TW202115243A

TW202115243A - 植物乳桿菌菌株、含其之組成物、其製造方法及其用於製備抑制或減少口腔病原菌之組成物的用途

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Publication number: TW202115243A
Application number: TW108135751A
Authority: TW
Inventors: 陳勁初; 陳炎鍊; 林詩偉; 王啟憲; 侯毓欣; 石仰慈; 林靜雯; 陳雅君; 江佳琳; 蔡侑珊; 陳彥博
Original assignee: 葡萄王生技股份有限公司
Priority date: 2019-10-02
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2021-04-16
Also published as: TWI733207B

Abstract

本發明提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株、含其之組成物、其製造方法及其用於抑制或減少口腔病原菌的用途。前述菌株係植物乳桿菌GKD7，可抑制或減少致齲菌變形鏈球菌(Streptococcus mutans)及/或牙周致病菌普雷沃菌(Prevotella spp.)，進而預防齲齒及/或牙周病。

Description

植物乳桿菌菌株、含其之組成物、其製造方法及其用於製備抑制或減少口腔病原菌之組成物的用途

本發明是有關於一種植物乳桿菌菌株及其應用，尤其是一種植物乳桿菌GKD7用於製備抑制或減少口腔病原菌的組成物之用途。

人的口腔中存在上萬種的細菌，這些細菌分解口腔的醣類做為基質並黏附在口腔黏膜、牙齒表面或牙齒周邊組織上，形成頑強的生物膜，進而影響口腔的健康，其中變形鏈球菌(Streptococcus mutans)等好氧菌偏好附著於牙齒表面上，分泌酸性物質並腐蝕牙齒的琺瑯質，造成牙齒的蛀洞。另外，普雷沃菌(Prevotella spp.)及卟啉單胞菌(Porphyromona spp.)等厭氧菌則偏好附著於牙齦溝或牙周囊袋裡，釋放毒素刺激牙周組織，導致牙周發炎腫脹，進而造成牙齒鬆動、口臭及刷牙流血等症狀之產生。這些口腔病原菌不僅影響牙齒及牙周的健康，還可能與心血管疾病、糖尿病等疾病的發生有關。

人體的共生菌大幅度地影響人體的健康，因此益生菌的應用逐漸受到重視，其中乳酸菌已被廣泛應用於腸胃保健、減肥、抗過敏、提升免疫力及護肝等方面，近期更有究指出部分乳酸菌菌株可改善牙齒的健康。例如：給予含鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)或洛德乳酸桿菌(L.reuteri)之組成物可降低口腔內變形鏈球菌(S.mutans)之數量。將唾液乳酸桿菌(L.salivarius)與牙周致病菌共培養，則可抑制牙周致病菌生長能力。此外，亦有文獻指出鼠李糖乳桿菌可抑制變形鏈球菌生物膜之形成。然而，上述研究皆未揭露可同時抑制致齲菌及牙周致病菌的菌株。

有鑑於此，亟須提供一種單一益生菌株用於同時抑制或減少變形鏈球菌及普雷沃菌之菌種等口腔病原菌。

因此，本發明之一態樣係在提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，可同時抑制或減少變形鏈球菌(Streptococcus mutans)及普雷沃菌(Prevotella spp.)等口腔病原菌。

本發明之另一態樣係在提供一種抑制或減少口腔病原菌的組成物，其中組成物包含源自於植物乳桿菌GKD7(寄存編號為BCRC 910877)的有效成分。

本發明之再一態樣係在提供一種植物乳桿菌菌株用於製備抑制或減少口腔病原菌的組成物之用途，其中該組成物之一有效成分係源自於植物乳桿菌GKD7(寄存編號為BCRC 910877)，藉以抑制或減少一口腔病原菌之菌量。

根據本發明之上述之態樣，提出一種植物乳桿菌菌株。在一實施例中，上述植物乳桿菌菌株可例如於2019年3月6日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910877的植物乳桿菌GKD7。

根據本發明之另一態樣，提出一種抑制或減少口腔病原菌的組成物。在一實施例中，組成物可包含有效成分，其中有效成分係例如源自於前述植物乳桿菌GKD7。

在本發明之一實施例中，有效成分可包含但不限於由含或不含植物乳桿菌GKD7之培養物、含或不含植物乳桿菌GKD7之培養物乾燥物、植物乳桿菌GKD7之菌體、植物乳桿菌GKD7之菌體乾燥物及上述任意組合之族群。

在本發明之一實施例中，前述組成物可例如醫藥組成物或食品組成物。

在本發明之一實施例中，前述醫藥組成物可例如牙膏、漱口水、口內膏、口服錠或潔牙粉，前述食品組成物可例如菌粉、乳製品、口香糖、保健食品、老年食品或飲品。

在本發明之一實施例中，前述組成物可包含但不限於食品或醫療上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔助劑、防腐劑、填充劑及/或添加劑。

根據本發明之上述之態樣，提出一種植物乳桿菌用於製備維持口腔健康之組成物的用途，其中組成物之有效成分係源自於上述植物乳桿菌GKD7(寄存編號BCRC 910877)，藉以抑制或減少口腔病原菌之菌量。

在本發明之一實施例中，前述口腔病原菌可包含變形鏈球菌(S.mutans)及普雷沃菌(Prevotella spp.)。

在本發明之一實施例中，植物乳桿菌之口服有效劑量為每日每公斤2億菌至4億菌。在另一實施例中，為2.5億菌至3.5億菌。

應用本發明之抑制或減少口腔病原菌的植物乳桿菌GKD7，可顯著抑制或減少致齲菌與牙周致病菌，進而維持口腔健康。

101/103/105/107/109/201/203/205/207/209/501/503‧‧‧直條

401/403‧‧‧曲線

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1〕係繪示根據本發明一實施例之耐酸測試結果之直條圖。

〔圖2〕係繪示根據本發明一實施例之耐膽鹽測試結果之直條圖。

〔圖3〕係繪示根據本發明一實施例之不同乳酸菌與變形鏈球菌共培養後變形鏈球菌生物膜OD值之直條圖。

〔圖4〕係繪示根據本發明一實施例之變形鏈球菌之生長曲線圖。

〔圖5〕其係根據本發明一實施例之口服植物乳桿菌GKD7前後受試者口腔中鏈球菌與普雷沃菌占口腔菌相之菌量比。

本發明所提到的單數形式“一”、“一個”和“所述”包括複數引用，除非上下文另有明確規定。數值範圍(如10%~11%的A)若無特定說明皆包含上、下限值(即10%≦A≦11%)；數值範圍若未界定下限值(如低於0.2%的B，或0.2%以下的B)，則皆指其下限值可能為0(即0%≦B≦0.2%)。上述用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。

承上所述，本發明提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，可藉由同時抑制或減少口腔病原菌減少蛀牙與牙周病的發生率，進而維持牙齒健康。

在一實施例中，前述植物乳桿菌菌株可例如於2019年3月6日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910877的植物乳桿菌GKD7。在一例示中，植物乳桿菌GKD7相較於其他市面上販售之乳酸菌，具有較佳的耐酸性與耐膽鹽性，且具有較高的抗菌性。

本發明另提供一種抑制或減少口腔病原菌的組成物，其中組成物包含有效成分，有效成分係可例如源自於植物乳桿菌GKD7(寄存編號：BCRC 910877)。在一實施例中，上述有效成分係將植物乳桿菌GKD7經培養步驟所得之產物。培養方式並無特別限制，可為習知的固態培養或液態培養，以獲得培養物。可進一步對培養物以習知的固液分離、冷凍及/或乾燥步驟進行處理，以獲得含或不含植物乳桿菌GKD7之培養物、含或不含植物乳桿菌GKD7之培養物乾燥物、植物乳桿菌GKD7之菌體、植物乳桿菌GKD7之菌體乾燥物及上述任意組合之一族群。在一實施例中，上述有效成分係植物乳桿菌GKD7之凍乾粉。

上述組成物可例如醫藥組成物或食品組成物，其中醫藥組成物的種類並無特別限制，可例如牙膏、漱口水、口內膏、口服錠或潔牙粉等；食品組成物的種類也無特別限制，可例如菌粉、乳製品、口香糖、保健食品、老年食品或飲品等。

在一實施例中，上述組成物可選擇性地包含食品或醫療上可接受的成分，上述成分並無特別限制，以不干擾乳桿菌死菌培養物的功效為妥，可例如：載體、賦形劑、稀釋劑、輔助劑、防腐劑、填充劑及/或添加劑等。

本發明另提供一種植物乳桿菌GKD7用於製備維持口腔健康之組成物之用途，其中組成物之有效成分係源自於植物乳桿菌GKD7(寄存編號為BCRC 910877)，藉以抑制或減少口腔病原菌之菌量。

在一實施例中，口腔病原菌可包含變形鏈球菌(Streptococcus mutans)及普雷沃菌(Prevotella spp.)，其中前者是常見的習知致齲菌，後者是習知常見的牙周致病菌。

在應用上述組成物時，其施予途徑無特別限制，可例如經口投予或經皮吸收，端視實際需求與劑型調整。上述組成物之投藥量及投藥回數，亦可視需求彈性調整。在一實施例中，口服有效劑量為每日每公斤2億菌至4億菌。在另一實施例中，口服有效劑量為每日每公斤2.5億菌至3.5億菌。

經實驗證實，本發明之植物乳桿菌GKD7與口腔病原菌共培養時，可抑制或減少口腔病原菌之菌量。此外，植物乳桿菌GKD7經口服後，可減少口腔病原菌占口腔菌相之菌量比，進而有效減少齲齒與牙周病的發生，並維持口腔健康。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

1.植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株之篩選

(1)植物乳桿菌GKD7的來源

本實施例使用之植物乳桿菌菌株係取樣自台灣製作之台式泡菜中，並以篩選培養法與瓊脂覆蓋法(Agar overlay technique)篩選出具有較高的抗菌性的乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)。

篩選培養法係用適合乳酸菌生存的培養基培養樣本中的細菌，藉以篩選樣本中的乳酸菌。先將樣本進行稀釋與均質處理，再將樣本以Man Rogosa and Sharp(MRS)培養液於37℃下進行起始培養達16小時，以獲得乳酸菌菌量上升的初始培養。接著，將初始培養分別塗佈於MRS培養基瓊脂、雙歧桿菌培養基(BIM-25)瓊脂、馬鈴薯澱粉/酵母萃取瓊脂、溴甲酚綠MRS瓊脂或溴甲酚紫MRS瓊脂等固態培養基上並進行厭氧培養達40小時，以獲得多個分離的菌落。接下來，將上述分離的菌落以瓊脂覆蓋法篩選出具有較高的抗菌性的菌株。瓊脂覆蓋法誠屬本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。將篩選的菌株進行定序與序列分析以確認其菌種，並進行寄存。

藉由上述方法篩選的菌株為植物乳桿菌GKD7，已於2019年3月6日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910877。

(2)植物乳桿菌GKD7的耐酸性之評估

對植物乳桿菌GKD7與市售植物乳桿菌菌株(寄存編號為BCRC 12251、BCRC 10357、BCRC 80222及BCRC 80577)進行耐酸測試。首先，將原始De Man,Rogosa & Sharpe(MRS)培養液之酸鹼值(pH 6.5)以鹽酸調整至酸性(pH 3.2、pH 2.4或pH 2.0)。接著，將前述菌株進行活化並以前述酸性MRS培養液於37℃下培養達3小時。然後，以平板計數法(Plate count method)測定生菌(viable cells)數。

如圖1所示，其係繪示根據本發明一實施例之耐酸測試結果之直條圖，其中橫軸表示pH值，縱軸表示生菌數，直條101代表植物乳桿菌GKD7、直條103代表植物乳桿菌BCRC 12251、直條105代表植物乳桿菌BCRC 10357、直條107代表植物乳桿菌BCRC 80222且直條109代表植物乳桿菌BCRC 80577，符號「＊」與「#」分別表示在pH 3.0與pH 2.4時，與植物乳桿菌GKD7之生菌數相比較具有顯著差異(p<0.05)。

如圖1所示，本發明之植物乳桿菌GKD7(直條101)培養於pH 3.2、pH 2.4與pH 2.0培養基中，生菌數皆高於其他菌株的生菌數，特別是在pH 2.4與pH 2.0培養基中，植物乳桿菌GKD7之生菌數在統計上顯著高於其他菌株的生菌數，顯示植物乳桿菌GKD7的耐酸性高於市售的植物乳桿菌。

(3)植物乳桿菌GKD7的耐膽鹽性之評估

對植物乳桿菌GKD7與上述市售的植物乳桿菌菌株(BCRC 12251、BCRC 10357、BCRC 80222及BCRC 80577)進行耐膽鹽測試。將前述菌株進行活化並以添加或不添加0.3重量%膽鹽的MRS培養液於37℃下培養達30分鐘。接著，以平板計數法測定生菌數。

如圖2所示，其係繪示根據本發明一實施例之耐膽鹽測試結果之直條圖，其中橫軸由左至右表示未添加膽鹽之MRS培養液與添加0.3%膽鹽之MRS培養液，縱軸表示生菌數，直條201代表植物乳桿菌GKD7、直條203代表植物乳桿菌BCRC 12251、直條205代表植物乳桿菌BCRC 10357、直條207代表植物乳桿菌BCRC 80222且直條209代表植物乳桿菌BCRC 80577，符號「＊」表示生菌數與植物乳桿菌GKD7的生菌數相比具有顯著差異(p<0.05)。

如圖2所示，本發明之植物乳桿菌GKD7(直條201)培養於添加0.3重量%膽鹽之MRS培養液，生菌數顯著高於市售的植物乳桿菌，顯示植物乳桿菌GKD7與市售的植物乳桿菌相比具有較佳的耐膽鹽性。

綜合上述耐酸測試及耐膽鹽測試，說明植物乳桿菌GKD7在通過消化道後仍具有活性，具有做為口服組成物之潛力。

2.植物乳桿菌抑制或減少口腔病原菌的效果

(1)不同菌株抑制變形鏈球菌生物膜形成之比較

將植物乳桿菌GKD7以MRS培養液於37℃下進行培養，以獲得含植物乳桿菌GKD7之培養物。將含植物乳桿菌GKD7之培養物進行固液分離，可分別獲得植物乳桿菌GKD7之菌體與不含植物乳桿菌GKD7之培養物，以進行下列實驗。

將變形鏈球菌(Streptococcus mutans，寄存編號：BCRC 10793)與植物乳桿菌GKD7或其他已知可抑制變形鏈球菌的菌株共培養於胰蛋白大豆(Trypticase soy broth，TSB)培養液中，在37℃下進行厭氧培養達48小時，使變形鏈球菌產生生物膜。接著，將生物膜以番紅染色，再以450nm的光測量染色生物膜的光學密度(Optical density，OD)值。

在此實驗中，與變形鏈球菌共培養的菌株如下：實施例1：植物乳桿菌GKD7；比較例1：唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)M18，寄存於德國國家菌種保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)，寄存編號為DSM 14685；比較例2：糞腸球菌(Enterococcus faecium)WB2000，寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄託中心(NITE-IPOD)，寄存編號為NITE BP-01913；比較例3：鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)WB2000，寄存於NITE-IPOD，寄存編號為NITE BP-771；比較例4：唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)TI2711，寄存於BCRC，寄存編號為BCRC 910225，其中比較例1至4之菌株係習知具抑制或減少口腔致病菌效果之菌株。對照例1只培養變形鏈球菌，其中變形鏈球菌之菌量與總體積同實施例1、比較例1至4中變形鏈球菌之菌量與總體積。

請參閱圖3，其係繪示根據本發明一實施例之不同乳酸菌與變形鏈球菌共培養後變形鏈球菌生物膜OD值之直條圖，其中橫軸表示組別，縱軸表示OD值，「＊」表示不同組別間有顯著差異(p<0.05)。如圖3所示，相較於對照例1，比較例1、2及3的OD值雖略微下降，但在統計上沒有顯著差異。相反地，實施例1與比較例4的OD值顯著低於對照例1的OD值，其中，實施例1之OD值高於比較例4之OD值，表示本發明之植物乳桿菌GKD7可顯著抑制變形鏈球菌生物膜之形成，亦證實植物乳桿菌GKD7抑制變形鏈球菌形成生物膜之效果較佳。

(3)不含植物乳桿菌GKD7之培養物抑制變形鏈球菌生物膜之效果

將變形鏈球菌培養於添加或不添加上述不含植物乳桿菌GKD7之培養物的TSB培養液中，分別做為實施例2與對照例2，並於37℃下進行培養。期間每2小時取樣且以平板計數法測定總生菌數，並將結果繪製成生長曲線圖。

請參閱圖4，其係繪示根據本發明一實施例之變形鏈球菌之生長曲線圖，其中橫軸表示培養進行的時間，縱軸表示生菌數，曲線401表示對照例2，曲線402表示實施例2。如圖4所示，對照例2之生菌數隨著培養進行的時間等比上升，但實施例2中生菌數的增加幅度不如對照例2，在培養的過程中，實施例2的生菌數甚至不增反減，說明不含植物乳桿菌GKD7之培養物也可抑制變形鏈球菌。

(3)植物乳桿菌GKD7改變口腔菌相測試

為了觀察植物乳桿菌GKD7可經口攝入後是否改變口腔菌相，將植物乳桿菌GKD7製成口服錠，其中口服錠每錠之重量為500mg，每克含有約2x10¹⁰ CFU的植物乳桿菌GKD7。令受試者(體重以60至70公斤計)每日服用約200億菌數，持續14天。口服前後分別以棉棒沿口腔內壁取樣，並以16s總體基因學分析法比較口腔菌相中的鏈球菌(Streptococcus spp.)及普雷沃菌(Prevotella spp.)之菌量占口腔菌相之菌量比。

請參閱圖5，其係根據本發明一實施例之口服植物乳桿菌GKD7前後受試者口腔中鏈球菌與普雷沃菌占口腔菌相之菌量比，其中橫軸表示取樣的時間點，縱軸表示菌量比，直條501表示普雷沃菌，直條503表示鏈球菌。如圖5所示，受試者口服植物乳桿菌GKD7後，鏈球菌的菌量比由原先的70.5%降至56.7%，普雷沃菌的菌量比由原先的10.5%降至2.7%，表示服用植物乳桿菌GKD7可同時降低口腔中的鏈球菌與普雷沃菌之菌量。

由上述結果顯示，本發明之植物乳桿菌GKD7可確實抑制或降低口腔中的變形鏈球菌及普雷沃菌，意味著應用本發明之植物乳桿菌GKD7可降低齲齒及/或牙周病的發生率。

綜言之，本發明雖以特定菌株、特定的劑型、特定的對象、特定的投予方式、或特定的評估方式作為例示，說明本發明之植物乳桿菌GKD7抑制或降低口腔病原菌之用途，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明亦可使用其他菌株、其他的劑型、其他的對象、其他的投予方式或其他的評估方式進行。

由上述實施例可知，本發明之抑制或降低口腔病原菌之菌株、含其之組成物及其用途，其優點在於可同時抑制或降低變形鏈球菌及普雷沃菌，進而降低齲齒及/或牙周病的發生率。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

【生物材料寄存】

植物乳桿菌GKD7(Lactobacillus plantarum)係於2019年3月6日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910877。

501/503‧‧‧直條

Claims

一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其係於2019年3月6日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910877的植物乳桿菌GKD7。
一種抑制或減少口腔病原菌的組成物，其中該組成物包含一有效成分，該有效成分係源自於植物乳桿菌GKD7，該植物乳桿菌GKD7於2019年3月6日寄存於台灣新竹食品路331號財團法人食品工業發展研究所生物資源中心(BCRC)，寄存編號為BCRC 910877。
如申請專利範圍第2項所述之抑制或減少口腔病原菌的組成物，其中該有效成分係由含或不含該植物乳桿菌GKD7之一培養物、含或不含該植物乳桿菌GKD7之一培養物乾燥物、該植物乳桿菌GKD7之一菌體、該植物乳桿菌GKD7之一菌體乾燥物及上述任意組合之一族群。
如申請專利範圍第2項所述之抑制或減少口腔病原菌的組成物，其中該組成物係一醫藥組成物或一食品組成物。
如申請專利範圍第4項所述之抑制或減少口腔病原菌的組成物，其中該醫藥組成物係一牙膏、一漱口水、一口內膏、一口服錠或一潔牙粉，該食品組成物係一菌粉、一乳製品、一口香糖、一保健食品、一老年食品或一飲品。
如申請專利範圍第4項所述之抑制或減少口腔病原菌的組成物，其中該組成物更包含一食品或一醫療上可接受的一載體、一賦形劑、一稀釋劑、一輔助劑、一防腐劑、一填充劑及/或一添加劑。
一種植物乳桿菌用於製備維持口腔健康之組成物的用途，其中該組成物之一有效成分係源自於植物乳桿菌GKD7(寄存編號為BCRC 910877)，藉以抑制或減少一口腔病原菌之菌量。
如申請專利範圍第7項所述之用於製備維持口腔健康之組成物的用途，其中該口腔病原菌包含變形鏈球菌(Streptococcus mutans)及普雷沃菌(Prevotella spp.)。
如申請專利範圍第7項所述之用於製備維持口腔健康之組成物的用途，其中該植物乳桿菌GKD7之一口服有效劑量為每日每公斤2億菌至4億菌。
如申請專利範圍第7項所述之用於製備維持口腔健康之組成物的用途，其中該植物乳桿菌GKD7之一口服有效劑量為每日每公斤2.5億菌至3.5億菌。