CN117683696A - 一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌ls61及其制药用途、药物和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌LS61及其制药用途、药物和制备方法属于微生物技术领域。本发明提供一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌LS61，其保藏编号为CCTCC NO：M20232003。基于该菌株LS61，本发明还提供其在制备预防龋齿、缓解牙周炎的药物和/或制备抑菌剂方面的用途，其预防龋齿、缓解牙周炎的药物和抗菌剂以及药物的制备方法。本发明提供的唾液联合乳杆菌LS61能有效改善和缓解牙周炎模型大鼠的体重下降和牙龈卟啉单胞菌的定植并具有广谱抑菌性能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌LS61及其制药用途、药物和制备方法。
背景技术
造成龋齿的环境风险因素包括致龋饮食、口腔健康状况不佳、致龋细菌数量高、牙菌斑、唾液流量不足和缺乏足够的氟化物。变异链球菌是口腔菌群中的细菌之一，被称为蛀牙的基本原因和生物膜形成细菌之一。虽然各种因素的干预对蛀牙是有效的，但微生物因素是主要因素。因此，人们认为益生菌疗法可以成为预防口腔疾病的有效方法。
牙周炎是一种慢性炎症性疾病，是对多微生物失调生物膜的反应，影响牙齿周围的牙周支持组织，导致牙槽骨吸收。牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性厌氧菌，被认为是牙周炎的关键病原体。牙龈卟啉单胞菌的毒力因子，包括脂多糖（LPS）、血细胞凝集素、牙龈蛋白酶和菌毛，在诱导免疫炎症反应和牙槽骨丢失中起重要作用。
口腔微生物群的组成与口腔健康密切相关，其破坏是口腔疾病的重要一步。益生菌是一类足量摄入后对人体健康有益的活性微生物，益生菌具有抵抗病原菌的侵袭，保护人体健康，提高人体免疫力的作用，在溃疡性结肠炎、急性肠胃炎、腹泻、便秘等胃肠道疾病方面有良好的治疗效果。益生菌疗法也逐渐被应用于治疗龋病、缓解牙周炎、防治口臭等口腔疾病的防治中。益生菌疗法能够从根源上控制牙周炎生物膜的形成、降低炎症水平，有利于实现牙周炎长期的防治且无明显毒副作用。
目前现有技术已有预防或治疗龋齿和牙周病的唾液联合乳杆菌的报道，然而，现有的唾液联合乳杆菌大多只对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌具有抑制作用，抗菌谱相当有限。因此，本领域亟需开发同时具备抗菌谱广和预防龋齿、缓解牙周炎等性能的新的唾液联合乳杆菌。
发明内容
为了解决现有的唾液联合乳杆菌大多只对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌具有抑制作用，抗菌谱相当有限的技术问题，并基于本领域现有技术存在的上述需求，本发明提供一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌LS61及其制药用途、药物和制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61，其保藏编号为CCTCC NO：M20232003。
保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61在制备预防龋齿、缓解牙周炎的药物和/或制备抑菌剂方面的用途。
预防龋齿、缓解牙周炎的药物以唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61为药物活性成分。
抑菌剂的抗菌谱包括：变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌。
一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物，包括药物活性成分，所述药物活性成分包括保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61。
所述的一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物，还包括：药学上可接受的辅料。
一种抑菌剂，包括抑菌活性成分，所述抑菌活性成分包括保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61。
所述的一种抑菌剂，还包括：辅料。
一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物的制备方法，包括如下步骤：以保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61作为药物活性成分。
所述的一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物的制备方法，还包括如下步骤：添加药学上可接受的辅料。
本发明的有益效果如下：
本发明从采集的口腔样本中筛选获得一株唾液联合乳杆菌，其对溶菌酶具有较强的耐受能力，相比对照菌株唾液链球菌K12，该唾液联合乳杆菌对口腔常见病原菌：变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌都具有更高的共聚能力；该唾液联合乳杆菌能够有效抑制变异链球菌形成生物膜，且具有较高的表面疏水性。同时，该唾液联合乳杆菌具有较强的黏附HGE细胞的能力，并能有效缓解由牙龈卟啉单胞菌引起的HGE细胞炎症。并且，通过动物实验证实了该唾液联合乳杆菌对动物牙周炎具有显著的缓解作用。更重要的是，该唾液联合乳杆菌能同时对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌具有较强的抑制作用，是一株同时具有广谱抗菌且有效预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌，遂将其命名为LS61，并送保藏，其保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO：M20232003；
分类命名：唾液联合乳杆菌 LS61
Ligilactobacillus salivarius LS61；
保藏日期：2023年10月25日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
图1为本发明实验例3的唾液联合乳杆菌LS61对溶菌酶的耐受率柱形图；图中横坐标的LS61代表实验组，K12代表对照组。
图2为本发明实验例5的唾液联合乳杆菌LS61与变异链球菌的共聚集能力结果的柱形图。
图3为本发明实验例6的唾液联合乳杆菌LS61与牙龈卟啉单胞菌的共聚集能力结果的柱形图。
图4为本发明实验例7的唾液联合乳杆菌LS61抑制变异链球菌产生物膜的实验结果的柱形图。图中横坐标的LS61代表唾液联合乳杆菌LS61的生物膜形成抑制率，K12代表唾液链球菌K12的生物膜形成抑制率。
图5为本发明实验例11的唾液联合乳杆菌LS61对牙周炎模型大鼠体重的影响的柱形图。
图6为本发明实验例11的唾液联合乳杆菌LS61对牙龈卟啉单胞菌定植的影响的柱形图。
具体实施方式
下面结合实施例、附图、实验例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，也并以此限制本发明的保护范围。
一、生物材料的来源
（一）本发明实验例3、实验例5-7使用的对照菌株唾液链球菌K12可商用菌株，可商购获得。
（二）本发明实验例4使用的牙龈卟啉单胞菌ATCC BAA-308（W83）、变异链球ATCC25175、脆弱拟杆菌ATCC25285购自广东微生物菌种保藏中心。肺炎克雷伯菌为肺炎克雷伯菌菌株587，该菌株已登录NCBI，其登录号为MT573143；弗格森埃希菌为弗格森埃希菌7610，该菌株已登录NCBI，其登录号为MT516163；咽峡炎链球菌为咽峡炎链球菌10378，该菌株已登录NCBI，其登录号为MW090399；目前由申请人实验室保存，申请人承诺自本发明申请日起20年内向公众发放用于验证本发明的技术效果。
（三）本发明实验例5和9-10使用的人牙龈上皮细胞HGE来源于广州华拓生物科技有限公司。
（四）本发明实验例5、7使用的变异链球菌ATCC 25175购自广东微生物菌种保藏中心
（五）本发明实验例11使用的SPF级Wistar大鼠可商购获得，实验例6、11使用的牙龈卟啉单胞菌ATCC BAA-308（W83）购自广东微生物菌种保藏中心。
二、试剂与耗材
（一）如无特殊说明，本发明实施例和实验例中使用的各类试剂耗材均可商购获得，相关实验步骤均为本领域常见操作，具有本领域技术人员可常规理解的技术含义。
（二）本发明实验例中使用的培养基：
MRS固体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，调节pH 6.8。
MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，调节pH 6.8。
LB培养基、BHI培养基、TSA培养基均为商业培养基。
第1组实施例、本发明的菌株LS61
本组实施例提供一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61，其保藏编号为CCTCC NO：M20232003。
任何培养、扩繁、发酵、富集、生产、制备、使用、接种、扩增、转化、修饰、改造、销售、许诺销售保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一株唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61的行为，和/或，将保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一株唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61与其他益生菌联用的行为，和/或，用保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一株唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61对各类病原菌的拮抗、和/或制备抗菌产品、和/或制备改善便秘或调节肠道菌群的药物、和/或制备具有通便功能或调节肠道菌群功能的保健食品均落在本发明的保护范围。
所述其他益生菌包括但不限于：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、婴儿双歧杆菌（即，长双歧杆菌婴儿亚种）、乳双歧杆菌（即，动物双歧乳脂亚种）、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌。
本领域技术人员可根据实际生产需要，结合药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），对药用辅料进行常规选择或调整，进而将保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一株唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61制成不同剂型、不同存储条件、不同保质期的产品，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。
第2组实施例、本发明菌株LS61的用途
本组实施例提供保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61在制备预防龋齿、缓解牙周炎的药物和/或制备抑菌剂方面的用途。
在具体的实施例中，预防龋齿、缓解牙周炎的药物以唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61为药物活性成分。
在另一些实施例中，抑菌剂的抗菌谱包括：变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌。
第3组实施例、本发明的药物
本组实施例提供一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物包括药物活性成分，所述药物活性成分包括保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61。
在进一步的实施例中，所述的一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物，还包括：药学上可接受的辅料。
在更具体的实施例中，所述药学上可接受的辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》、《微生物菌剂技术研究与应用》等），本领域技术人员可对上述药学上可接受的辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO：M20232003的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。
在具体的实施例中，所述药物的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。
第4组实施例、本发明的抑菌剂
本组实施例提供一种抑菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种抑菌剂包括抑菌活性成分，所述抑菌活性成分包括保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61。
在进一步的实施例中，所述的一种抑菌剂，还包括：辅料。
在更具体的实施例中，所述辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》、《微生物菌剂技术研究与应用》等），本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO：M20232003的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。
在具体的实施例中，所述产品的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。
在一些实施例中，抑菌剂的抗菌谱包括：变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌。
第5组实施例、本发明的药物的制备方法
本组实施例提供一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述制备方法包括如下步骤：以保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61作为药物活性成分。
在具体的实施例中，所述制备方法还包括如下步骤：添加药学上可接受的辅料。
在更具体的实施例中，所述药学上可接受的辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》、《微生物菌剂技术研究与应用》等），本领域技术人员可对上述药学上可接受的辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO：M20232003的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。
在具体的实施例中，所述药物的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。
实验例1、菌株分离筛选
将采集的口腔样本置于无菌取样管中冰盒运输，在无菌条件下用0.85%生理盐水梯度稀释，选取合适稀释梯度在LBS琼脂平板上涂布，37℃培养48-72小时。通过肉眼观察其菌落形态挑取疑似单菌落，对其镜检观察并进行初步筛选和纯化培养。纯化后使用MRS液体厌氧管37℃培养8-12小时，离心去上清后重悬于无菌25%甘油水溶液中，保存于武汉微康益生菌研究院菌种库。
实验例2、菌株鉴定
对筛选的目的菌株液体扩培，收集菌体，提取基因组DNA，采用中国发明专利ZL202210478937.4第58段记载的通用引物27F和1492R扩增其16SrDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系：10×buffer 10μL，10mMdNTP 2μL，上下引物各1μL，DNA模板2μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 34μL。95℃预变性10min；然后94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min共35个循环，结束后72℃延伸5min。将PCR产物通过凝胶电泳检测后送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将鉴定的基因序列用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，根据分子生物学鉴定结果，菌株的拉丁文名称为Ligilactobacillus salivarius，确定该菌株为唾液联合乳杆菌。将该菌株命名为LS61，并送保藏，其保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO：M20232003；
分类命名：唾液联合乳杆菌 LS61
Ligilactobacillus salivarius LS61；
保藏日期：2023年10月25日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
实验例3、唾液联合乳杆菌LS61对溶菌酶的耐受能力
在MRS培养基中加入2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL的溶菌酶，在96孔板中加入240μL含不同浓度溶菌酶的MRS培养基，二代培养好的菌液以4%的接种量接种到MRS液体培养基中，用高通量微生物生长曲线测量仪测量培养24h的OD600值。按照以下公式计数菌株的溶菌酶耐受能力，以公认的对口腔有益且商品化的唾液链球菌K12为对照组，以本发明的唾液联合乳杆菌LS61作为实验组。
OD1 / OD2×100% = 溶菌酶耐受能力%
注：OD1：含不同溶菌酶的MRS培养基培养24h后的OD值；OD2：不含溶菌酶的MRS培养基培养24h后的OD值。
实验结果如图1所示，唾液联合乳杆菌LS61在溶菌酶浓度为1~2 mg/mL时，生长基本不受影响，当溶菌酶浓度为2mg/mL时，耐受率达到242.18%，说明该菌株具有较好的溶菌酶耐受能力，进一步说明其在口腔环境下具有很好的存活能力。
实验例4、唾液联合乳杆菌LS61对病原菌的抑制能力
牙龈卟啉单胞菌菌悬液的制备：牙龈卟啉单胞菌接种到含5%脱纤维羊血的TSA固体平板中，37℃厌氧培养72h。
变异链球菌菌悬液的制备：变异链球菌以2%的接种量接种到BHI液体培养基中，37℃、250rpm/min 摇床培养24h。
脆弱拟杆菌菌悬液的制备：脆弱拟杆菌接种到含5%脱纤维羊血的TSA血平板中，37℃培养16～20 h。
咽峡炎链球菌菌悬液的制备：咽峡炎链球菌接种到含5%脱纤维羊血的TSA血平板中，37℃培养16～20 h后。
肺炎克雷伯氏菌菌悬液的制备：肺炎克雷伯氏菌接种到含5%脱纤维羊血的TSA血平板中，37℃培养16～20 h后。
弗格森埃希菌菌悬液的制备：弗格森埃希菌以2％的接种量接种到LB液体培养基中，37℃培养16～20 h后。
采用牛津杯法，将致病菌按一定比例混合到含5%脱纤维羊血的TSA培养基（脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌使用含5%脱纤维羊血的BHI培养基；变异链球菌使用BHI培养基；弗格森埃希菌、肺炎克雷伯氏菌使用MRS培养基）中，体系致病菌活菌数在106 CFU/mL数量级，取出牛津杯后，加入150μL唾液联合乳杆菌LS61菌液，37℃培养过夜培养，测量抑菌圈直径。
表1. 唾液联合乳杆菌LS61对口腔病原菌的抑制能力
| 指示菌株 | 抑菌圈直径mm |
| 变异链球菌 | 23.00±0.50 |
| 牙龈卟啉单胞菌 | 25.50±0.00 |
| 脆弱拟杆菌 | 19.17±1.26 |
| 咽峡炎链球菌 | 16.83±1.26 |
| 肺炎克雷伯氏菌 | 16.00±0.00 |
| 弗格森埃希菌 | 15.33±0.76 |
牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性厌氧菌，被认为是牙周炎的关键病原体，变异链球菌是口腔菌群中的细菌之一，被称为是蛀牙的基本原因，同时也是生物膜形成的病原菌之一。实验结果如上表1所示，唾液联合乳杆菌LS61对口腔病原菌变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌均具有较强的拮抗作用，说明唾液联合乳杆菌LS61能够预防龋齿、缓解牙周炎。同时，唾液联合乳杆菌LS61对脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌也具有一定的抑制作用，说明其具有广谱抑菌性。
实验例5、唾液联合乳杆菌LS61与变异链球菌的共聚集能力测定
将唾液联合乳杆菌LS61菌株按2％接种量接种于MRS液体培养基，37℃培养24h，菌液备用。变异链球菌按1％接种量接种至BHI培养基中，37℃培养24h，菌液待用。分别将培养好的唾液联合乳杆菌LS61和变异链球菌，离心，收集菌体，用PBS缓冲洗2次后，再用PBS重悬，调至唾液联合乳杆菌LS61菌液的OD600值为0.6，变异链球菌菌液的OD600值为0.4，充分震荡混匀，分别测定初始OD600的值Ax、Ay，唾液联合乳杆菌LS61与变异链球菌各取20mL至50mL离心管中混匀，涡旋震荡20S后37℃静置孵育，在孵育2h、5h、21h、24h时，分别小心吸取上层液体2.5mL，测定菌悬液在600nm处的吸光值(A)，计算菌株与变异链球菌的共聚力。共聚力％＝[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/[Ax+Ay/2]×100，其中x和y分别代表两种菌株，(x+y)代表混合物。以公认的对口腔有益且商品化的唾液链球菌K12为对照。
实验结果如图2所示，唾液联合乳杆菌LS61与变异链球菌在2h时的共聚能力为11.78%，而在5h时的共聚能力显著增加到19.00%，逐步上升，在24h达到40.29%，与对照菌株K12相比，唾液联合乳杆菌LS61具有更高的与变异链球菌共聚集的能力。说明唾液联合乳杆菌LS61能够以共聚集的形式去除变异链球菌，效果优于唾液链球菌K12，表现出预防龋齿的潜力。
实验例6、唾液联合乳杆菌LS61与牙龈卟啉单胞菌的共聚集能力测定
将唾液联合乳杆菌LS61菌株按2％接种量接种于MRS液体培养基，37℃培养24h，菌液备用。牙龈卟啉单胞菌接种至含5%脱纤维羊血的TSA固体培养基中，37℃厌氧培养72h。分别将培养好的唾液联合乳杆菌LS61和牙龈卟啉单胞菌，离心，收集菌体，用PBS缓冲液洗2次后，再用PBS重悬，调至唾液联合乳杆菌LS61菌液的OD600值为0.6，牙龈卟啉单胞菌菌液的OD600值为0.4，充分震荡混匀，分别测定初始OD600的值Ax、Ay，唾液联合乳杆菌LS61与牙龈卟啉单胞菌各取20mL至50mL离心管中混匀，涡旋震荡20S后37℃静置孵育，在孵育2h、5h、21h、24h时，分别小心吸取上层液体2.5mL，测定菌悬液在600nm处的吸光值(A)，计算菌株与牙龈卟啉单胞菌的共聚力。共聚力％＝[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/[Ax+Ay/2]×100，其中x和y分别代表两种菌株，(x+y)代表混合物。以公认的对口腔有益且商品化的唾液链球菌K12为对照。
实验结果如图3所示，唾液联合乳杆菌LS61与牙龈卟啉单胞菌在2h时的共聚能力为10.07%，而在5h时共聚能力显著增加到24.64%，逐步上升，在24h达到44.33%，与对照菌株K12相比，唾液联合乳杆菌LS61具有更高的与牙龈卟啉单胞菌共聚集的能力。说明唾液联合乳杆菌LS61能够以共聚集的形式去除牙龈卟啉单胞菌，效果优于唾液链球菌K12，表现出更强的缓解牙周炎的潜力。
实验例7、唾液联合乳杆菌LS61对变异链球菌生物膜形成的抑制作用
分别活化唾液联合乳杆菌LS61和变异链球菌，将唾液联合乳杆菌LS61菌液上清过滤除菌，将实验分为两组，一组为变异链球菌组；一组唾液联合乳杆菌LS61上清和变异链球菌按1：1的比例混合制止成的悬液。分别将两组菌液加到96孔细胞培养板中，变异链球菌组加100μL变异链球菌菌液，唾液联合乳杆菌LS61+益生菌上清和变异链球菌按1：1的比例混合制止成的悬液，将此96孔板置于37℃摇床培养24h。取出96孔板，小心吸去各孔的培养基，再往里面加入100μL的超纯水，放置摇床低速水平摇晃1min，倒掉液体，此过程重复3次去掉黏附的游离菌。再往上述各孔中加100μL1%结晶紫，25℃摇床低速水平摇晃20min，倒掉结晶紫染料。往上述各孔中加入超纯水，缓慢摇晃去除洗液，重复三次，去掉孔板中的水分，室温自然晾干，生物膜和结晶紫结合。使用95%的乙醇每孔加入100μL，25℃摇床低速水平摇晃20min进行脱色，脱色结束后，用酶标仪在OD550nm的数值。计算公式如下：
生物膜形成的抑制率 = (1-A1/A2)*100%
其中A1：益生菌和变异链球菌组；A2：变异链球菌组。实验以唾液链球菌K12作为对照。
实验结果如图4所示，唾液联合乳杆菌LS61对变异链球菌产生物膜的抑制作用优于唾液链球菌K12，抑制率达到了83.89%，说明唾液联合乳杆菌LS61能够有效抑制变异链球菌形成生物膜，进一步说明唾液联合乳杆菌LS61能够预防龋齿。
实验例8、唾液联合乳杆菌LS61的表面疏水性实验
将唾液联合乳杆菌LS61菌株按2％接种量接种于LMRS液体培养基，37℃培养24h，菌液备用。将活化培养好的菌液以5000rmp离心5min收集菌体，菌体用等量 PBS 缓冲液清洗两次，重悬于 PBS缓冲液中，调整菌悬液OD600值在1.0左右，同时测定菌悬液在 600 nm处的吸光度值（A0）。取上述 12 mL 菌悬液与 4mL 二甲苯于试管中，盖塞子；再充分混合（混匀器点震60S），室温放置 10 min 后，再漩涡混合（混匀器点震60S），再于室温下静置20 min，取下水相测定 600 nm 处的吸光度值（A1）。以缓冲液为空白对照。表面疏水性以细菌黏附有机溶剂的百分率来表示：
表面疏水性（%）=（1-A1/A0）×100%。
表2. 唾液联合乳杆菌LS61的表面疏水性实验结果
| 菌株编号 | 表面疏水性% |
| LS61 | 94.07±1.87 |
实验结果如表2所示，唾液联合乳杆菌LS61具有较高的表面疏水性，说明其在口腔中具有较强的定植能力。
实验例9、唾液联合乳杆菌LS61与HGE细胞的黏附实验
（1）HGE细胞培养
HGE细胞在DMEM培养基中培养，培养基中添加10％热灭活（56℃，30min）胎牛血清（FBS），1％青霉素和链霉素，37℃，90％湿度，5％CO2培养箱中培养。
（2）黏附实验方案
将HGE细胞以2×105cell/mL的密度接种到12孔板中，隔天换液一次，直到12孔板中HGE细胞达到90%的融合度。与此同时，取已培养好的唾液联合乳杆菌LS61菌液，10000 r/min 室温离心 1 min 收集菌体，并用无菌 PBS 洗涤两次，用DMEM 培养基重悬，调整到菌液浓度为1×108 CFU/mL。取出12孔板，吸去培养基，加入 PBS 缓冲液漂洗2次，吸去缓冲液，再加入制备好的菌悬液 1 mL/孔，混匀后，置于5% CO2、37℃培养箱共孵育 2 h。结束后小心移去培养上清，加入无菌 PBS 漂洗 5 次以除去未黏附的细菌，加入胰酶细胞消化液0.2 mL/孔，消化5min，以使细胞从培养板孔中洗脱下来，收集溶液即为样品，将收集的样品进行梯度稀释和活菌计数。
表3. 唾液联合乳杆菌LS61与HGE细胞的黏附实验结果
| 组别 | 黏附能力CFU /cell | 黏附率% |
| 唾液联合乳杆菌LS61 | 32.79±1.05 | 10.46±2.08 |
实验结果如表3所示，唾液联合乳杆菌LS61与HGE细胞的黏附能力为32.79±1.05CFU/cell，黏附率为10.46±2.08%，说明唾液联合乳杆菌LS61在牙龈上皮细胞上具有较强的黏附定植的能力。
实验例10、唾液联合乳杆菌LS61对牙龈卟啉单胞菌诱导的HGE细胞炎症的影响
将活化后的HGE细胞以1×105个/孔的浓度接种于24孔板，置于37℃培养箱培养24h贴壁后，弃去培养液，用PBS洗2次。实验设置三个组，空白组：添加0.5mL的DMEM培养基；模型组：添加0.25mL的DMEM培养基和0.25mL的牙龈卟啉单胞菌菌悬液（活菌浓度为1×108CFU/mL）；益生菌组：添加0.25 mL唾液联合乳杆菌LS61菌悬液（活菌浓度为1×108 CFU/mL）和0.25mL的牙龈卟啉单胞菌菌悬液（活菌浓度为1×108CFU/mL），置于37℃，5% CO2培养箱培养16小时。收集细胞液于离心管内，离心（4℃，3000 r/min离心10 min）后轻轻吸取上清液分装并保存。分别按ELISA试剂盒的说明书，测定细胞培养液中IL-10的浓度。
表4. 唾液联合乳杆菌LS61对牙龈卟啉单胞菌诱导的HGE细胞炎症因子的影响
| 组别 | IL-10浓度pg/mL |
| 空白组 | 972.22±55.49 |
| 模型组 | 858.33±54.17 |
| 益生菌组 | 937.50±90.24 |
实验结果如表4所示，与空白组相比，模型组IL-10的浓度下降，说明牙龈卟啉单胞菌能够引起HGE细胞炎症。与模型组相比，益生菌组IL-10的浓度增加，说明唾液联合乳杆菌LS61 能够缓解由牙龈卟啉单胞菌引起的HGE细胞炎症。
实验例11、唾液乳杆菌对大鼠牙周炎的缓解作用
取雄性、5周龄左右的SPF级Wistar大鼠30只，在温度和湿度均恒定的环境中，按12h光照和12h黑夜进行饲养。所有大鼠前一星期适应环境和饮食，之后按每组平均体重一致的原则随机分成3组，每组10只，分别是空白对照组（空白组）、牙周炎模型组（模型组）和益生菌干预组（益生菌组），实验周期维持5周。空白对照组在实验期间喂食正常饲料和饮用水，除空白组外，模型组和益生菌组均进行牙周炎造模，持续一周，造模期间，每天擦拭牙龈卟啉单胞菌菌悬液200μL（菌悬液浓度109 CFU/mL），擦拭后并停止喂食及饮水1h，确定其在大鼠口腔成功定植，即造模成功。造模成功后，益生菌干预组每周3次擦拭唾液联合乳杆菌LS61菌悬液，直至第5周实验结束。在大鼠臼齿上擦拭，即将饱和吸收菌液的棉拭子在大鼠口腔牙齿的每四分之一部位统一作用时间为15s。实验期间，牙周炎模型组和益生菌干预组均饲喂饲料Keyes 2000和添加有10％蔗糖的饮用水。其中Keyes 2000饲料成分（w/w）：小麦粉6％，奶粉28％，蔗糖56％，酵母4％，苜蓿粉3％，肝粉1％，盐2％。
（1）唾液联合乳杆菌LS61对大鼠体重的影响
大鼠实验前后体重测定结果如图5所示，第1周表示适应期结束后的体重，第5周表示解剖前一天的体重，结果显示，第5周空白组平均体重高于模型组，说明牙周炎能够明显影响模型组大鼠的进食造成体重下降，与模型组相比，益生菌组可以缓解牙周炎造成的大鼠体重下降。
（2）唾液联合乳杆菌LS61对牙龈卟啉单胞菌定植的影响
实验期间，在造模结束后的每一周分别给大鼠口腔牙齿进行取样，共取样四次。将取得样品稀释涂布于相应固体平板进行活菌计数，作为致病菌定植检验。菌落计数用到的固体平板为：添加有12μg/mL氨苄青霉素和5％(v/v)脱纤维羊血的BHI固体培养基，并结合菌落形态特征对大鼠口腔中的牙龈卟啉单胞菌进行计数。
考察不同时期取样各组实验大鼠口腔牙龈卟啉单胞菌的计数结果，由图6可知，与模型组相比，唾液联合乳杆菌LS61菌悬液在一定程度上减少牙龈卟啉单胞菌的定植。
Claims (10)
1.一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M20232003。
2. 保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61在制备预防龋齿、缓解牙周炎的药物和/或制备抑菌剂方面的用途。
3. 根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61在制备预防龋齿、缓解牙周炎的药物和/或制备抑菌剂方面的用途，其特征在于，预防龋齿、缓解牙周炎的药物以唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61为药物活性成分。
4. 根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61在制备预防龋齿、缓解牙周炎的药物和/或制备抑菌剂方面的用途，其特征在于，抑菌剂的抗菌谱包括：变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌。
5. 一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物，包括药物活性成分，其特征在于，所述药物活性成分包括保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61。
6.根据权利要求4所述的一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物，其特征在于，还包括：药学上可接受的辅料。
7. 一种抑菌剂，包括抑菌活性成分，其特征在于，所述抑菌活性成分包括保藏编号为CCTCC NO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61。
8.根据权利要求7所述的一种抑菌剂，其特征在于，还包括：辅料。
9. 一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物的制备方法，其特征在于，以保藏编号为CCTCCNO：M20232003的一种预防龋齿、缓解牙周炎的唾液联合乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）LS61作为药物活性成分。
10.根据权利要求9所述的一种预防龋齿、缓解牙周炎的药物的制备方法，其特征在于，添加药学上可接受的辅料。
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| MARZENA KUCIA等: "Effect of LigiLactobacillus salivarius and Other Natural Components against Anaerobic Periodontal Bacteria", MOLECULES, vol. 25, 2 October 2020 (2020-10-02), pages 4519 * |
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