산균 및 이것을 포함하는 최종 제품(발효유, 유산균 음료 등의 음식품)을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해, 식물성 유산균을 비롯한 다종 다수의 미생물을 새롭게 입수하고, 이들에 대하여 마우스 파이어판 (mouse Peyer' patch) 세포 배양계를 이용하여 IgA 생산 유도능을 조사하였다. 그 결과, 특히 우수한 IgA 생산 유도능을 갖는 2개의 유산균을 발견하였다. 본 발명은 이 사실을 기초로서 더욱 연구를 거듭한 결과 완성된 것이다.
본 발명은 하기 1 내지 15에 기재된 요지의 발명을 제공한다.
1. 락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064) 및 락토바실루스 ONRIC b0240(FERM BP-10065)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유산균.
2. 상기 1에 있어서, 락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064)인 유산균.
3. 상기 1에 있어서, 락토바실루스 ONRIC b0240(FERM BP-10065)인 유산균.
4. 상기 1에 기재된 유산균과, 가식성 담체 또는 제제학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제를 함유하는 점막 면역 부활 작용을 갖는 조성물.
5. 상기 4에 있어서, 음식품 형태인 조성물.
6. 상기 5에 있어서, 발효유, 유산균 음료, 발효 야채 음료, 발효 과실 음료 또는 발효 두유 음료인 조성물.
7. 점막 면역 부활이 요구되는 사람에게 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 유산균을 섭취시키는, 상기 환자의 점막 면역 부활 방법.
8. 점막 면역 부활이 요구되는 사람에게 상기 4 내지 6 중 어느 하나에 기재된 조성물을 섭취시키는, 상기 환자의 점막 면역 부활 방법.
9. IgA 생산 촉진 처치가 요구되는 사람에게 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 유산균을 섭취시키는, 상기 환자의 IgA 생산 촉진 방법.
10. IgA 생산 촉진 처치가 요구되는 사람에게 상기 4 내지 6 중 어느 하나에 기재된 조성물을 섭취시키는, 상기 환자의 IgA 생산 촉진 방법.
11. 인간의 점막 면역 부활을 위한 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 유산균의 용도.
12. 인간의 점막 면역 부활을 위한 상기 4 내지 6 중 어느 하나에 기재된 조성물의 용도.
13. 인간의 IgA 생산 촉진을 위한 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 유산균의 용도.
14. 인간의 IgA 생산 촉진을 위한 상기 4 내지 6 중 어느 하나에 기재된 조성물의 용도.
15. 상기 4 내지 6 중 어느 하나에 기재된 조성물의 제조를 위한, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 유산균의 용도.
이하, 본 발명의 유산균 및 이것을 포함하는 본 발명의 조성물에 대하여 차례로 설명한다.
본 발명의 유산균
본 발명의 유산균은 본 발명자들이 새롭게 천연물로부터 이하와 같이 분리ㆍ채취(스크리닝)하여 기탁한 것이다. 각각 락토바실루스 (Lactobacillus) ONRIC b0239(FERM BP-10064) 및 락토바실루스 (Lactobacillus) ONRIC b0240(FERM BP-10065)라고 명명된다.
(1) 스크리닝
(1-1) 기원 미생물
기원 미생물로서는 인간 장 내용물, 식물성 식품 및 동물성 식품으로부터 분리되고, 오츠카 세야꾸 가부시끼 가이샤의 오오쯔 영양 제품 연구소에서 보존하고 있는 유산균을 사용한다.
(1-2) 스크리닝 방법
목적으로 하는 유산균의 스크리닝은 마우스 파이어판 세포 배양계를 이용하여 IgA 생산 유도능을 지표로서 실시한다. 상기 스크리닝의 각 조작 등의 상세한 것은 후술하는 실시예 2에 나타낸 바와 같다.
(2) 스크리닝된 미생물
(2-1) 락토바실루스 ONRIC b0239
(a) 육안적 특징
(a-1) MRS 한천 배지
원형으로부터 약간 불규칙, 반구형, 평활, 유백색
(a-2) BL 한천 배지
원형으로부터 약간 불규칙, 반구형, 평활, 백갈색
(b) 현미경적 특징
장대균으로 운동성을 갖지 않음. 아포는 형성하지 않음.
(c) 생육 온도
30 내지 33 ℃에서 양호하게 발육함
(d) 생리학적, 생화학적 특징
그램 염색성: 양성
당 자화성
글리세롤 _
에리트리톨 _
D-아라비노오스 -
L-아라비노오스 -
리보오스 ±
D-크실로오스 ±
L-크실로오스 -
아도니톨 -
β-메틸-D-크실로시드 -
갈락토오스 +
D-글루코오스 +
D-프룩토오스 +
D-만노오스 +
L-소르보오스 -
람노오스 -
둘시톨 -
이노시톨 -
만니톨 -
소르비톨 +
α-메틸-D-만노시드 +
α-메틸-D-글루코시드 ±
N-아세틸-글루코사민 +
아미그달린 +
알부틴 +
에스쿨린 +
살리신 +
셀로비오스 +
말토오스 +
락토오스 +
멜리비오스 +
사카로오스 +
트레할로오스 +
이눌린 -
멜레치토오스 -
D-라피노오스 +
아미돈 -
글리코겐 -
자이리톨 -
β-겐티오비오스 +
D-투라노오스 -
D-릭소오스 -
D-타가토오스 -
D-푸코오스 -
L-푸코오스 -
D-아라비톨 ±
L-아라비톨 -
글루코네이트 -
2-케토-글루코네이트 -
5-케토-글루코네이트 -
이상의 여러가지 성질로부터 문헌 [버지스ㆍ매뉴얼ㆍ오브ㆍ시스테마틱ㆍ박테리올로지(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)]에 비추어 본 균주를 락토바실루스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 속하는 균주라고 동정하여 락토바실루스 ONRIC b0239라고 명명하고, 2003년 8월 6일에 일본국 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 중앙 제6에 주소를 갖는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(AIST)에 기탁 번호 FERM P-19469로서 기탁하였다. 이 미생물은 현재 국제 기탁으로 이관되어 있으며, 그 국제 기탁 번호는 FERM BP-10064이다.
(2-2) 락토바실루스 ONRIC b0240
(a) 육안적 특징
(a-1) MRS 한천 배지
원형으로부터 약간 불규칙, 반구형, 평활, 유백색
(a-2) BL 한천 배지
원형으로부터 약간 불규칙, 반구형, 평활, 백갈색
(b) 현미경적 특징
장대균으로 운동성을 갖지 않음. 아포는 형성하지 않음.
(c) 생육 온도
30 내지 33 ℃에서 양호하게 발육함
(d)생리학적, 생화학적 특징
그램 염색성: 양성
당 자화성
글리세롤 -
에리트리톨 -
D-아라비노오스 -
L-아라비노오스 -
리보오스 ±
D-크실로오스 -
L-크실로오스 -
아도니톨 -
β-메틸-D-크실로시드 -
갈락토오스 +
D-글루코오스 +
D-프룩토오스 +
D-만노오스 +
L-소르보오스 -
람노오스 -
둘시톨 ±
이노시톨 -
만니톨 +
소르비톨 +
α-메틸-D-만노시드 -
α-메틸-D-글루코시드 -
N-아세틸-글루코사민 +
아미그달린 +
알부틴 +
에스쿨린 +
살리신 +
셀로비오스 +
말토오스 +
락토오스 +
멜리비오스 +
사카로오스 +
트레할로오스 -
이눌린 -
멜레치토오스 -
D-라피노오스 +
아미돈 -
글리코겐 -
자이리톨 -
β-겐티오비오스 +
D-투라노오스 -
D-릭소오스 -
D-타가토오스 -
D-푸코오스 -
L-푸코오스 -
D-아라비톨 -
L-아라비톨 -
글루코네이트 -
2-케토-글루코네이트 -
5-케토-글루코네이트 -
이상의 여러가지 성질로부터 문헌 [버지스ㆍ매뉴얼ㆍ오브ㆍ시스테마틱ㆍ박테리올로지]에 비추어 본 균주를 락토바실루스 플란타럼에 속하는 균주라고 동정하여 락토바실루스 ONRIC b0240이라고 명명하고, 2003년 8월 6일에 일본국 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 중앙 제6에 주소를 갖는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(AIST)에 기탁 번호 FERM P-19470으로서 기탁하였다. 이 미생물은 현재 국제 기탁으로 이관되어 있으며, 그 국제 기탁 번호는 FERM BP-10065이다.
본 발명의 조성물
본 발명의 조성물은 본 발명의 유산균을 그 유효 성분으로서 함유하는 것을 필수적인 요건으로 한다. 상기 조성물은 통상의 음식품과 마찬가지로 적당한 가식성 담체(식품 소재)를 이용하여 음식품 형태 내지 의약품 형태로 제조된다. 또한, 상기 조성물은 통상의 의약품과 마찬가지로 적당한 제제학적으로 허용되는 부형제 내지 희석제를 이용하여 의약품 형태로 제조된다.
본 발명의 조성물에 특유한 점막 면역 부활 작용 및 이것에 기여하는 IgA 생산 항진 작용은 다음과 같다고 여겨지고 있다. 즉, 우선 장관 면역계를 구성하는 파이어판의 M 세포가 관강에 있는 항원을 취입한다. 상기 항원은 가지형 세포 등의 항원 제시 세포에 의해 CD4T 세포에 제시된다. 항원 특이적인 T 세포의 작용에 의해 미숙한 B 세포가 성숙하면서 점막 고유층으로 이동하여 최종적으로 IgA 항체생산 세포로 분화한다. 이 IgA 생산 항진 기구에 본 발명의 유산균이 어떻게 관여하는가에 대해서는 현재 명확하지는 않지만, 적어도 본 발명의 유산균의 존재에 의해 IgA 생산 항진이 이루어지기 위해서는 파이어판의 M 세포가 항원을 취입할 필요가 있기 때문에, 본 발명의 유산균은 이 항원으로서의 기능을 다할 수 있는 것이라고 여겨진다. 이 항원으로서의 기능을 다한다는 면에서, 본 발명의 유산균은 특히 생균일 필요는 없다. 통상의 일반적인 가열 멸균 조작에 의해 멸균된 것일 수도 있다. 단, 유산균은 일반적으로 요구르트 등으로서 잘 알려져 있는 바와 같이 생균으로서 섭취됨으로써 정장 작용, 장내 세균총 개선 작용 등에 의한 건강 유지, 장수 등에 효과가 있으며, 본 발명의 유산균도 생균으로서 섭취되는 경우에는 이들 효과를 기대할 수 있기 때문에, 생균으로서 본 발명의 조성물 중에 배합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 유산균(생균)은, 또한 예를 들면 각 유산균의 배양액, 배양물의 조 정제품 내지 정제품, 이들의 동결 건조품 등으로서 본 발명의 조성물 중에 배합하는 것도 가능하다.
상기 배양액은 예를 들면 대표적으로는 각 균주에 적합한 배지, 예를 들면 MRS 배지 등을 이용하여 30 ℃에서 16 시간 정도 배양함으로써 얻을 수 있다.
또한, 균체는 상기 배양 후에, 예를 들면 배양액을 3,000 회전/분, 4 ℃, 10 분간 원심 분리하여 집균함으로써 얻을 수 있다. 이들은 통상법에 따라 정제할 수 있다. 또한, 상기 균체는 동결 건조할 수도 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 동결 건조 균체도 본 발명의 조성물의 유효 성분으로서 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물 중에는 필요에 따라 추가로 본 발명의 미생물의 유지, 증식 등에 적합한 영양 성분의 적량을 함유시킬 수 있다. 상기 영양 성분의 구체예로서는 각 미생물의 배양을 위한 배양 배지에 사용되는, 예를 들면 글루코오스, 전분, 수크로오스, 락토오스, 덱스트린, 소르비톨, 프룩토오스 등의 탄소원, 예를 들면 효모 엑기스, 펩톤 등의 질소원, 비타민류, 미네랄류, 미량 금속 원소, 그 밖의 영양 성분 등의 각 성분을 들 수 있다. 비타민류로서는, 예를 들면 비타민 B, 비타민 D, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 K 등을 예시할 수 있다. 미량 금속 원소로서는, 예를 들면 아연, 셀레늄 등을 예시할 수 있다. 그 밖의 영양 성분으로서는 예를 들면 유과 올리고당, 대두 올리고당, 락툴로오스, 락티톨, 프룩토올리고당, 갈락토올리고당 등의 각종 올리고당을 예시할 수 있다. 이들 올리고당의 배합량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 본 발명의 조성물 중에 1 내지 3 중량％ 정도가 되는 양의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다.
음식품 형태의 본 발명의 조성물의 구체예로서는, 예를 들면 발효유, 유산균 음료, 발효 야채 음료, 발효 과실 음료, 발효 두유 음료 등을 들 수 있다. 본 명세서 및 청구 범위에 있어서, 「발효유」 및 「유산균 음료」라는 용어는, 구 후생성 「우유 및 유제품의 성분 등에 관한 성령」 제2조 37 「발효유」 및 38 「유산균 음료」의 정의에 따르기로 한다. 즉, 「발효유」란 우유 또는 유제품을 유산균 또는 효모로 발효시킨 풀 형태 또는 액상으로 한 것을 말한다. 따라서, 상기 발효유에는 음료 형태와 함께 요구르트 형태가 포함된다. 또한, 「유산균 음료」란 우유 또는 유제품을 유산균 또는 효모로 발효시킨 풀 형태 또는 액상으로 한 것을 주원료로서 여기에 물로 희석한 음료를 말한다.
발효 야채 음료, 발효 과실 음료 및 발효 두유 음료에 대해서는 후술하는 바와 같다.
본 발명의 조성물의 다른 음식품 형태의 예로서는, 균 함유 마이크로 캡슐 형태, 고형 식품 형태(과립, 분말(발효유 동결 건조 분말 등을 포함함), 정제, 발포 제제, 검, 구미 (goumi), 푸딩 등), 상기 발효유 및 유산균 음료 이외의 유제품 등을 들 수 있다.
의약품 형태의 구체예로서는 경구 투여용 제제 형태(수용액, 유화액, 과립, 분말, 캡슐, 정제 등)를 들 수 있다.
이들 음식품 형태 및 의약품 형태로의 제조는 통상법에 따를 수 있다. 또한, 이들 각 형태로의 제조시에 사용되는 담체는 가식성 담체 내지 제제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 등의 담체 중 어느 하나일 수 있다. 음식품 형태로의 제조 및 이 때 사용할 수 있는 가식성 담체의 상세한 것은, 후술하는 「음식품 형태 조성물」의 항에서 기술한다. 특히 식품 형태의 경우에는 입맛을 돋구는 미각 개선 효과가 있는 담체가 바람직하다. 의약품 형태 및 그 제조에 사용할 수 있는 제제학적으로 허용되는 부형제 및 희석제의 상세한 것은, 후술하는 「의약품 형태 조성물」의 항에서 상술한다.
본 발명의 조성물 중으로의 유산균의 배합량은, 일반적으로는 본 발명의 조성물 100 g 중에 균수가 108 내지 1011개 전후(생균수일 필요는 없음, 단, 사균수를 포함하는 경우에는 살균 전의 생균수로서 계수하기로 함, 이하 동일)가 되는 양으로부터 적절하게 선택할 수 있다. 생균수의 측정은 균 배양용 한천 배지에 희석한 시료를 도포하여 37 ℃하에서 혐기 배양을 행하고, 생육한 콜로니수를 계측함으로써 산출한다. 이 생균수와 탁도는 연관되기 때문에, 미리 생균수와 탁도의 상관 관계를 구해 두면, 생균수의 측정 대신에 탁도를 측정함으로써 상기 생균수를 계수할 수 있다. 상기 유산균의 배합량은, 상기 양을 기준으로서 제조되는 본 발명의 조성물의 형태, 사용하는 유산균의 종류 등에 따라 적절하게 변경할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 유산균(주로 생균)을 함유시키는 것이기 때문에, 상기 조성물의 제품화시에는 가열, 가압 등의 조건 채용은 그다지 바람직하지 않다. 본 발명의 조성물을 예를 들면 고형 식품 형태로 조정할 때에는 유산균을 동결 건조 균체로서 직접 처방하거나, 동결 건조 균체를 적당한 코팅제로 가공하여 사용하는 것이 바람직하다.
음식품 형태 조성물
본 발명의 조성물이 취할 수 있는 바람직한 음식품 형태로서는, 대표적으로는 발효유, 유산균 음료, 발효 야채 음료, 발효 과실 음료, 발효 두유 음료 등을 들 수 있다. 이하, 발효 야채 음료, 발효 과실 음료 및 발효 두유 음료에 대하여 상술하면, 이들 각 형태로의 제조는 유산균의 영양원을 포함하는 적당한 발효용 원료 물질, 예를 들면 야채류, 과실류, 두유(대두 유화액) 등의 액체 중에서 유산균을 배양하여 상기 원료 물질을 발효시킴으로써 행할 수 있다. 발효용 원료 물질로서의 야채류 및 과실류에는, 각종 야채 및 과실의 절단물, 파쇄물, 마쇄물, 착즙, 효소 처리물, 이들의 희석물 및 농축물이 포함된다. 야채류에는 호박, 당근, 토마토, 피망, 셀러리, 시금치, 유색 고구마, 옥수수, 비트, 케일, 파슬리, 양배추, 브로콜리 등이 포함된다. 과실류에는 사과, 복숭아, 바나나, 딸기, 포도, 수박, 오렌지, 귤 등이 포함된다.
야채 및 과실의 절단물, 파쇄물 및 마쇄류는, 예를 들면 상기 야채류 또는 과실류를 세정한 후, 필요에 따라 열탕에 넣는 등의 데침 처리 후, 파쇄기, 믹서, 식품 가공기, 분쇄기, 마이콜로이더(MycolloiderTM, 도꾸슈 기까 고교사 제조) 등을 이용하여 절단, 파쇄, 마쇄시킴으로써 얻을 수 있다. 착즙은, 예를 들면 필터 프레스, 쥬스 믹서 등을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 마쇄물을 여과포 등을 이용하여 여과함에 따라서도 착즙을 제조할 수 있다. 효소 처리물은 상기 절단물, 파쇄물, 마쇄물, 착즙 등에 셀루라아제, 펙티나아제, 프로토펙틴 분해 효소 등을 작용시킴으로써 제조할 수 있다. 희석물에는 물로 1 내지 50배 희석한 것이 포함된다. 농축물에는, 예를 들면 동결 농축, 감압 농축 등의 수단에 의해 1 내지 100배로 농축한 것이 포함된다.
발효용 원료 물질의 다른 구체예인 두유는, 통상법에 따라 대두 원료로부터 제조할 수 있다. 상기 두유에는, 예를 들면 탈피 대두를 물에 침지한 후, 콜로이드 밀 등의 적당한 분쇄기를 이용하여 습식 분쇄 처리한 후, 통상법에 따라 균질화 처리한 균질화액, 수용성 대두 단백질을 수중에 용해한 용해액 등도 포함된다.
유산균을 이용한 발효는 미리 개시제를 준비하고, 이것을 발효용 원료 물질에 접종하여 발효시키는 방법이 바람직하다. 여기서 개시제로서는, 예를 들면 대표적으로는 미리 90 내지 121 ℃에서 5 내지 20 분간 통상의 살균 처리를 행한 발효용 원료 물질, 효모 엑기스를 첨가한 10 ％ 탈지 분유 등에 본 발명의 균체를 접종하여 배양한 것을 들 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 개시제는, 통상 본 발명의 유산균을 107 내지 109개/g 배양물 정도 포함하고 있다.
개시제에 사용하는 발효용 원료 물질에는, 필요에 따라 본 발명의 유산균의 양호한 생육을 위한 발효 촉진 물질, 예를 들면 글루코오스, 전분, 수크로오스, 락토오스, 덱스트린, 소르비톨, 프룩토오스 등의 탄소원, 효모 엑기스, 펩톤 등의 질소원, 비타민류, 미네랄류 등을 첨가할 수 있다.
유산균의 접종량은 일반적으로는 발효용 원료 물질 함유액 1 mL 중에 균체가 약 1×106개 이상, 바람직하게는 1×107개 전후로 포함되는 양에서 선택되는 것이 적당하다. 배양 조건은 일반적으로 발효 온도 20 내지 45 ℃ 정도, 바람직하게는 25 내지 37 ℃ 정도, 발효 시간 5 내지 72 시간 정도에서 선택된다.
또한, 상기한 바와 같이 하여 얻어지는 락트산 발효물은, 커드상(curd form) 형태(요구르트 형태 내지 푸딩용 형태)를 갖고 있는 경우가 있으며, 이것은 그대로 고형 식품으로서 섭취할 수도 있다. 상기 커드상 형태의 락트산 발효물은, 이것을 더욱 균질화함으로써 원하는 음료 형태로 할 수 있다. 이 균질화는 일반적인 유화기(균질화기)를 이용하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, 상기 균질화는 예를 들면 가우린(GAULIN)사 제조의 고압 균질화기(LAB40)를 이용하여 약 200 내지 1000 kgf/cm2, 바람직하게는 약 300 내지 800 kgf/cm2의 조건에서, 또는 산와 기까이 고교사 제조의 균질화기(제품형: HA×4571, H20-A2 등)를 이용하여 150 kg/cm2 또는 그 이상의 조건에서 실시할 수 있다. 이 균질화에 따라 우수한 식감, 특히 부드러움을 갖는 음료를 얻을 수 있다. 또한, 이 균질화시에는 필요에 따라 적당하게 희석하거나, pH 조정을 위한 유기산류를 첨가하거나, 당류, 과즙, 증점제, 계면활성제, 향료 등의 음료의 제조에 통상적으로 사용되는 각종 첨가제를 적절하게 첨가할 수도 있다. 바람직한 첨가제와 그 첨가량(커드상 발효물 중량에 대한 중량％)의 한 구체예로서는, 예를 들면 글루코오스 8 ％(중량％, 이하 동일), 당 8 ％, 덱스트린 8 ％, 시트르산 0.1 ％, 글리세린 지방산 에스테르 0.2 ％ 및 향료 0.1 ％를 들 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 음료는, 적당한 용기에 무균적으로 충전하여 최종 제품화할 수 있다. 이 제품은 부드럽게 목을 넘기는 식감 및 풍미를 갖고 있다.
그 투여(섭취)량은 이것을 섭취하는 생체의 연령, 성별, 체중, 질환 정도 등에 따라 적절하게 결정되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 일반적으로는 유산균량이 약 106 내지 109개/mL가 되는 범위에서 선택되는 것이 바람직하다. 이 제품은 일반적으로 그것의 약 50 내지 1000 mL를 1일 1인 당 섭취, 복용시키면 된다.
식품 형태의 본 발명의 조성물의 다른 구체예로서는 발포 제제 형태를 들 수 있다. 이것은 본 발명의 유산균(균체 동결 건조물) 0.01 내지 50 ％(중량％, 이하 동일)에 탄산나트륨 및(또는) 탄산수소나트륨 10 내지 35 ％와 중화제 20 내지 70 ％를 발포 성분으로서 배합함으로써 제조할 수 있다. 여기서 사용되는 중화제는 상기 탄산나트륨 및 탄산수소나트륨을 중화시켜 탄산 가스를 발생시킬 수 있는 산성 화합물이다. 이 화합물에는, 예를 들면 대표적으로는 L-타르타르산, 시트르산, 푸마르산, 아스코르브산 등의 유기산이 포함된다.
상기 발포 성분의 본 발명의 발포 제제 중으로의 배합 비율은, 얻어지는 본 발명의 제제를 물에 용해시켰을 경우에 용액이 산성, 특히 pH 약 3.5 내지 4.6 정도의 산성을 나타내는 것이 되는 비율로 하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 상기 비율은 탄산나트륨 및(또는) 탄산수소나트륨 10 내지 35 ％ 및 중화제 20 내지 70 ％의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다. 특히 탄산나트륨은 11 내지 31 ％, 바람직하게는 22 내지 26 ％, 탄산수소나트륨은 10 내지 35 ％, 바람직하게는 20 내지 30 ％의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다. 그 중에서도 탄산수소나트륨을 단독으로 20 내지 25 ％의 범위에서 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 중화제는 20 내지 70 ％, 바람직하게는 30 내지 40 ％의 범위에서 선택되며, 특히 L-타르타르산을 20 내지 25 ％ 및 아스코르브산을 8 내지 15 ％의 범위 내에서 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발포 제제는 본 발명의 유산균 및 발포 성분을 필수 성분으로 하며, 그 밖에 통상적으로 알려져 있는 각종 첨가제 성분, 예를 들면 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 증점제, 표면 활성제, 침투압 조절제, 전해질, 감미료, 향료, 색소, pH 조절제 등을 필요에 따라 적절하게 첨가 배합할 수도 있다. 상기 첨가제로서는, 예를 들면 밀 전분, 감자 전분, 옥수수 전분, 덱스트린 등의 전분류; 수크로오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 크실로오스, 락토오스 등의 당류; 소르비톨, 만니톨, 말티톨, 크실리톨 등의 당 알코올류; 커플링 슈거, 팔라티노오스 등의 배당체; 인산칼슘, 황산칼슘 등의 부형제; 전분, 당류, 젤라틴, 아라비아 검, 덱스트린, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 크산탄 검, 펙틴, 트라가간트 검, 카세인, 알긴산 등의 결합제 내지 증점제; 류신, 이소류신, L-발린, 슈거 에스테르, 경화유, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 활석, 마크로골 등의 활택제; 결정 셀룰로오스(아사히 가세이사 제조의 「아비셀」등록 상표), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(CMC-Na), 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘(CMC-Ca) 등의 붕괴제; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(폴리소르베이트), 레시틴 등의 표면 활성제; 아스파탐, 알릴탐 등의 디펩티드; 그 밖에 스테비아, 사카린 등의 감미료 등을 예시할 수 있다. 이들은 필수 성분과의 관계나 제제의 성질, 제조 방법 등을 고려하여 그 적당량을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 발포 제제 중에는 비타민류, 특히 시아노코발라민이나 아스코르브산(비타민 C) 등의 적당량을 첨가 배합할 수 있다. 그 배합 비율은 특별히 한정되지 않지만, 통상 비타민 C에서는 30 ％까지의 양, 바람직하게는 약 5 내지 25 ％의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 발포 제제의 제조 방법은, 기본적으로는 통상의 이 종류의 발포 정제의 제조 방법과 동일하게 할 수 있다. 즉, 발포 정제 형태의 본 발명의 제제는 소정량의 각 성분을 칭량, 혼합하여 직접 분말 압축법, 건식 또는 습식 과립 압축법 등에 따라 제조할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 제제는, 이것을 물 중에 투입하는 것만으로 경구 투여에 적합한 음료 형태가 되며, 이것이 경구 투여된다.
그 투여(섭취)량은 이것을 적용해야 할 생체의 연령, 성별, 체중, 질환 정도 등에 따라 적절하게 결정되며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 1정 약 1.5 내지 6.0 g으로 제조된 본 발명의 발포 정제 1 내지 2정을 1회에 물 100 내지 300 mL에 용해하여 복용시키면 된다.
의약품 형태 조성물
본 발명의 조성물은, 유효 성분으로 하는 본 발명의 유산균과 함께 제제학적으로 허용되는 적당한 제제 담체를 사용하여 일반적인 의약 제제 조성물의 형태로 제조되어 실용화된다. 상기 제제 담체로서는, 통상 이 분야에서 사용되는 것으로 알려져 있는 충전제, 증량제, 결합제, 보습제, 붕괴제, 표면 활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 예시할 수 있다. 이들은 얻어지는 제제의 투여 단위 형태에 따라 적절하게 선택 사용된다.
상기 의약 제제의 투여 단위 형태로서는 각종 형태를 선택할 수 있다. 그 대표적인 것으로서는 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제 등을 들 수 있다.
정제의 형태로 성형할 때에는, 상기 제제 담체로서 예를 들면 락토오스, 수크로오스, 염화나트륨, 글루코오스, 요소, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정 셀룰로오스, 규산, 인산칼륨 등의 부형제; 물, 에탄올, 프로판올, 단시럽, 글루코오스액, 전분액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제; 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 건조 전분, 알긴산 나트륨, 한천 분말, 라미나란 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘 등의 붕괴제; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 라우릴황산나트륨, 스테아르산 모노글리세라이드 등의 계면활성제; 수크로오스, 스테아린, 카카오 버터, 수소 첨가유 등의 붕괴 억제제; 4급 암모늄염기, 라우릴황산나트륨 등의 흡수 촉진제; 글리세린, 전분 등의 보습제; 전분, 락토오스, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드형 규산 등의 흡착제; 정제 활석, 스테아르산염, 붕산 분말, 폴리에틸렌글리콜 등의 활택제 등을 사용할 수 있다.
또한, 정제는 필요에 따라 통상적인 제피를 행한 정제, 예를 들면 당의정, 젤라틴 피복정, 장용피정, 필름 코팅정 또는 이중정, 다층정으로 할 수 있다.
환제의 형태로 성형할 때에는, 제제 담체로서 예를 들면 글루코오스, 락토오스, 전분, 카카오유, 경화 식물유, 카올린, 활석 등의 부형제; 아라비아 고무 분말, 트라가간트 분말, 젤라틴, 에탄올 등의 결합제; 라미나란, 한천 등의 붕괴제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제제 중에는 필요에 따라 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등이나, 그 밖의 의약품을 함유시킬 수도 있다.
본 발명의 제제 중에 함유되어야 하는 본 발명의 유산균의 양은 특별히 한정되지 않으며, 광범위한 범위에서 적절하게 선택된다. 통상, 의약 제제 중에 약 107 내지 1012개/투여 단위 형태 정도로 함유되는 것으로 하는 것이 바람직하다.
상기 의약 제제의 투여 방법은 특별히 제한되지 않으며, 각종 제제 형태, 환자의 연령, 성별, 그 밖의 조건, 질환 정도 등에 따라 결정된다. 예를 들면, 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제 및 캡슐제는 경구 투여된다.
상기 의약 제제의 투여량은 그 용법, 환자의 연령, 성별, 그 밖의 조건, 질환 정도 등에 따라 적절하게 선택되지만, 통상적으로 유효 성분인 본 발명의 유산균의 양이 1일 체중 1 kg당 약 0.5 내지 20 mg 정도로 하는 것이 바람직하며, 상기 제제는 1일에 1 내지 4회로 나누어 인간에게 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 그 섭취(투여)에 의해, 상기 조성물 중의 유산균이 하부 소화관에 상재균으로서 정착할 수 있고, 이와 같이 하여 유산균 본래의 효과, 예를 들면 정장 작용, 장내 세균총 개선 작용 등도 발휘할 수 있다. 특히 바람직한 제제는 장용성 정제 형태이며, 이에 따르면 위산에 의한 침습을 받지 않고 유산균을 장에 도달시킬 수 있다.
본 발명의 유산균 및 이것을 포함하는 조성물은, 그 섭취 내지 투여에 의해 인간의 점막 면역 부활 및 IgA 생산 촉진을 도모할 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 점막 면역 부활이 요구되는 사람에게 본 발명의 유산균을 섭취시켜 상기 사람의 점막 면역을 부활하는 방법; 점막 면역 부활이 요구되는 사람에게 본 발명의 조성물을 섭취시켜 상기 사람의 점막 면역을 부활하는 방법; IgA 생산 촉진이 요구되는 사람에게 본 발명의 유산균을 섭취시켜 상기 사람에 있어서의 IgA 생산을 촉진하는 방법; 및 IgA 생산 촉진이 요구되는 사람에게 본 발명의 조성물을 섭취시켜 상기 사람에 있어서의 IgA 생산을 촉진하는 방법도 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 인간의 점막 면역 부활을 위한 본 발명의 유산균의 용도; 인간의 점막 면역 부활을 위한 본 발명의 조성물의 용도; 인간의 IgA 생산 촉진을 위한 본 발명의 유산균의 용도; 및 인간의 IgA 생산 촉진을 위한 본 발명의 조성물의 용도도 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 유산균의 용도도 제공한다.
<발명의 효과>
본 발명은 우수한 IgA 생산 유도능을 갖고, 인간의 점막 면역, 특히 장관 면역의 부활 작용의 개선 및 생체 방어 작용의 강화에 유효한 새로운 유산균 및 이것을 포함하는 조성물, 특히 식품 또는 의약품 형태의 상기 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명의 유산균의 투여가 파이어판 세포로부터 IgA 생산에 미치는 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 유산균의 투여가 IgG 생산에 미치는 영향을 밝히는 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예 및 시험예를 예시한다.
<실시예 1>
이하, 본 발명의 조성물의 처방예를 실시예로서 나타낸다.
(1) 발효 두유 음료의 제조
하기 처방의 각 성분을 칭량 혼합하여 음료 형태의 본 발명의 조성물을 제조 하였다.
락토바실루스 ONRIC b0239 발효 두유 100 mL
유과 올리고당(55 ％ 함량) 10.0 g
비타민ㆍ미네랄 적량
향료 적량
물 적량
전체량 150 mL
상기 락토바실루스 ONRIC b0239 발효 두유는 두유(단백질 함량 5 g/100 mL 정도) 1 L에 락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064) 108개를 첨가하여 37 ℃에서 48 시간 발효시킨 것이다. 그 균체 함량은 1×109개/mL이다.
(2) 발효유의 제조
하기 처방의 각 성분을 칭량 혼합하여 발효유 형태의 본 발명의 조성물을 제조하였다.
유과 올리고당(55 ％ 함량) 10.0 g
락토바실루스 ONRIC b0240 발효유 100 mL
비타민ㆍ미네랄 적량
향료 적량
물 적량
전체량 150 mL
또한, 락토바실루스 ONRIC b0240 발효유는 우유 1 L에 락토바실루스 ONRIC b0240(FERM BP-10065) 108개를 첨가하여 37 ℃에서 24 시간 발효시킨 것이다. 그 균체 함량은 1×108개/mL이다.
(3) 발효유 동결 건조 분말의 제조
락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064) 약 107개/mL의 1 mL를 사용하여 우유 100 g을 37 ℃에서 24 시간 락트산 발효시킨 후, 얻어진 발효 산물(균체를 포함함)을 동결 건조하여 분말로 하였다.
상기 분말을 사용하여 하기 처방의 각 성분을 칭량 혼합하여 발효유 동결 건조 분말형의 본 발명의 조성물을 제조하였다. 그 균체 함량은 1×109개/g이다.
락토바실루스 ONRIC b0239 발효유 동결 건조 분말 2.2 g
부형제 적량
비타민ㆍ미네랄 적량
향료 적량
전체량 20 g
또한, 부형제로서는 옥수수 전분 17 g을 사용하였다.
(4) 분말의 제조
하기 처방의 각 성분을 칭량 혼합하여 분말 형태의 본 발명의 조성물을 제조하였다.
카세인 4.5 g
유과 올리고당(55 ％ 함량) 10.0 g
락토바실루스 ONRIC b0240 동결 건조 분말 1.0 g
비타민ㆍ미네랄 적량
향료 적량
전체량 20 g
또한, 락토바실루스 ONRIC b0240 동결 건조 분말은 락토바실루스 ONRIC b0240(FERM BP-10065)을 증식 가능한 발효용 원료 물질인 10 ％ 탈지유 수용액 중에서 배양(37 ℃, 24 내지 48 시간)한 후, 동결 건조함으로써 얻어진 것이며, 그 균체 함량은 109 내지 1010개/g이다.
(5) 과립의 제조
하기 처방의 각 성분을 칭량 혼합하여 과립 형태의 본 발명의 조성물을 제조하였다.
유과 올리고당(55 ％ 함량) 10.0 g
락토바실루스 ONRIC b0240 동결 건조 분말 1.0 g
소르비톨 적량
비타민ㆍ미네랄 적량
향료 적량
전체량 20 g
또한, 락토바실루스 ONRIC b0240 동결 건조 분말로서는 실시예 1-(4)와 동일한 것을 사용하였다.
(6) 균 함유 마이크로 캡슐의 제조
락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064)를 실시예 1-(4)와 동일하게 하여 동결 건조하여 얻어진 동결 건조 분말 6×1010개/g을, 융점 34 ℃의 야자 경화유를 융해한 가운데 유과 올리고당과 함께 분산하여 유산균, 유지 및 올리고당의 혼합비가 25 ％, 70 ％ 및 5 ％인 융해물을 제조하였다. 이것을 동심 삼중 노즐의 내측 노즐로부터 평균 유속 0.3 m/s로, 또한 그 외측의 중간 노즐로부터 융점 43 ℃의 야자 경화유와 대두 경화유의 혼합물의 융해액을 평균 유속 0.3 m/s로, 또한 최외측 노즐로부터 피막이 되는 젤라틴/펙틴 용액(85/15 v/v)을 평균 유속 0.3 m/s로 각각 냉각되어 유동하고 있는 오일 중에 동시에 적하시킴으로써 직경 2.5 mm의 3층 구조의 심리스 캡슐 (seamless capsule) (1.4×109개/g 캡슐)을 시험 제작하였다.
이것의 내용물, 내피막 및 상기 피막의 중량비는 35:35:30이었다.
상기 캡슐을 통기 건조한 후, 추가로 진공 건조 또는 진공 동결 건조를 행함으로써 캡슐 중의 수분 활성을 Aw값 0.20 이하 및 열전도율 0.16 kcal/mh℃ 이하로까지 저하시켰다. 또한, Aw값은 전기 저항식 수분 활성 측정 장치(Aw 미터, WA-360, 가부시끼 가이샤 시바우라 덴시 세이사꾸쇼)로 측정된 것이다. 또한, 열전도율은 피치(Fitch)법으로 측정한 것이다.
<실시예 2>
이 예는 본 발명의 유산균의 IgA 생산 유도능을 야스이(Yasui) 등 및 이께나가(Ikenaga) 등에 의해 기재된 방법[문헌 [Yasui,H., et al., Microbial Ecology in Health and Disease, 5, 155(1992); Ikenaga,T., et al., Milk Science, 51, 27(2002)]]에 따라 파이어판 세포 배양계를 이용하여 시험관 내에서 시험한 예이며, 다음과 같이 실시하였다.
(1) 공시 동물
근교계 암컷 마우스 SPF/VAF BALB/c AnNCrj를 사용하였다.
시험 마우스를 입하한 후, 1 주일간 검역하였다. 검역 기간 중에는 MF 고형 사료(오리엔탈 고모사 제조) 및 수도물을 자유 섭취시켰다.
(2) 파이어판 세포 배양법
검역 종료 후, 각 군의 체중이 균등해지도록 80 마리의 마우스를 10 마리씩 군 분류하였다. 군 분류 후, 매일 10 마리의 마우스를 도살하여 소장을 취출하고, 소장 외측 표면에 있는 파이어판을 절단하여 MEM 배지[Eagle's MEM(닛스이사 (NISSUI) 제조), 2 mM 글루타민(기부코사 (GIBCO) 제조), 1 mM 소듐 피루베이트(기부코사 (GIBCO) 제조), MEM 비필수 아미노산(기부코사 (GIBCO) 제조)]를 첨가한 원침관 중에서 빙냉하였다. 메쉬를 이용하여 단일 세포 현탁액을 제조하고, 5 mL의 MEM 배지에서 잘 세정하였다. 세포 현탁액을 여과하고, 4 ℃하, 1,000 회전/분, 10 분간 원심 처리를 행하였다. 원심 후, 배양 상청을 흡인 제거하고, 침전을 5 mL의 MEM 배지에 현탁시켰다. 동일한 조작을 2회 반복한 후, 침전을 10 mL의 5 ％ FBS(기부코사 (GIBCO) 제조) 함유 MEM 배지에 현탁시켜 파이어판 세포의 생세포수 를 계수하고, 세포 부유액을 96웰 세포 배양용 플레이트에 뿌려 세포 배양용 플레이트를 제조하였다.
(3) 공시 균체의 제조
본 발명의 유산균으로서 락토바실루스 ONRIC b239(FERM BP-10064) 및 락토바실루스 ONRIC b240(FERM BP-10065)을 사용하였다. 각 균은 각각 그 배양에 적합한 배지에서 정상기까지 배양한 후, 원심하여 균체를 집균하였다(7,000 g×10 분간, 4 ℃). PBS(-)로 3회 세정한 후, 균체를 5 mL의 생리 식염수에 현탁시켰다. 균수를 파악하기 위해 660 nm에서 탁도를 측정하고, 그 후 오토클레이브에서 100 ℃로 30 분간 가열 멸균 처리하였다. 660 nm에서의 탁도가 1.0일 때의 균수를 2.0×109/mL로 하였다.
(4) 배양 상청 중의 IgA 농도의 측정
상기 (1)에서 제조한 파이어판 세포를 5 ％ FBS 함유 MEM 배지에 현탁시켜 2.5×106 세포/mL로 조절하고, 그 200 μL를 96웰 세포 배양용 플레이트에 넣었다. 이 플레이트의 각 웰에 2.0×109/mL의 공시 균체 현탁액(상기 (3)에서 제조한 것)을 20 ㎕ 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2하에서 7 일간 배양하였다.
상기 균체 20 μL 대신에 50 ㎍/mL의 LPS(Lipopolysaccharide) 20 ㎕를 첨가한 것을 양성 대조군으로 하였다.
이어서, 얻어진 각 배양물 상청의 총 IgA 농도를 시판 키트를 이용한 ELISA 법에 의해 측정하였다.
(5) 본 발명의 유산균의 IgA 생산 촉진 활성
상기 (4)에 따라 측정된 본 발명의 유산균에서의 총 IgA 양을, 대조군으로서의 MEM 배지에 PBS(-) 10 μL를 첨가하여(균체 무첨가) 동일하게 하여 7 일간 배양하여 얻은 배양물 상청의 동 측정치를 기준(1.0)으로서, 그 상대비(Stimulation Index; S.I.)를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1 내지 표 4에는 공지된 각종 유산균 등에 대하여 행한 동일한 시험 결과를 병기하였다. 또한 양성 대조군(LPS 50 ㎍/mL)에서의 시험 결과를 「양성 대조군」으로서 병기하였다. 표 중, Strain No.로 표시되는 미생물 보존 기관의 약칭과 명칭은 각각 이하와 같다.
ATCC: 아메리칸형 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; Manassas, VA, U.S.A.)
JCM: 이화학 연구소 미생물 계통 보존 시설(Japan Collection of Microorganism, The Institute of Physical and Chemical Research, RIKEN)
NRIC: 도꾜 농업 대학 응용 생물 화학부 균주 보존실(NODAI Culture Collection Center, Tokyo University of Agriculture; Setagaya-ku, Tokyo, Japan)
Figure 112006012312997-PCT00001
Figure 112006012312997-PCT00002
Figure 112006012312997-PCT00003
Figure 112006012312997-PCT00004
Figure 112006012312997-PCT00005
Figure 112006012312997-PCT00006
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Figure 112006012312997-PCT00008
표 1 내지 4에 나타낸 바와 같이, 대조(PBS)의 IgA 생산을 1이라고 했을 경우, 양성 대조군의 평균 S.I.는 13.1을 나타내어 IgA 생산을 강하게 유도하고 있다는 것을 알았다. 따라서, 본 배양계는 파이어판 세포로부터의 IgA 생산을 평가하는 데 있어서 유용하다고 판단하였다.
각종 유산균에 의한 IgA 생산 유도능을 살펴보면, 본 발명의 유산균의 S.I.는 ONRIC b0239가 5.61, ONRIC b0240가 6.31이며, 다른 균주의 0.8 내지 1.4에 비하여 돌출되어 높은 IgA 생산 유도능을 갖는다는 것을 알았다.
IgA는 병원 미생물의 점막으로부터의 침입 저지, 바이러스ㆍ독소의 중화, 음식물 알레르겐의 침입 저지 등의 작용을 하고 있으며, 이러한 IgA를 높이는 것이 생체 방어에 있어서 중요하다.
<실시예 3>
이 예는 본 발명의 유산균의 IgA 생산 유도능을 생체 내에서 시험한 것이며, 다음과 같이 실시하였다.
(1) 공시 동물 및 그의 사육
8주령 BALB/c 암컷 마우스 50 마리를 입하한 후, 1 주일간 검역하였다. 검역 기간 중 및 이어지는 시험 기간 중에 실험 동물에게는 MF 고형 사료(오리엔탈 고모사 제조) 및 수도물을 자유 섭취시켰다.
검역 종료 후, 각 실험 동물을 생리 식염수 투여군(15 마리), 본 발명의 유산균(생균) 투여군(15 마리) 및 본 발명의 유산균(사균) 투여군(15 마리)으로 군 분류하였다.
(2) 경구 투여용 본 발명의 유산균의 제조
경구 투여용 본 발명의 유산균(생균) 및 본 발명의 유산균(사균)은 각각 이하의 방법에 의해 제조하였다.
생균:
락토바실루스 플란타럼 b0240(FERM BP-10065, 이하, 단순히「b0240」이라고 함)을 MRS 배지에서 정상기까지 배양한 후, 원심(3,500 회전/분×10 분, 4 ℃)하여 집균하였다. 생리 식염수로 2회 원심 세정한 후, 균체를 생리 식염수에 현탁하여 4×109 CFU/mL로 조정하였다.
사균
상기에서 얻은 생균 현탁액을 오토클레이브(121 ℃, 15 분간 가열) 처리한 후, 세정용 소니케이터(BRANSON 2510)로 45 분간 초음파 처리하였다.
(3) 시험 방법
상기 (2)에서 제조한 본 발명의 각각의 유산균(생균 및 사균)을 시험 개시로부터 7 일간(5 마리), 14 일간(5 마리) 또는 21 일간(5 마리)에 걸쳐 본 발명의 유산균(생균) 투여군(5+5+5=15 마리) 및 본 발명의 유산균(사균) 투여군(5+5+5=15 마리)의 각 군 마우스에 매일 아침 경구 투여(109 CFU/250 μL/마리/일)하였다. 각 투여 기간 종료 후에, 각 군의 마우스를 단두 도살하여 튜브에 채혈하고, 4 ℃하에서 3000 회전/분으로 10 분간 원심 분리하여 혈청을 제조하였다. 또한, 이하의 방법에 의해 파이어판 세포를 제조하였다. 즉, 각 군 마우스를 도살한 후, 소장을 적출하고, 이것을 안과용 가위로 소장 외측 표면으로부터 파이어판을 절단하고, 불완전 배지(incomplete medium; 10 mg 겐타마이신 첨가 RPMI 1640 배지)를 첨가한 24웰 마이크로 플레이트에 넣어 빙냉하였다. 메쉬를 이용하여 단일 세포 현탁액을 제조하고, 5 mL의 불완전 배지에서 잘 세정하였다. 얻어진 세포 부유액을 여과하여 4 ℃하에서 1,000 회전/분으로 10 분간 원심 분리 처리하였다. 원심 분리 처리 후, 배양 상청을 흡인 제거하고, 침전을 5 mL의 불완전 배지에 현탁시켰다. 상기 세정, 여과, 원심 분리, 배양 상청의 흡인 제거 조작을 1회 더 반복한 후, 얻어진 침전을 파이어판 세포로 하였다.
또한, 대조군으로서의 생리 식염수 투여군(15 마리)의 마우스는 본 발명의 유산균(생균 및 사균)을 제공하지 않고 사육하고, 마찬가지로 시험 개시로부터 7 일간(5 마리), 14 일간(5 마리) 및 21 일(5 마리) 후에 혈청 및 파이어판 세포를 제조하였다.
IgA 생산 시험
제조한 각 파이어판 세포(침전)을 0.5 mL의 완전 배지(2 mM L-글루타민, 50 μM 머캅토에탄올, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 10 ％ FBS 첨가 RPMI 1640 배지)에 현탁시켜 세포 농도를 2×106 세포/mL로 조정하여 생세포수를 계수한 후, 세포 부유액을 100 ㎕씩 96웰 세포 배양용 플레이트의 각 웰에 파종하였다.
파이어판 세포가 생산하는 IgA 양은, 파이어판 세포를 그대로 배양하여 생산되는 IgA 양을 조사하는 방법과, 이 배양계에 추가로 파이어판 세포 자극 물질로서 본 발명의 유산균(사균)을 첨가하고 배양하여 생산되는 IgA 양을 조사하는 방법의 두가지 방법에 의해 검토하였다. 후자의 방법은 실제의 생체 내에서의 파이어판 세포의 환경에 가까운 것이라고 상정된다. 즉, 이 시험에서 본 발명의 유산균(생균 또는 사균)을 경구 투여하는 경우에는, 섭취된 유산균은 어떠한 형태로 파이어판 세포에 자극을 제공한다고 예상된다.
파이어판 세포 자극 물질로서의 본 발명의 유산균(사균)은, 하기의 방법에 따라 제조하였다.
파이어판 세포 자극용 본 발명의 유산균(사균)
상기에서 제조한 경구 투여용 본 발명의 유산균(생균)의 현탁액을 인산 완충액으로 균수가 107 CFU/mL(660 nm에서의 탁도가 O.275)가 되도록 더 희석하고, 얻어진 균체 현탁액을 오토클레이브(121 ℃, 15 분간 가열) 처리한 후, 세정용 소니케이터(BRANSON 2510)로 45 분간 초음파 처리하였다.
파이어판 세포 자극 물질을 이용하는 방법은, 파이어판 세포 자극용 본 발명의 유산균(사균) 10 μL를 각 웰에 첨가하고, 또한 FCS를 포함하지 않는 RPMI1640 100 μL를 각 웰에 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2하에서 7 일간 파이어판 세포를 배양하였다. 파이어판 세포 자극 물질을 이용하지 않는 방법에서는, 상기 본 발명의 유산균(사균) 대신에 10 μL의 생리 식염수를 각 웰에 첨가하고, 이하와 같은 조작에 의해 파이어판 세포를 배양하였다.
(4) 측정
세포 배양액으로부터 원심 분리에 의해 배양 상청을 회수하고, 이 배양 상청 중에 분비되는 총 IgA 농도의 측정에 사용하기까지 -80 ℃에서 동결 보존하였다.
상기 배양 상청 중의 총 IgA 농도의 측정 및 혈청 중의 총 lgG 농도의 측정은 모두 시판 중인 키트를 이용한 ELISA법에 의해 측정하였다.
(5) 결과
결과를 도 1(IgA 농도) 및 도 2(lgG 농도)에 나타내었다.
도 1은 배양 상청 중의 IgA 농도(㎍/mL)를 나타내는 막대 그래프이다. 도면 중, 흰색 막대는 대조군으로서의 생리 식염수 투여군(「생리 식염수」라고 표시함)의 결과이다. 사선 막대는 본 발명의 유산균(b0240 생균) 투여군(「b0240 생균」이라고 표시함)의 결과이다. 흑색 막대는 본 발명의 유산균(b0240 사균) 투여군(「b0240 사균」이라고 표시함)의 결과이다. 무자극은 각 군 마우스 유래의 파이어판 세포의 배양계에 본 발명의 유산균(사균)을 첨가하지 않고 배양한 경우를 나타낸다. 균체 자극은 각 군 마우스 유래의 파이어판 세포의 배양계에 본 발명의 유산균(사균)을 첨가하여 상기 균의 자극하에서 배양한 경우를 나타낸다. 각 결과는 각 군 공시 마우스 5 마리에 대하여 얻어진 결과를 평균±표준 편차(Mean±SD)로 표시하였다. 각 결과 상에 표시한 P값은 스튜던트 t-테스트(Student t-test)에서의 대조군에 대한 위험률을 나타낸다.
상기 도면에 나타낸 결과로부터 하기의 사실이 밝혀졌다.
(1) 7 일간 투여의 경우:
균체 자극의 경우, 본 발명의 유산균(사균) 투여군은 생리 식염수 투여의 대조군보다 유의하게 높은 값을 나타내었다(P=0.010).
(2) 14 일간 투여의 경우:
무자극의 경우, 본 발명의 유산균(사균) 투여군(무자극의 흑색 막대 참조)은 대조군(생리 식염수 투여 후 무자극)보다 유의하게 높은 값을 나타내었다(P=0.048).
또한, 균체 자극을 행한 경우에는, 본 발명의 유산균(사균)을 투여한 군 및 본 발명의 유산균(생균)을 투여한 군 모두가 대조군(생리 식염수 투여)에 비하여 유의하게 높은 값을 나타내었다(각각 P=0.034 및 P=0.002). 또한,
(3) 21 일간 투여의 경우:
무자극의 경우, 본 발명의 유산균(사균)을 투여한 군은 대조군보다 유의하게 높은 값을 나타내었다(P=0.047).
또한, 균체 자극을 행한 경우, 본 발명의 유산균(생균) 투여군 및 본 발명의 유산균(사균) 투여군 모두가 대조군보다 유의하게 높은 값을 나타내었다(각각 p=0.015 및 P=0.005).
도 2는 본 발명의 유산균(사균)의 21 일간 투여가 lgG 생산에 미치는 영향을 밝히는 막대 그래프이고, 종축은 혈청 lgG 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
이 도면에 나타낸 결과로부터, 본 발명의 유산균(사균)의 투여는 대조군(생리 식염수 투여)에 비하여 유의하게 높은 혈청 lgG 농도를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(P=0.0064). 또한, 본 발명의 유산균(생균)의 투여도 대조군(생리 식염수 투여)에 비하여 높은 혈청 lgG 농도를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 유산균은 파이어판에 존재하는 면역 담당 세포 또는 장관 상피 세포와 그 주변의 면역 담당 세포를 자극함으로써 점막 면역 응답을 유도하고, 최종적으로 파이어판 세포로부터의 총 IgA 생산을 높이는 것이라고 추정된다. 또한, 본 발명의 유산균의 투여는 IgA 뿐만 아니라, 혈청 중의 lgG도 높다는 것을 알았다. 이들로부터 본 발명의 유산균 섭취는 점막 면역 뿐만 아니라, 전신 면역도 부활하고, 이들 2 단계 구조로 생체의 면역 응답을 부활하여 신체 안팎으로부터 생체를 방어하는 가능성이 시사된다. 이러한 작용이 생균 뿐만 아니라 사균에 있어서도 확인되기 때문에, 본 발명의 유산균은 경구 백신적인 프로바이오틱의 새로운 활용법으로서 기대할 수 있는 것이라고 여겨진다.
<실시예 4>
이 시험은 본 발명의 유산균의 섭취가 인플루엔자 하기도 감염의 방어에 유효하다는 것을 밝히는 것이다.
점막 면역은 점막 상에 병원체가 부착했을 때 최초로 행해지는 감염 방어 기구이다(문헌 [(Brandtzaeg, P. Curr . Top. Microbiol . Immunol, 146:13, 1989)]. 점액 중의 분비형 IgA(S-IgA)는 박테리아, 바이러스 등의 병원체에 대한 방어 작용을 나타냄(문헌 [Czinn,S,J., et al Vaccine 11: 637 1993; Renegar,K., et al J. Immunol. 146: 1972, 1991])과 동시에, 미생물이 생산하는 독소를 중화하는 역할도 담당하고 있다(문헌 [Brandtzaeg, P APMIS 103:1 1995; Kilian,M., et al Microbiol, Rev. 52: 296 1988]). 최근, 감염증에 대한 의약품에 있어서, 점막 면역 기구를 통한 감염 방어 효과를 겨냥한 연구 개발이 활발하게 행해지고 있다. 인플루엔자 감염은 면역계가 미발달한 소아, 면역 기능이 저하된 고령자 등에 있어서 사망례가 높으며, 이제까지의 백신 대신에 보다 유효한 백신의 개발이 요구되고 있다. 구체적으로는 인플루엔자는 매년 유행형이 변하기 때문에, 현행의 경피 투여로 생산되는 특이성이 높은 lgG로부터 바이러스 침입 부위의 점막 면역에서 생산되는 특이성이 완만한 IgA를 통한 점막 백신의 개발이 여러가지로 시도되고 있다. 유산균을 이용한 발효유를 대표로 하는 식품에 대해서도, S-IgA를 통한 감염 방어 작용이 보고되고 있다. 예를 들면, 야스이 등은 유아 설사증의 주요 원인 바이러스인 로타바이러스의 마우스 감염 실험을 실시하고, 어미 마우스에게 B. breve YIT4064주를 섭취시키고, 이어서 어미 마우스의 모유를 새끼 마우스에게 섭취시킨 결과, 새끼 마우스의 설사증이 억제된다는 것을 보고하였다(문헌 [H.Yasui et al J. Infect. Dis . 172: 403. 1995). 또한, 야스이 등은 기도 점막 S-IgA, 혈청 lgG의 액성 면역 및 세포성 면역이 관여하는 인플루엔자 감염에 대한 B. breve YIT4064주의 감염방어 작용이 혈중의 특이적 lgG의 상승에 의한 것이라고도 보고하였다(문헌 [H. Yasui et al Clin . Diagn . Lab. Immunil . 6: 186 1999).
본 발명자들은 유산균의 IgA를 통한 감염 방어 효과를 밝히기 위해, 인플루엔자 바이러스(IFV)를 하기도에까지 도달시키는 하기도 감염 모델 마우스를 이용하여 본 발명의 조성물(본 발명의 유산균을 이용하여 제조한 발효유)의 섭취에 의한 감염 방어 효과를 감염 후의 생존 일수를 지표로서 검토하였다. 본 시험은 이하와 같이 실시하였다.
(1) 공시 동물
닛본 찰스ㆍ리버 가부시끼 가이샤로부터 입하한 근교계 암컷 SPF/VA/VAF 마우스(계통명: BALB/c AnNCrj)(5 주령)를 이하의 조건으로 4 일간 검역한 후, 체중에 의한 군 분류(증류수군, 우유군 및 본 발명의 유산균 함유 발효유군)를 행하였다.
먹이/먹이 공급법: MF 고형 사료(오리엔탈 고모 가부시끼 가이샤)/자유 섭취
물/물 공급법: 수도물/급수병에 의한 자유 섭취
환경: 온도: 23±2 ℃, 습도: 60±10 ％
조명 시간: 명기 7:00 내지 19:00, 암기 19:00 내지 7:00
(2) 시험 방법
각 군 마우스(n=45)에 MF 고형 사료(오리엔탈 고모사 제조)와 함께 피검물((1) 증류수, (2) 우유 또는 (3) 본 발명의 유산균 함유 발효유)을 2 주간 섭취시켰다.
피검물로서의 우유는 LL 우유(오아소 우유: 라꾸노우 마더즈사 제조)를 증류수로 75 ％로 희석하여 사용하였다. 피검물로서의 본 발명의 유산균 함유 발효유는 10 ％ 탈지유 수용액에 현탁하여 -80 ℃에서 동결 보존해 둔 L. plantarum ONRIC b0240를 개시제로서 우유 1 L에 개시제(생균수 108개)를 첨가하고, 33 ℃에서 16 시간 발효시킨 것이다. 본 발명의 유산균 함유 발효유의 균체 함량은 5×107개/mL 이다. 이것을 증류수로 75 ％로 희석하여 시험에 사용하였다.
피검물은 급수병에 의한 자유 섭취로 하고, 섭취량은 섭취 전후의 피검물의 중량 감소량으로 하였다.
섭취 개시 2 주 후에 각 군 실험 동물을 케탈라에 의해 마취한 후, 그 한쪽 비강에 IFV액 50 μL를 경비 접종(10, 102 또는 103 pfu/50 μL PBS/마리, 각각의 농도에서의 n=15)하여 IFV를 마우스에 감염시켰다. 그 후, 각 군 실험 동물의 생사를 매일 관찰하였다. 피검물은 감염 후부터 사망을 확인할 때까지 계속 제공하였다.
사용 IFV주로서는 오츠카 세야꾸 가부시끼 가이샤의 미생물 연구소에 보존되어 있는 IFV: A/PR/8/34/H1N1주를 사용하였다. 상기 주를 0.1 ％ BSA 및 10 mM HEPES를 함유하는 MEM 배지에 현탁시키고, 이어서 PBS(+)를 이용하여 10 내지 103 pfu/50 μL가 되도록 희석하고, IFV의 접종용 바이러스액을 제조하였다. 또한, PBS(+)는 PBS(-) 분말(코진 바이오사 제조) 9.55 g, CaCl2(무수) 100.00 mg 및 MgCl2(무수) 46.90 mg을 증류수에 용해하여 1,000 mL로서 제조하였다.
결과
각 군 마우스의 생존 일수를 IFV 경비 섭취 후, 매일 아침(8:30 내지 9:00) 및 저녁(17:30 내지 18:00)의 2회 확인하였다.
그 결과, 증류수를 섭취시킨 대조군 및 우유를 섭취시킨 대조군에서는, 접종 바이러스량을 102 pfu/마리로 했을 경우, 모두 7 일째까지 모든 예가 사망하였다. 접종 바이러스량을 103 pfu/마리로 했을 경우, 모두 6 일째 저녁까지 모든 예가 사망하였다. 이에 대하여, 본 발명의 유산균 함유 발효유를 섭취시킨 군에서는 대조군에 대하여 실험 동물의 생존 일수를 연장하는 경향이 확인되었다.
또한, 접종 바이러스량을 10 pfu/마리로 했을 경우, 모든 군에 있어서 14 일째에 70 ％ 이상이 생존해 있고, 본 발명의 유산균 함유 발효유를 섭취시킨 군에서는 86.7 ％가 생존해 있어, 대조군의 그것(80 ％)에 대하여 생존율을 연장시키는 경향이 확인되었다.
또한, 각 군 마우스의 체중을 피검물 섭취 개시로부터 감염일까지는 2 일마다, 감염 후에는 매일 아침(8:30 내지 9:00) 전자 천칭을 이용하여 측정하였다. 또한, 측정은 각 측정일에 생존해 있던 마우스에 대하여 행하고, 얻어진 값은 전체 측정치의 평균치로 나타내었다.
그 결과, 모든 군에 있어서, 2 일째에 약간의 체중 감소가 확인되었다. 체중 변화의 추이는 각 군에서 동일하며, 차이는 확인되지 않았다.
고찰
본 시험의 결과 및 상기 실시예 2 및 3에 나타낸 시험 결과로부터 종합적으로 판단하여, 본 발명의 유산균 및 이것을 포함하는 발효유는 IFV 감염에 대하여 감염 방어 효과를 발휘할 수 있다고 여겨진다.
본 발명은 면역 부활 작용 및 IgA 생산 촉진 작용을 갖는 유산균 및 이것을 포함하는 조성물을 제공하는 것이며, 이들은 병원 미생물 등의 점막으로부터의 침입을 저지하는 생체 방어 효과를 발휘할 수 있다.

Claims (15)

  1. 락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064) 및 락토바실루스 ONRIC b0240(FERM BP-10065)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균.
  2. 제1항에 있어서, 락토바실루스 ONRIC b0239(FERM BP-10064)인 유산균.
  3. 제1항에 있어서, 락토바실루스 ONRIC b0240(FERM BP-10065)인 유산균.
  4. 제1항에 기재된 유산균을 함유하는 점막 면역 부활 작용을 갖는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 음식품 형태인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 발효유, 유산균 음료, 발효 야채 음료, 발효 과실 음료 또는 발효 두유 음료인 조성물.
  7. 점막 면역 부활이 요구되는 사람에게 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 유산균을 섭취시키는, 상기 환자의 점막 면역 부활 방법.
  8. 점막 면역 부활이 요구되는 사람에게 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기 재된 조성물을 섭취시키는, 상기 환자의 점막 면역 부활 방법.
  9. IgA 생산 촉진 처치가 요구되는 사람에게 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 유산균을 섭취시키는, 상기 환자의 IgA 생산 촉진 방법.
  10. IgA 생산 촉진 처치가 요구되는 사람에게 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 섭취시키는, 상기 환자의 IgA 생산 촉진 방법.
  11. 인간의 점막 면역 부활을 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 유산균의 용도.
  12. 인간의 점막 면역 부활을 위한 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 용도.
  13. 인간의 IgA 생산 촉진을 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 유산균의 용도.
  14. 인간의 IgA 생산 촉진을 위한 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 용도.
  15. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 유산균의 용도.
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