TWI823060B - 提升口腔免疫球蛋白a含量及抑制口腔病原菌之組成物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種益生菌用於製備提升口腔免疫球蛋白A含量及抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中此益生菌包含植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28做為有效成分，可有效提升口腔IgA含量及/或抑制口腔病原菌，而具有預防齲齒及/或牙周病的潛力。

Description

提升口腔免疫球蛋白A含量及抑制口腔病原菌之組成物及其用途
本發明是有關於一種益生菌用於製備口腔組成物的用途，特別是一種益生菌用於提升口腔IgA含量及抑制口腔病原菌之組成物的用途。
人的口腔中存在上萬種的細菌，這些細菌分解口腔的醣類做為基質並黏附在口腔黏膜、牙齒表面或牙齒周邊組織上，形成頑強的生物膜，進而影響口腔的健康，其中變形鏈球菌(Streptococcus mutans)等好氧菌偏好附著於牙齒表面上，分泌酸性物質並腐蝕牙齒的琺瑯質，造成牙齒的蛀洞。另外，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、具核酸桿菌(Fusobacterium nucleatum)、伴放線聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)等厭氧菌則偏好附著於牙齦溝或牙周囊袋裡，釋放毒素刺激牙周組織，導致牙周發炎 腫脹，造成齒槽骨及組織的破壞，進而引發牙齒鬆動、口臭及刷牙流血等症狀。
做為人體連接外界的通道之一，口腔表面覆有黏膜，以抵禦病原菌，其中免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)在黏膜層免疫系統和體液免疫系統中扮演重要角色。唾液中的IgA可維持口腔微生物的生態平衡、避免病菌(如：呼吸道融合病毒、輪狀病毒、流感病毒及新型冠狀病毒等)侵入呼吸道，並防止口腔病原菌黏附在口腔中。
除了免疫系統之外，益生菌也可協助人體抵禦口腔病原菌。益生菌不僅可和口腔病原菌競爭口腔中的養分與生存空間，也可分泌抑菌成份(如：抗菌肽、短鏈脂肪酸及H2O2)來抑制口腔病原菌之生長，還可改善口腔病原菌感染所導致的發炎現象(如：紅腫、流血及潰爛)。此外，有些益生菌(無論是否有活性)及其代謝產物(益萃質)還可提升唾液中的IgA含量，從而提升口腔免疫力。
有鑑於此，亟須提供一種益生菌用於製備提升口腔免疫球蛋白A含量及抑制口腔病原菌的組成物，以提升口腔免疫力並抑制口腔病原菌。
因此，本發明之一樣態係提供一種益生菌用於製備提升口腔免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)含量之組成物，其中益生菌包含特定的菌株做為有效成分。
本發明之另一樣態係提供一種益生菌用於製備抑 制口腔病原菌之組成物的用途，其中組成物包含上述益生菌株做為有效成分。
本發明之又一樣態係提供一種提升口腔IgA含量及抑制口腔病原菌的組成物，其中組成物包含上述益生菌株做為有效成分，以提升口腔IgA之含量。
根據本發明之上述之態樣，提出一種益生菌用於製備提升IgA含量之組成物的用途，其中益生菌可例如做為有效成分，且益生菌可包含植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28[寄存機構：台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)；寄存編號：BCRC 910536]，以提升口腔該IgA之含量。
在本發明之一實施例中，益生菌可選擇性包含唾液乳酸桿菌(L.salivarius)AP-32(寄存機構：BCRC；寄存編號：BCRC 910437)及/或副乾酪乳酸桿菌(L.paracasei)ET-66(寄存機構：BCRC；寄存編號：BCRC 910753)。
在本發明之一實施例中，組成物可例如為食品組成物或口腔外用組成物。
在本發明之一實施例中，食品組成物可例如為乳製品、非乳製飲品及潔牙食品。
在本發明之一實施例中，口腔外用組成物可例如為口腔護理組成物或口氣清新組成物。
根據本發明之另一態樣，提出一種益生菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中益生菌可例如做為有效成分，且益生菌可包含植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(寄存編號：BCRC 910536)，以抑制口腔病原菌之生長。
在本發明之一實施例中，益生菌可選擇性包含唾液乳酸桿菌AP-32(寄存編號：BCRC 910437)及/或副乾酪乳酸桿菌ET-66(寄存編號：BCRC 910753)。
在本發明之一實施例中，口腔病原菌包含變形鏈球菌(Streptococcus mutans)及/或牙周致病菌。
在本發明之一實施例中，牙周致病菌可包含牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、具核酸桿菌(Fusobacterium nucleatum)及伴放線聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)。
在本發明之一實施例中，組成物可例如為食品組成物或口腔外用組成物。
根據本發明之另一態樣，提出一種提升口腔IgA含量及抑制口腔病原菌之組成物，可包含益生菌做為有效成分，且益生菌可例如由植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(寄存編號：BCRC 910536)、唾液乳酸桿菌AP-32(寄存編號：BCRC 910437)及副乾酪乳酸桿菌ET-66(寄存編號：BCRC 910753)所組成。
應用本發明之組成物，可顯著提升唾液中的IgA含量及/或抑制口腔病原菌之生長，從而維持口腔健康。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1]是顯示根據本發明之一實施例之不同益生菌之單菌株後生元於體外對不同口腔病原菌之抑菌百分比。
[圖2A]至[圖2E]分別是根據本發明之一實施例進行H2O2分泌量之測量實驗之菌株AP-32(圖2A)、ET-66(圖2B)、LPL28(圖2C)、三菌株(圖2D)之H2O2含量及比色卡(圖2E)。
[圖3]是根據本發明之一實施例之三菌株後生元口含錠對口腔病原菌之抑菌百分比的直條圖。
[圖4A]至[圖4D]分別是根據本發明之一實施例之口腔好氧菌(圖4A)、變形鏈球菌(圖4B)、雙歧桿菌(圖4C)及乳桿菌(圖4D)含菌量變化百分比的直條圖。
[圖5]是根據本發明之一實施例之三菌株益生菌口含錠的口腔菌相變化NGS圖。
[圖6]是根據本發明之一實施例之不同口含錠投予不同時間對唾液相對IgA含量百分比的盒狀圖。
[圖7]是根據本發明之一實施例之投予三菌株後生元口含錠在不同時間對唾液IgA變化百分比的點狀圖。
承上所述，本發明提供益生菌用於製備提升口腔免 疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)含量及抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中益生菌可例如做為有效成分。上述益生菌可包含但不限於植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)。在一實施例中，植物乳酸桿菌是於2011年12月27日寄存於台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)(地址：新竹市食品路331號；郵遞區號：30061)的植物乳酸桿菌LPL28，寄存編號為BCRC 910536。此外，植物乳酸桿菌LPL28也於2019年06月18日寄存於中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)(地址：中國北京中國科學院微生物研究所，郵編：100101)，且寄存編號為CGMCC 17954。
此外，上述益生菌可選擇性包含唾液乳酸桿菌(L.salivarius)及/或副乾酪乳酸桿菌(L.paracasei)。在一實施例中，唾液乳酸桿菌是臺灣專利TW I451871中，於2009年07月30日寄存於BCRC且寄存編號為BCRC 910437的唾液乳酸桿菌AP-32。在一實施例中，副乾酪乳酸桿菌是臺灣專利TW I639389中，於2016年11月03日寄存於BCRC且寄存編號為BCRC 910753的副乾酪乳酸桿菌ET-66。在一實施例中，益生菌是由植物乳酸桿菌LPL28、唾液乳酸桿菌AP-32及副乾酪乳酸桿菌ET-66等菌株所組成。
補充說明的是，上述唾液乳酸桿菌AP-32也於2011年4月10日寄存中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)(地址：中國武漢大學保藏中心，郵編：430072)，且寄存編號為CCTCC M 2011127。上述副乾酪乳酸桿菌ET-66也於2016年12月29日寄存於CGMCC，寄存編號為CGMCC 13514。
將上述益生菌以醱酵培養基進行醱酵步驟，可獲得醱酵物，其中醱酵培養基的種類不限，可例如為市售細菌培養基，且醱酵物中包含活性菌體。醱酵步驟可例如為利用一種益生菌株進行之單菌株醱酵步驟，以獲得單菌株醱酵物。在一實施例中，醱酵步驟可例如同時利用對多種益生菌株進行多菌株醱酵步驟，以獲得多菌株醱酵物，其中上述益生菌可例如選自於由植物乳酸桿菌LPL28、唾液乳酸桿菌AP-32、副乾酪乳酸桿菌ET-66及上述任意組合所組成之一族群。在一實施例中，醱酵步驟可例如同時利用對植物乳酸桿菌LPL28、唾液乳酸桿菌AP-32及副乾酪乳酸桿菌ET-66進行之三菌株醱酵步驟，以獲得三菌株醱酵物。
接著，對醱酵物(如：單菌株醱酵物或多菌株醱酵物)進行後處理，以獲得後生元(postbiotics)(如：單菌株後生元或三菌株後生元)，其中後生元包含益生菌的菌體及其分解培養基後產生的代謝物。前述後處理的方法不限，可包含熱滅殺步驟及/或固液分離步驟。前述的熱滅殺步驟 可抑制菌體活性，從而形成去活性菌體，而固液分離步驟可去除活性菌體及/或去活性菌體。在一實施例中，所述有效成分可例如選自於由益生菌之活性菌體、去活性菌體、後生元及上述任意組合所組成的族群。在一實施例中，熱滅殺步驟可例如濕熱滅菌法(如：高溫高壓蒸氣滅菌法、微波加熱、隔水加熱步驟)及/或乾熱滅菌法。在一實施例中，固液分離步驟可例如利用離心步驟及/或過濾步驟進行。
上述益生菌具有提升IgA含量及抑制口腔病原菌的功效，其中IgA存在於口腔黏膜及唾液中，且IgA與口腔健康相關，因此唾液中IgA含量提升可減少由口腔病原菌引發的病癥，所述抑制口腔病原菌可例如為抑制口腔病原菌之生長。
所述「口腔病原菌」是指可影響口腔健康的微生物，其中口腔病原菌可包含但不限於致齲菌及/或牙周致病菌。上述致齲菌可包含變形鏈球菌(Streptococcus mutans)，且上述牙周致病菌可包含牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、具核酸桿菌(Fusobacterium nucleatum)及伴放線聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)。此外，牙齦卟啉單胞菌、具核酸桿菌及伴放線聚集桿菌皆會產生硫化物，從而引起口臭。除了影響口腔健康，口腔病原菌尚與口腔以外的其他疾病相關，如：具核酸桿菌與結腸癌有關，伴放線聚集桿菌與大腸癌密切相關，且牙齦卟啉單胞菌與伴放線聚集桿菌的含量罹患胰腺癌的機率正相關。 因此，抑制口腔病原菌之生長不僅可維持口腔健康，還可降低上述疾病之發生率。
在應用上述組成物時，其投予途徑無特別限制，可例如經口投予或經口腔吸收，端視實際需求與劑型調整。上述組成物之有效劑量亦可視需求彈性調整。在一實施例中，益生菌的有效劑量可例如為大於106CFU/g，然以107CFU/g至1011CFU/g為較佳。
在一實施例中，上述組成物可選擇性包含食品或醫學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體等。在一實施例中，組成物可例如為食品組成物或口腔外用組成物，其中食品組成物可例如為乳製品(如：優格、乳酪或醱酵乳製飲品乳粉)、非乳製飲品(如：茶飲、咖啡、健康飲品)或潔牙食品(如：口香糖、口含錠、軟糖及寵物用肉乾)，且口腔外用組成物可例如為口腔護理組成物(如：牙膏、牙線、漱口水、潔牙粉、假牙清潔劑或口內膏)、口氣清新組成物(如：口氣清新劑)或其他組成物(如：牙齒美白劑)。
經體外實驗證實，上述植物乳酸桿菌LPL28搭配其他菌種(例如唾液乳酸桿菌AP-32及副乾酪乳酸桿菌ET-66)可有效提升口腔中IgA含量及抑制口腔病原菌，表示上述益生菌具有減少齲齒及/或牙周病的潛能，從而維持口腔健康。
需補充的是，在體外實驗中，相較於進行單菌株醱酵物，三菌株醱酵物可分泌較多H2O2。其次，相較於單菌株後生元之個別，三菌株後生元可提升口腔中IgA含量， 顯示相較於植物乳酸桿菌LPL28的單菌株醱酵物及/或後生元，而植物乳酸桿菌LPL28與唾液乳酸桿菌AP-32及副乾酪乳酸桿菌ET-66的三菌株醱酵物及/或後生元維持口腔健康的效果較佳。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例一、植物乳酸桿菌LPL28的分離、保存及微生物學性質
植物乳酸桿菌LPL28(以下稱LPL28)是分離自味噌的菌株。分離後，以含有20%之甘油的MRS培養液(廠牌：美商必帝股份有限公司，DIFCO)將菌株LPL28保存於-80℃。使用前，於37℃下將菌株LPL28接種到含有0.05%半胱氨酸之MRS培養液中培養24小時，並以相同的方法再繼代一次，以確保菌株LPL28具有較佳活性。
將菌株LPL28活化後，塗佈在MRS瓊脂培養基上，並於37℃下進行培養至長出菌落(約48小時)。觀察活化後菌株LPL28的形態特徵，並將結果列於表1。
Figure 110107064-A0305-02-0012-1
接著，利用微生物鑑定套組API 50 CHL (bioMerieux，法國)分析鑑定菌株LPL28的菌種，並將結果列於表2，其中「+」表示陽性，「-」表示陰性，且「？」表示反應較微弱。根據表2之結果，菌株LPL28的生物化學性質與植物乳酸桿菌相似，因此判斷菌株LPL28為植物乳酸桿菌。
Figure 110107064-A0305-02-0013-2
接下來，進行RNA純化及反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-PCR，RT-PCR)，以獲得菌株LPL28的16S rDNA，再利用序列分別如序列編號序列辨識編號(SEQ ID NOs.)：1及2所示之引子1及引子2進行PCR，以獲得序列如SEQ ID NO：3所示145 bp的片段。利用基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)進行比對，菌株LPL28確實為植物乳酸桿菌。將所分離的菌株寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源 中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910536。
實施例二、評估植物乳酸桿菌LPL28體外抑制口腔病原菌的功效
利用雙層瓊脂法來評估益生菌抑制口腔病原菌的功效，其中使用的益生菌株是列於表3，且做為示例的口腔病原菌株是列於表4。值得注意的是，菌株LGG是抑制變形鏈球菌的市售益生菌，在此做為正對照菌株。
Figure 110107064-A0305-02-0014-3
Figure 110107064-A0305-02-0014-4
首先，利用MRS培養液來培養表3所示的益生菌株，再利用大豆分解蛋白質乾酪素培養液(tryptic soy broth，TSB)來培養變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌及具核酸桿菌多形亞種，並利用腦心浸出培養液(brain heart infusion broth，BHI)來培養伴放線聚集桿菌，以分別獲得益生菌液及病菌液。調整益生菌液及病菌液的含菌量，使含菌量分別為1x109cfu/g及1x107cfu/g至1x109cfu/g。
將益生菌液以畫線的方式塗佈在第一瓊脂培養基上，藉以在37℃下厭氧環境中培養約48小時後，形成約2公分的益生菌帶。上述第一瓊脂培養基是由MRS培養液配製而成。
接著，分別將45℃的第二層培養瓊脂添加在第一瓊脂培養基上。待第二層培養瓊脂冷卻凝固後，將口腔病原菌株的病菌液分別塗佈在第二層培養瓊脂，並在37℃下培養48小時，其中變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌及具核酸桿菌多形亞種之第二層培養瓊脂是由TSB培養液配製而成，且伴放線聚集桿菌之第二層培養瓊脂是由BHI培養液配製而成。如果益生菌具有抑菌能力，則在第二層培養瓊脂上，會在益生菌帶的兩側形成抑菌帶。利用抑菌帶的寬度來可量化抑菌能力，其中當抑菌帶為0公分至1公分、1公分至2公分、2公分至3公分及大於3公分時，分別定義抑菌分數為0分、1分、2分及3分。
益生菌株對不同口腔病原菌株的抑菌分數及各抑菌分數之平均是列於表5。如表5所示，菌株LPL28的抑菌分數較高，且高於正對照菌株LGG，顯示菌株LPL28 的活性菌體具有良好的抑菌能力。
Figure 110107064-A0305-02-0016-5
實施例三、評估植物乳酸桿菌LPL28之後生元的體外抑制口腔病原菌的功效
對益生菌株LPL28、唾液乳酸桿菌AP-32及副乾酪乳酸桿菌ET-66進行單菌株醱酵步驟，以獲得單菌株醱酵物，其中單菌株醱酵步驟是在37℃下以MRS培養液進行達48小時。唾液乳酸桿菌AP-32(寄存編號：BCRC 910437)(以下稱AP-32)、副乾酪乳酸桿菌ET-66(寄存編號：BCRC 910753)(以下稱ET-66)說明於專利號TW I639389B的菌株，在此不再贅述。
接著，對單菌株醱酵物進行後處理，以獲得單菌株 後生元，其中後處理包含熱滅殺步驟及離心步驟。所述熱滅殺步驟是在100℃下隔水加熱，使單菌株醱酵物中的菌體失去活性，且離心步驟是以4000rpm離心10分鐘，其中所分離之上清液包含單菌株後生元。
將100μl之單菌株後生元加入至4.8ml TSB培養液或BHI培養液，再分別加入100μl之病菌液106CFU/mL(變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌及具核酸桿菌多形亞種加到TSB培養液中，且伴放線聚集桿菌加到BHI培養液中)，以於37℃下進行培養(變形鏈球菌培養20小時，牙齦卟啉單胞菌、具核酸桿菌多形亞種及伴放線聚集桿菌培養4天)，從而獲得後生元培養物。另外配製對照培養物，其配製方法與前述後生元培養物相同，但不加入後生元。
分別將後生元培養物及對照培養物序列稀釋並塗佈於TSB瓊脂培養基(變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌及具核酸桿菌多形亞種)或BHI瓊脂培養基上(伴放線聚集桿菌)，並於37℃下培養達48小時，再計數菌落數，從而計算抑菌百分比，其中抑菌百分比是100%減去存活百分比，且存活百分比是後生元培養物之菌數除以對照培養物之菌數的百分比。因此，對照培養物的抑菌百分比是0%。
圖1是顯示根據本發明之一實施例之不同益生菌之單菌株後生元於體外對不同口腔病原菌之抑菌百分比，其中橫軸表示益生菌株之後生元，縱軸表示抑菌百分比，且圖號「*」、「**」及「***」分別表示以t-test統計後，後生元培養物與對照培養物之抑菌百分比相比具有統 計上的顯著差異(p<0.05、p<0.01及p<0.001)。
如圖1所示，相較於無添加後生元之對照培養物，菌株LPL28、AP-32及ET-66的單菌株後生元對口腔病原菌的抑菌百分比較高，顯示菌株LPL28、AP-32及ET-66的單菌株後生元具有較佳的抑菌能力。
實施例四、測量不同益生菌株的H2O2分泌量
H2O2可以抑制細菌之生長，還可以美白牙齒，因此進行H2O2分泌量之測量實驗，可評估益生菌株的抑菌能力。首先，以MRS培養液分別對菌株AP-32、ET-66及LPL28進行上述單菌株醱酵步驟，從而獲得單菌株醱酵物。另一方面，以MRS培養液同時對菌株AP-32、ET-66及LPL28之混合進行三菌株醱酵步驟，從而獲得三菌株醱酵物，其中三菌株醱酵步驟的條件與單菌株醱酵步驟相同，只是接種的菌株數量不同。上述單菌株醱酵物及三菌株醱酵物的總含菌量相同(約為109CFU/mL)，其中三菌株醱酵物中，菌株AP-32、ET-66及LPL28之菌量比例為1：1：1。以4500rpm分別離心0.1mL的單菌株醱酵物及三菌株醱酵物達5分鐘，以獲得菌體，再利用4.9mL之哌嗪-1,4-二乙磺酸[piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES]緩衝液(100mM)回溶菌體，並於37℃下以220rpm之轉速進行反應達5小時，以獲得PIPES培養物。接著，以4500rpm進行離心，再取10μL的上清液至H2O2試紙(製造商：Merck) 上反應，10秒後觀察試紙的顏色變化。對照試紙與比色卡的顏色，可獲得H2O2濃度。將結果記錄於圖2A至圖2E。
圖2A至圖2E是根據本發明之一實施例進行H2O2分泌量之測量實驗之菌株AP-32(圖2A)、ET-66(圖2B)、LPL28(圖2C)、三菌株(圖2D)之H2O2含量及比色卡(圖2E)。如圖2A至圖2D所示，菌株AP-32、ET-66及LPL28的單菌株醱酵物之PIPES培養物中分別含有5mg/L、0mg/L及2mg/L之H2O2，而三菌株醱酵物之PIPES培養物的H2O2含量為10mg/L，大於單菌株醱酵物的PIPES培養物中H2O2含量之和，顯示相較於分別對菌株AP-32、ET-66及LPL28之進行單菌株醱酵步驟後獲得的單菌株醱酵物，同時對菌株AP-32、ET-66及LPL28之進行三菌株醱酵步驟後獲得的三菌株醱酵物之H2O2含量較高。
實施例五、評估三菌株後生元口含錠體外抑制口腔病原菌的功效
製備安慰劑口含錠及三菌株後生元口含錠。上述安慰劑口含錠的成分包含甜味劑(如：D-山梨醇、赤藻糖醇及蔗糖素)、果寡糖、乳糖、香料、硬脂酸鎂及二氧化矽等食品添加物，其中食品添加物的含量可在符合法規的前提下視情況進行調整。上述食品添加物皆屬習知成分，可視實際需求任意調整，且此調整不影響抑菌功效的評估，故在此不另贅述。此外，三菌株後生元口含錠的成分包含安慰 劑口含錠所含的食品添加物及三菌株後生元。三菌株後生元是對菌株AP-32、ET-66及LPL28進行上述三菌株醱酵步驟及上述後處理後獲得，其中三菌株醱酵物的含菌量為1x109CFU/mL，且三菌株後生元於口含錠的含量為50mg/g。
分別將100μL之病菌液加入4.8mL的TSB培養液(變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌及具核酸桿菌多形亞種)及BHI培養液(伴放線聚集桿菌)中，再分別加入一錠安慰劑口含錠或三菌株後生元口含錠後，於37℃下進行培養(變形鏈球菌培養20小時，牙齦卟啉單胞菌、具核酸桿菌多形亞種及伴放線聚集桿菌培養4天)，以獲得安慰劑口含錠及三菌株後生元口含錠之口含錠培養物。另外配製對照培養物，其配製方法與前述口含錠培養物相同，但不加入口含錠。然後，如實施例三之方法計算抑菌百分比，並將結果記錄於圖3。
圖3是根據本發明之一實施例之三菌株後生元口含錠對口腔病原菌之抑菌百分比的直條圖，其中橫軸表示組別，縱軸表示抑菌百分比，且圖號「*」及「**」分別表示以student’s t test統計分析後，相比安慰劑口含錠具有顯著上的統計差異(p<0.05、p<0.01)。如圖3所示，相較於安慰劑口含錠，三菌株後生元口含錠對口腔病原菌株的抑菌百分較高，顯示三菌株後生元可有效抑制口腔病原菌。
實施例六、評估三株益生菌口含錠於口腔中抑制口腔病原菌之功效及改善口腔及/或腸胃健康的功效
利用實施例四的單菌株醱酵物及三菌株醱酵物分別離心後的菌體配製AP-32、ET-66、LPL28及三菌株益生菌口含錠，其中益生菌口含錠包含對應的菌體及安慰劑口含錠的添加劑，且益生菌口含錠的總含菌量為50mg/g。
分別投予受試者上述安慰劑口含錠及益生菌口含錠達4周，其中投予方式為在早、中及晚各含(未咬碎)一顆口含錠。上述受試者為無全身性疾病、不抽菸，且唾液中含有約105的變形鏈球菌的20歲至40歲的健康成人。需特別說明的是，每顆口含錠重約10g，不予咬碎，可停留口腔中約10分鐘，但視受試者的口水含量及體溫等因素而有個體差異。
分別在未投予口含錠、投予口含錠2周及4周後，利用棉花棒刮取受試者牙齒內外側，以蒐集口腔組織樣本。接著，將口腔組織樣本均勻接種到5mL含有50%甘油之TSB培養基中，以獲得口腔菌樣本。然後，依據檢測的目標，分別利用對應的培養條件於37℃下培養口腔菌樣本達2天，再計算菌落數。詳細而言，對應的培養條件是指特定的培養基及氧氣環境。口腔菌樣本的口腔好氧菌對應的培養條件是平板計數瓊脂培養基及好氧環境。變形鏈球菌對應的培養條件是輕型唾液鏈球菌瓊脂(mitis salivarius agar，MSBA)培養基及兼性厭氧環境。雙 歧桿菌及乳桿菌對應的培養條件是半胱胺酸MRS瓊脂(cysteine MRS agar)培養基、厭氧環境或兼性厭氧環境。上述各菌株的含菌量如圖4A至圖4D所示。
圖4A至圖4D分別是根據本發明之一實施例之口腔好氧菌(圖4A)、變形鏈球菌(圖4B)、雙歧桿菌(圖4C)及乳桿菌(圖4D)含菌量變化百分比的直條圖，其中橫軸表示口含錠的種類及投予條件，縱軸表示以未投予口含錠的口腔含菌量為100%的含菌量變化百分比，圖號「*」、「**」及「***」表示經student’s t-test統計分析，與投予安慰劑口含錠具有統計上的顯著差異(p<0.05、p<0.01、p<0.001)(n=25)，且圖號「#」、「##」及「###」表示經student’s t-test統計分析，與未投予三菌株益生菌口含錠相比具有統計上的顯著差異(p<0.05、p<0.001)(n=25)。
如圖4A所示，相較於投予安慰劑口含錠及未投予口含錠，投予益生菌口含錠後，口腔好氧菌含菌量變化百分比顯著下降，且投予ET-66、LPL28及三菌株益生菌口含錠2周後就有顯著效果，其中三菌株益生菌口含錠的效果較AP-32、ET-66及LPL28益生菌口含錠的效果更佳。
如圖4B所示，相較於投予安慰劑口含錠4周及未投予口含錠，投予益生菌口含錠4周後的變形鏈球菌含菌量變化百分比顯著下降，其中三菌株益生菌口含錠在投予2周後就有顯著效果，且三菌株益生菌口含錠的效果較 AP-32、ET-66及LPL28益生菌口含錠的效果更佳。
如圖4C所示，相較於投予安慰劑口含錠4周及未投予口含錠，投予益生菌口含錠4周後的雙歧桿菌含菌量變化百分比顯著提升，其中投予三菌株益生菌口含錠在2周後就有顯著效果，且三菌株益生菌口含錠的效果較AP-32、ET-66及LPL28益生菌口含錠的效果更佳。
如圖4D所示，相較於投予安慰劑口含錠及未投予口含錠，投予益生菌口含錠後，乳桿菌含菌量變化百分比顯著上升，其中投予LPL28及三菌株益生菌口含錠2周後就有顯著效果，且三菌株益生菌口含錠的效果較AP-32、ET-66及LPL28益生菌口含錠的效果更佳。由上述可知，投予益生菌口含錠，可有效降低口腔病原菌(變形鏈球菌)，並提升口腔益菌(如：雙歧桿菌及乳桿菌)，且相較於單菌株益生菌口含錠(即AP-32、ET-66及LPL28益生菌口含錠)，三菌株口含錠的效果較佳。
此外，分別在未投予口含錠、投予口含錠2周及4周後，蒐集受試者的唾液樣本，並萃取唾液樣本中的DNA樣本，再檢送DNA樣本至圖爾思公司進行次世代定序(next generation sequencing，NGS)。NGS的操作方法如下：首先，使用市售引子(如：SEQ ID NOs：4及5所示)及市售PCR套組(Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix；廠商：New England Biolabs，美國)擴增出16S rRNA之V3及V4區段的核酸片段並進行電泳，再以萃取套組[Qiagen Gel Extraction kit； 廠商：德國凱杰公司(Qiagen)](約400bp至450bp)分離核酸片段。
接著，利用全基因組定序樣品製備試劑套組(TruSeq® DNA PCR-free sample preparation kit；廠商：美國Illumina)製備定序樣本，並建立DNA基因文庫(genomic DNA library)。接下來，利用螢光偵測儀器(Qubit® 2.0 Fluorometer；廠商：美國賽默飛世爾科技)和定序分析系統[Agilent Bioanalyzer 2100 system；廠商：美國安捷倫科技(Agilent Technologies,Inc.)]分析DNA基因文庫。最後，在Illumina HiSeq 2500平台上對DNA進行序列分析。將NGS的結果記錄於圖5。
圖5是根據本發明之一實施例之三菌株益生菌口含錠的口腔菌相變化NGS圖(heat map)，其中橫軸代表投予的口含錠種類及實驗時間，縱軸表示菌的分類(可為屬、種或亞種)，且圖號「*」及「***」分別表示經student’s t-test統計分析，與投予安慰劑口含錠的含菌量具有統計上的顯著差異(p<0.05、p<0.001)(n=25)。由圖5可知，投予三菌株益生菌口含錠4周後，可有效增加口腔益生菌(如：唾液乳酸桿菌、乳桿菌數及齒雙歧桿菌)的含量。
另外，以問卷的方式，調查受試者口腔及腸道生理狀態的改變，並將結果分別列於表6及表7，其中數字0、1、2及3分別表示無症狀、輕度症狀、中度症狀及重度症狀(在表7中，超過3天排便為數字2、1至3天排便3天 為數字為1，1天排便超過1次為數字0)，字母「a」及「b」分別表示以student’s t test統計分析後，相比投予安慰劑口含錠的受試者具有顯著上的統計差異。如表6所示，投予三菌株益生菌口含錠的受試者之口瘡(或稱口破、嘴吧破裂)、膿包及流口水等的症狀顯著下降，且如表7所示，便祕、胃食道逆流、感冒及睡意等的症狀皆獲得明顯改善，顯示三菌株益生菌口含錠不僅可改善口腔的不適症狀，還對口腔以外的生理狀態有正面的影響。
Figure 110107064-A0305-02-0025-6
Figure 110107064-A0305-02-0025-7
實施例七、評估單菌株及三菌株之益生菌口含錠提升口腔IgA濃度的能力
利用實施例四的菌株AP-32、ET-66及LPL28之單菌株醱酵物分別製備AP-32口含錠、ET-6口含錠6及LPL28口含錠，其中口含錠的含菌量分別為50mg/g。分別投予受試者上述安慰劑口含錠、AP-32口含錠、ET-66口含錠、LPL28口含錠及三菌株益生菌口含錠，並於未投予、投予2周及投予4周蒐集受試者唾液，再利用酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測量IgA含量，並將結果記錄於圖6。ELISA的方法為所屬領域具有通常知識者所熟知，在此不再贅述。
圖6是根據本發明之一實施例之不同口含錠投予不同時間對唾液相對IgA含量百分比的盒狀圖，其中橫軸表示口含錠種類及時間，縱軸表示以未投予口含錠之唾液IgA含量為100%的相對IgA含量百分比，圖號「*」、「**」及「***」表示以student’s t test統計分析後，與投予安慰劑口含錠具有統計上的顯著差異(p<0.5、p<0.01、p<0.001)(n=25)，且圖號「##」及「###」表示以student’s t test統計分析後，與未投予口含錠相比具有統計上的顯著差異(p<0.01、p<0.001)(n=25)。
如圖6所示，相較於投予安慰劑口含錠，投予AP-32口含錠、ET-66口含錠、LPL28口含錠及三菌株益生菌口含錠的受試者之唾液相對IgA含量百分比皆在投予2周及4周後顯著增加，顯示菌株AP-32、ET-66及 LPL28具有提升唾液IgA含量的功效。然而，相較於投予AP-32口含錠、ET-66口含錠、LPL28口含錠，投予三菌株益生菌口含錠的受試者的唾液相對IgA含量百分比較高，顯示相較於單菌，菌株AP-32、ET-66及LPL28的三菌株醱酵物提升唾液IgA含量的效果較佳。
實施例八、評估三菌株後生元口含錠提升口腔IgA濃度的能力
將實施例五的三菌株後生元口含錠投予受試者達4周，其中投予方式及受試者的條件同實施例六。分別於未投予、投予2周及投予4周後，蒐集受試者的唾液，並利用上述ELISA測量唾液中IgA含量。
圖7是根據本發明之一實施例之投予三菌株後生元口含錠在不同時間對唾液IgA變化百分比的點狀圖，其中橫軸表示時間及組別，縱軸表示以投予前的唾液IgA含量為100%的IgA含量百分比，圖號「**」及「***」表示經student’s t-test統計分析，與投予安慰劑口含錠具有統計上的顯著差異(p<0.01、p<0.001)(n=25)，且圖號「###」表示經student’s t-test統計分析，與未投予三菌株後生元口含錠相比具有統計上的顯著差異(p<0.001)(n=25)。如圖7所示，相較於投予安慰劑口含錠，投予三菌株後生元的受試者之唾液IgA含量在投予2周及4周後顯著上升，顯示菌株AP-32、菌株ET-66及菌株LPL28之三菌株後生元可有效提升唾液IgA含 量。
由上述結果顯示，本發明之植物乳酸桿菌LPL28可確實提升口腔IgA含量並抑制口腔病原菌，意味著應用本發明之植物乳酸桿菌LPL28可降低齲齒及/或牙周病的發生率，而有預防齲齒及/或牙周病的潛能。
綜言之，本發明雖以特定菌株、特定的劑型、特定的對象、特定的投予方式、或特定的評估方式作為例示，說明本發明之植物乳酸桿菌LPL28提升口腔IgA含量並抑制口腔病原菌之用途，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明亦可使用其他菌株、其他的劑型、其他的對象、其他的投予方式或其他的評估方式進行。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
植物乳酸桿菌LPL28(Lactobacillus plantarum) 係於2011年12月27日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910536。
<110> 豐華生物科技股份有限公司
<120> 提升口腔免疫球蛋白A含量及抑制口腔病原菌之組成物及其用途
<140> TW 110107064
<141> 2021-02-26
<160> 5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16S rRNA基因上游引子
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16S rRNA基因下游引子
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<210> 3
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<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum LPL28 16S rRNA基因片段
<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 次世代定序之上游引子
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
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<223> 次世代定序之下游引子
<400> 5
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Claims (11)

  1. 一種益生菌用於製備提升口腔免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)含量之組成物的用途，其中該組成物包含該益生菌的一醱酵物或一後生元做為一有效成分，且該益生菌包含植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28[寄存機構：台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)；寄存編號：BCRC 910536]，以提升口腔該IgA含量。
  2. 如請求項1所述之益生菌用於製備提升口腔IgA含量之組成物的用途，其中該益生菌更包含唾液乳酸桿菌(L.salivarius)AP-32(寄存機構：BCRC；寄存編號：BCRC 910437)及/或副乾酪乳酸桿菌(L.paracasei)ET-66(寄存機構：BCRC；寄存編號：BCRC 910753)。
  3. 如請求項1所述之益生菌用於製備提升口腔IgA含量之組成物的用途，其中該組成物是一食品組成物或一口腔外用組成物。
  4. 如請求項3所述之益生菌用於製備提升口腔IgA含量之組成物的用途，其中該食品組成物是乳製品、非乳製飲品及潔牙食品。
  5. 如請求項3所述之益生菌用於製備提升口腔IgA含量之組成物的用途，其中該口腔外用組成物是口腔護理組成物或口氣清新組成物。
  6. 一種益生菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中該組成物是以該益生菌的一活性菌體或一後生元做為一有效成分，該益生菌包含植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(寄存編號：BCRC 910536)，藉以抑制該口腔病原菌之生長，且該口腔病原菌包含牙周致病菌。
  7. 如請求項6所述之益生菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中該益生菌更包含唾液乳酸桿菌AP-32(寄存編號：BCRC 910437)及/或副乾酪乳酸桿菌ET-66(寄存編號：BCRC 910753)。
  8. 如請求項6所述之益生菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中該口腔病原菌更包含變形鏈球菌(Streptococcus mutans)。
  9. 如請求項6所述之益生菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中該牙周致病菌包含牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、具核酸桿菌(Fusobacterium nucleatum)及伴放線聚集桿菌 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)。
  10. 如請求項6所述之益生菌用於製備抑制口腔病原菌之組成物的用途，其中該組成物是一食品組成物或一口腔外用組成物。
  11. 一種提升口腔IgA含量及抑制口腔病原菌之組成物，包含益生菌的一醱酵物或一後生元做為一有效成分，其中該益生菌是由植物乳酸桿菌LPL28(寄存編號：BCRC 910536)、唾液乳酸桿菌AP-32(BCRC 910437)及副乾酪乳酸桿菌ET-66(寄存編號：BCRC 910753)所組成，且該醱酵物包含該益生菌的一活性菌體。
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