CN118028182A - 一种改善口腔健康的约翰逊氏乳杆菌及其用途 - Google Patents
一种改善口腔健康的约翰逊氏乳杆菌及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，涉及一种改善口腔健康的约翰逊氏乳杆菌及其用途。所述约翰逊氏乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2024403，对常见的口腔致病菌如变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌具有较好的抑制作用，能与这些致病菌发生共凝集，且具有抗炎效果，因而有助于改善口腔健康。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种改善口腔健康的约翰逊氏乳杆菌及其用途。
背景技术表
龋齿、牙周病、口臭是临床常见的三大口腔病症，危害绝大多数人群。根据第四次全国口腔流行病学调查显示，我国12岁儿童恒牙的龋患率为34.5%，比十年前上升了7.8个百分点；5岁儿童乳牙龋患率为70.9%，比十年前上升了5.8个百分点，呈上升态势。成年人龋患率在60%以上，且绝大多数中年人的龋齿都未得到治疗。2015年35～44岁人群中牙龈出血检出率为87.4%，与2005年相比上升了10.1%，有活动性牙周炎症的人群比例逐年上升。根据口臭检测方式的不同，其患病率为6%~50%，给患者的社会交往带来不良影响。
龋齿，通常称为蛀牙，是一种由于口腔内菌群失衡引起的内源性疾病，主要是通过口腔内的菌群分解牙釉质中的矿质成分，引起牙齿硬组织不同程度的破坏形成的。龋齿的发展过程主要包括：1）细菌作用：变异链球菌等链球菌属在生长的过程中产生生物被膜，具有很强的黏附性，其他种类的致龋菌吸附在被膜表面形成牙菌斑；2）酸蚀作用：细菌代谢产生的酸性物质会腐蚀牙齿的硬组织，导致矿物质（如钙和磷）溶解，形成脱矿区；3）脱矿与再矿化：牙齿在正常情况下会经历脱矿和再矿化的过程，当脱矿过程超过再矿化时，牙齿的硬组织就会逐渐被破坏；4）龋洞形成：随着时间的推移，脱矿区域会扩大并深入牙齿内部，形成龋洞。如果不进行治疗，龋洞会越来越大，最终可能影响到牙髓（牙齿的神经和血管组织），引起疼痛和其他并发症。可见，致龋细菌是龋齿发生的先决条件，是影响龋齿形成的第一步。目前最常用的预防龋齿的化合物是氟化钠和氯已定。虽然氟化钠和氯己定具有抑制GTF（葡糖基转移酶）作用，但有研究表明氟化物的使用会导致变异链球菌产生耐药性，变异为耐药菌株。
牙周炎是由菌斑始动的炎性疾患，发生的外在表现形式主要为牙菌斑、牙结石、牙周脓肿、牙龈萎缩和牙龈出血，主要病因是感染了特定的革兰氏阴性厌氧菌如牙龈卟啉单胞菌，从而引起口腔菌群的失调，进而导致菌群与宿主机体免疫系统的不协调。目前，牙周病的常用治疗方法有机械治疗、药物治疗和新技术(激光、光动力、高压氧)治疗。基础治疗主要通过龈下刮治和根面平整技术将口腔内的菌斑和牙石去除，但常有器械达不到的地方或短期内再复发，影响治疗效果。药物治疗也对牙周病具有一定的防治效果，但其具有很大的副作用及药物毒性，例如，牙周脓肿使用的抗生素类药物易破坏口腔微生物生态平衡且机体容易产生耐药性，抑制菌斑沉积使用的碘酚腐蚀性较强，有强大的杀菌力，容易灼伤牙周黏膜。新技术则需使用成本极高的设备，很难大范围推广应用。
口臭又称为口腔异味，是指从口腔里呼出的气体较难闻，其发生与口腔菌群失衡有关。口腔厌氧菌如具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌等将食物残屑和脱落上皮中的蛋白分解产生挥发性硫化物，直接产生口臭。目前，主要通过清洁牙周、舌体等口腔环境，使用抗菌剂洗必泰、西吡氯铵等来治疗口臭，在短期内有效，但停止治疗后，致臭菌很有可能将重新在口腔内定植、增殖甚至成为口腔优势菌群，故口臭复发率较高。化学抗菌剂还有刺激口腔黏膜，使牙齿着色等副作用，长期使用会造成菌群失调，直接诱发细菌的生产选择压力，造成致臭菌的耐药性，长期疗效较差。
龋齿、牙周病、口臭均与口腔微生态有关，因此，调节口腔微生态可作为预防或治疗口腔疾病的方法。唾液链球菌(Streptococcus salivarius) K12为用于口腔的一种商业益生菌，分离自新西兰一名健康儿童的唾液并且已显示其对涉及口臭病因学的多种致病菌表现出体外抑菌活性(Burton JP等，“Preliminary study of the effect of probioticStreptococcus salivarius K12 on oral malodor parameters(益生菌唾液链球菌K12对口腔恶臭参数的作用的初步研究)”. J Appl Microbiol, 2006,第100卷,第754-764页)。然而，此菌株的有益作用受限于口臭症状的改善，并不能对口腔致病菌变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌有较强的抑制作用。专利CN117427022A将约翰逊氏乳杆菌用于复配菌株漱口水中，能够抑制牙周炎大鼠牙龈卟啉单胞菌的生长。专利CN109045071A将约翰逊氏乳杆菌用于复合益生菌中，所述产品能减轻口臭。
尽管已知口腔疾病与口腔微生态有密切的联系，但目前市场上针对口腔健康的微生态产品仍相对较少。开发针对口腔健康的益生菌，提供更丰富的益生菌解决方案，仍是口腔健康领域未被满足的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足，提供一种具有改善口腔健康功能的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）解决方案。
首先，本发明提供了一种约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物，所述菌株是保藏编号为CCTCC NO: M 2024403的Ljohn-2菌株。
本发明还提供了前述约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物的培养方法，包括将所述约翰逊氏乳杆菌接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的约翰逊氏乳杆菌。
其次，本发明还提供了一种食品组合物、日用品组合物、保健品组合物或药物组合物，其含有前述的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物，或含有前述的培养方法得到的约翰逊氏乳杆菌。
在一些具体实施方案中，前述组合物中还含有唾液联合乳杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌等中的一种或多种。所述多种包括两种、三种、四种或五种。
在一些具体实施方案中，前述组合物中，所述约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物作为唯一活性成分。
在一些具体实施方案中，所述组合物的单个制剂中含有106~1012 CFU的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株。
最后，本发明还提供了前述约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物，或含有前述的培养方法得到的约翰逊氏乳杆菌在制备改善口腔健康的食品、日用品、保健品或药品中的用途。
在一些具体实施方案中，所述约翰逊氏乳杆菌用于预防、改善或减缓龋齿、牙周病和口臭。
在一些具体实施方案中，所述约翰逊氏乳杆菌通过抑制口腔病原菌、与口腔病原菌共凝集和抗炎来预防、改善或减缓龋齿、牙周病和口臭。
在一些具体实施方案中，前述约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物，或含有前述的培养方法得到的约翰逊氏乳杆菌用于制备口香糖、咀嚼软糖、含漱液、牙膏、口喷剂或含片等。
变异链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌是常见的引起龋齿、牙周病和口臭的病原菌，本发明的约翰逊氏乳杆菌对这些常见的口腔致病菌具有较好的抑制作用，能与这些致病菌发生共凝集，且具有抗炎作用，因此有助于预防、改善或减缓龋齿、牙周病和口臭，改善口腔健康。
本发明所述的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物包括活菌和/或灭活形式。
微生物保藏信息
菌株名称：约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）Ljohn-2
保藏日期：2024年03月06日
鉴定存活日期：2024年03月13日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC），地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052
保藏编号：CCTCC NO: M 2024403。
附图说明
图1是约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2对3种常见口腔致病菌的抑制结果，*表示抑菌能力显著高于K12；$表示抑菌能力显著高于标准菌株。
图2是约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2与3种常见口腔致病菌的共凝集结果，*表示共凝集能力显著高于K12；$表示共凝集能力显著高于标准菌株。
图3是约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2抑制体外细胞炎症的结果，*表示抗炎作用显著优于模型组；#表示抗炎作用显著优于K12。
图4是约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2对Hep-2细胞的黏附能力检测结果，*表示黏附作用显著优于LGG；#表示黏附作用显著优于K12。
具体实施方式
本发明所请求保护的特定保藏编号的菌株，其涵义包括但不限于：
（1）存放于所述保藏中心的特定保藏号的菌株；
（2）与（1）所述菌株具有相同基因组的菌株；
（3）基于前述（1）或（2）的没有突变的传代菌株；
（4）基于前述（1）、（2）或（3）的在传代中积累微小突变的，但毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株；
（5）基于前述（1）-（4）任一所述菌株的活菌、灭活形式、裂解物或发酵产物等。
如本领域所知，菌株经传代应用不可避免会引入微小突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响菌株毒性、免疫原性与生物活性的突变（比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响毒性、免疫原性与生物活性的微小突变的残基），可以合理预期，当这些微小变化没有明显影响后代毒株的毒性、免疫原性与生物活性的情况下，仍然能实现本发明的目的，且其源于本发明贡献的菌株，因此仍在本发明的实质技术贡献范围内。这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为毒性、免疫原性与生物活性没有变化的突变菌株。
毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化，包括担不限于，在检测灵敏度、检测限等检测技术的局限性和可接受或不可避免误差的范围内视为毒性、免疫原性与生物活性是相同的。用细胞、动物等测定菌株后代的毒性、免疫原性与生物活性，由于细胞品系、动物品种、年龄、性别、健康状况、培养条件等体现的差别以及可预期或不可避免的系统误差属于没有实质性变化。
本发明所述的组合物含有活性成分约翰逊氏乳杆菌，以及其他成分，比如不具有生理功效的辅料成分，并可选地含有其他功效性成分。
功效性成分包括但不限于其他功效菌株、活性化合物成分、活性生物成分、活性中药成分、益生元成分、后生元成分等。
本发明的组合物可以用于食品、日用品、保健品或药品等。并根据应用领域选用适宜的辅料和添加剂。
食品根据口腔领域的使用习惯可制备成口香糖、咀嚼软糖、饼干、含片等。
日用品可制备成含漱液、牙膏、口喷剂、凝胶等。
对于保健品和药品，辅料成分包括保健品可用的载体或药物载体和赋型剂。保健品或药品中可接受的载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。可包括溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版MackPrinting Company,1990,第1289-1329页）。除非常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于组合物中。载体可经选择以使受试者的不利副作用降至最低和/或使活性成分的失活降至最低。
赋型剂是指添加至药物组合物中以使药物具有一定形状或一定浓度的物质。例如无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇（诸如聚乙二醇）、植物油或氢化萘、碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖、各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶等。
本发明所述的保健品和药品可以制备成任一种便于使用的形式，例如常见的粉剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、胶囊或液体剂。
本发明所述的菌株以能发挥功效的含量（治疗有效量）和频率给予使用对象，推荐单次使用剂量中含有102~1015 CFU、103~1014 CFU、104~1013 CFU、105~1012 CFU、106~1012 CFU、107~1011 CFU、108~1010 CFU、或108~1010 CFU的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）。在一些文献中，约翰逊氏乳杆菌也被称为约氏乳杆菌。
本发明中的特定温度参数，如无特殊说明，应理解为恒温处理，并允许在一定温度区间内存在变动。如在±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。
以下实施例中所用到的培养基配制方法如下，未特殊说明的可以通过商业购买获得，或者按本领域常用方法制得：
YCFA液体培养基的配制：称取酪蛋白10.0 g，酵母提取物2.5 g，MgSO4·7H2O 0.45mL（10%的母液），10 mg/mL的CaCl2 溶液0.45 mL，TE141 10 mL，K2HPO4 0.45 g，KH2PO4 0.45g，NaCl 0.90 g，溶解于适量的蒸馏水中，加热煮沸后停止加热。培养基冷却过程中，先分批次向3.2 mL的VFA-mix中添加NaOH调节pH至中性，待培养基冷却至室温后添加到培养基中，随后添加一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，0.1% 刃天青1 mL搅拌均匀，NaOH调节pH至中性二次加热煮沸后，维持微沸状态20 min左右停止加热，N2置换降温并分装，121 ℃高温湿热灭菌30 min。
TE141的配制：称取次氮基三乙酸1.50 g加入到200 mL纯水中，加入适量NaOH至溶液变澄清，之后加水800 mL，用50% HCl调节pH值至5.5，之后依次称取MgSO4·7H2O 3.00 g，MnSO4·H2O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO4·7H2O 0.10 g，CoSO4·7H2O 0.18 g，CaCl2·2H2O0.10 g，ZnSO4·7H2O 0.18 g，CuSO4·5H2O 0.006 g，KAl(SO4)2·12H2O 0.02 g，H3BO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，NiCl2·6H2O 0.03 g，10 mg/mL的Na2SeO3·5H2O溶液 0.03 mL，10mg/mL的Na2WO4·2H2O溶液 0.03 mL加入上述试液中，加入过程中不断搅拌，保持溶液澄清，备用。
VFA-mix的配制：量取乙酸90 mL，丙酸30 mL，正戊酸10 mL，异丁酸10 mL，丁酸10mL混匀备用，使用前用5 M 浓度 NaOH溶液调至pH为中性。
无氧三混液体培养基（BHI+MRS+改良GAM）的配制：称取BHI肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8297-5）19.25 g，MRS肉汤粉末（广东环凯生物科技有限公司，027312）13.5 g，改良 GAM肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8518-3）15 g ，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧并分装，121℃高温湿热灭菌30 min。
无氧三混固体培养基（BHI+MRS+改良GAM）的配制：在无氧三混液体培养基（BHI+MRS+改良GAM）的基础上再加入琼脂粉12 g，其他步骤和组成相同。
无氧PBS的配制：称取磷酸二氢钾0.27 g，磷酸氢二钠1.42 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，溶解于1 L的蒸馏水中，煮沸后加入一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g。打开亨盖特装置，使培养基在N2保护下再次煮沸，吹气20 min后，分装至已通N2除氧的厌氧瓶中。加盖塞子并贴好标签纸，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放，备用。
0.1%吐温80-PBS稀释液制备：称取十二水磷酸氢二钠3.58 g，磷酸二氢钾0.27 g，氯化钠8 g，吸取吐温80 1ml，加入沸水1 L，用玻璃棒胶棒溶解。煮沸后加入一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g。打开亨盖特装置，使培养基在N2保护下再次煮沸，吹气20 min后，分装至已通N2除氧的厌氧瓶中。加盖塞子并贴好标签纸，121℃高温灭菌15 min。
实施例1：菌株的分离与鉴定
采集健康志愿者的新鲜粪便样本，加入适量无氧PBS重悬，震荡，过滤弃上清。在N2保护下，将样本进行梯度稀释后用YCFA液体培养基厌氧培养7天。培养好的菌株经MALDI-TOF质谱检测去重后再进行16S rDNA基因扩增并测序（北京擎科生物科技有限公司成都分公司）鉴定。对测序结果进行BLAST对比，最终确定该菌株为约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii），并命名为Ljohn-2。
取约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2划线至无氧三混固体培养基培养，其菌落形态呈乳白色半透明状圆形菌落，表面光滑并凸起、边缘不规则。该菌株已于2024年03月06日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，武汉大学保藏中心），保藏号为：CCTCC NO: M 2024403。
实施例2：全基因组分析
将Ljohn-2接种至无氧三混液体培养基中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA进行全基因组测序。对下机数据进行质控后用常规方法组装及注释，将所得蛋白序列与VFDB（Virulence Factor Databases）及CARD（The Comprehensive AntibioticResistance Database）数据库进行比对，开展毒力因子及耐药基因分析。结果显示，该菌不具有毒力因子，无可移动耐药基因，基因组层面安全。
用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）和基于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的Variant分析进行菌株的新颖性分析。在Genbank中进行搜索，找到了307个已公开的Lactobacillus johnsonii相关全基因组，通过fastANI（v1 .33）、snippy （v4.6.0）比较发现，与Ljohn-2全基因组最相近的菌株(Genomeassembly Name:ASM886855v1)ANI为99.42%，可判定Ljohn-2为新菌株。
实施例3：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2对口腔致病菌的抑制能力
选取常见的口腔致病菌进行抑菌能力检测，致病菌株来源信息如下所示。
表1 致病菌株来源信息
| 菌株名称 | 菌株保藏号 | 菌株保藏单位 |
| 变异链球菌 | ATCC 25175 | 河南省工业微生物菌种工程技术研究中心 |
| 具核梭杆菌具核亚种 | ATCC 25586 | 河南省工业微生物菌种工程技术研究中心 |
| 牙龈卟啉单胞菌 | ATCC 33277 | 河南省工业微生物菌种工程技术研究中心 |
菌株培养物制备：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2、唾液链球菌K12（分离自产品Bactoblis®，货号为0110103）、约翰逊氏乳杆菌标准菌株CCAM112（购自中国厌氧微生物资源保藏管理中心）经活化后均按照4%（体积比）的接种量接种于无氧三混培养基中，于37℃厌氧培养48 h，将培养物高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后，用0.22μm滤头过滤，用无氧三混液体培养基稀释5倍，获得灭活培养物。
致病菌制备：变异链球菌、具核梭杆菌具核亚种经无氧三混液体培养基活化，牙龈卟啉单胞菌经添加氯化血红素（0.05μg/mL，青岛海博生物技术有限公司，货号为HB0310a）和维生素K（1μg/mL，青岛海博生物技术有限公司，货号为HB0310b）的无氧三混液体培养基活化后，于对应培养基中稀释达到合适浓度。
与致病菌共培养：实验组分别取0.1mL灭活培养物和0.1mL致病菌置于96孔板，设置3组平行；致病菌阳性对照组取0.1mL无氧三混液体培养基和0.1mL致病菌置于96孔板，设置3组平行，厌氧培养24h，检测培养0 h、24 h的OD600。
数据处理：计算抑菌率（R），公式为R=(1−ΔOD1/ΔOD0) × 100%，其中ΔOD1为实验组培养24 h前后OD600的变化，ΔOD0为致病菌阳性对照组培养24 h前后OD600的变化。结果以抑菌率的Mean ± SD表示，采用One-way ANOVA进行比较分析。将Ljohn-2的抑菌能力与商业菌株K12和标准菌株CCAM112的抑菌能力进行比较。
实验结果：如图1所示，Ljohn-2对变异链球菌、具核梭杆菌具核亚种、牙龈卟啉单胞菌均有抑菌能力，对变异链球菌、具核梭杆菌具核亚种、牙龈卟啉单胞菌的抑菌能力显著强于商业菌株K12，对牙龈卟啉单胞菌的抑菌能力显著强于标准菌株CCAM112。
实施例4：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2与口腔致病菌的共凝集能力测定
选取常见的口腔致病菌进行共凝集能力检测，致病菌株来源信息如表1。
菌株活化：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2、唾液链球菌K12、约翰逊氏乳杆菌标准菌株CCAM112、变异链球菌、具核梭杆菌具核亚种经活化后接种于无氧三混液体培养基中，于37℃厌氧培养24 h。牙龈卟啉单胞菌经添加氯化血红素（0.05μg/mL，青岛海博生物技术有限公司，货号为HB0310a）和维生素K（1μg/mL，青岛海博生物技术有限公司，货号为HB0310b）的无氧三混液体培养基活化并接种培养，于37℃厌氧培养24 h。
样品制备：将培养后的菌液以8000RPM离心5min，无氧PBS将其重悬。重复操作两次，最终以等体积无氧PBS将菌体重悬。
共凝集：用无氧PBS将重悬菌液OD600调整为0.5±0.1，将致病菌分别与Ljohn-2、K12、标准菌株CCAM112等量混匀，每组设置3个平行，37℃静置孵育18h，测量0h、18h的OD600。
数据处理：共凝集率（%）=[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/[(Ax+Ay)/2]×100%，其中Ax代表Ljohn-2、K12、标准菌株CCAM112 0 h的OD600，Ay代表致病菌0 h的OD600，A(x+y)代表18 h后的OD600。结果以共凝集率的Mean ± SD表示，采用One-way ANOVA进行比较分析。
实验结果：如图2所示，Ljohn-2与变异链球菌、具核梭杆菌具核亚种、牙龈卟啉单胞菌均有共凝集能力，且对具核梭杆菌具核亚种、牙龈卟啉单胞菌的共凝集能力显著强于商业菌株K12和标准菌株CCAM112。
实施例5：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2溶菌酶耐受性测定
将Ljohn-2、K12接种至无氧三混液体培养基中，培养至对数生长后期。按照5%接种量（体积比）将菌转接至含1mg/mL溶菌酶（北京索莱宝科技有限公司，货号L8120）的无氧三混液体培养基中，并将菌株转接至不含溶菌酶的无氧三混液体培养基作为对照，每组设置3个平行，37℃厌氧孵育24h。分别取孵育后菌悬液适量，以无氧PBS进行10倍梯度稀释。取适宜梯度菌悬液与溶解的无氧三混固体培养基混匀，37℃厌氧培养至单菌落长出后计数。存活率=含溶菌酶培养基活菌数/不含溶菌酶培养基活菌数*100%，结果以3组平行的存活率的平均数表示。
实验结果：Ljohn-2、K12在1mg/mL溶菌酶中的存活率分别为51.20%、52.00%，Ljohn-2对溶菌酶的耐受程度与K12相当。
实施例6：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2的体外细胞炎症抑制试验
THP-1细胞极化：使用含10%FBS（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，16000-044）和终浓度为100ng/mL PMA (佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，phorbol 12-myristate1 3-acetate，Sigma-Aldrich Company，P1585) 的RPMI-1640（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，C11875500BT）培养基，以1×105 个细胞/孔的接种密度将THP-1细胞接种于96孔板中，置于5% CO2培养箱，37℃培养24 h使其极化成为成熟巨噬细胞。
菌株及培养物样品制备：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2、唾液链球菌K12、约翰逊氏乳杆菌标准菌株CCAM112（购自中国厌氧微生物资源保藏管理中心）经活化后接种于无氧三混液体培养基中，于37℃厌氧培养48 h。配制含10% FBS、终浓度为100 ng/mL LPS（Sigma-Aldrich Company, L3024）和20 ng/mL IFN-γ（PeproTech，AF-300-02）的RPMI-1640培养基作为预混液进行炎症刺激。取1 mL菌液，5000 rpm/min，离心15 min，收集菌体，用无菌PBS（武汉博士德生物工程有限公司，PYG0021）洗涤2次，使用上述预混液进行重悬，将菌体稀释10倍，获得活菌样品。将其余培养物高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后，用0.22μm滤头过滤，使用上述预混液稀释10倍，获得灭活培养物样品。
约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2对THP-1细胞表达IL-6的影响：本实验分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组-地塞米松、K12活菌组、K12灭活培养物组、CCAM112活菌组、CCAM112灭活培养物组、约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2活菌组、约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2灭活培养物组共9组。THP-1极化为成熟巨噬细胞后，正常对照组更换含10% FBS的RPMI-1640培养基；模型对照组更换上述配制的含10% FBS、终浓度为100 ng/mL LPS（Sigma-AldrichCompany, L3024）和20 ng/mL IFN-γ（PeproTech，AF-300-02）的RPMI-1640培养基预混液进行炎症刺激。阳性对照组-地塞米松更换含终浓度为25 μg/mL地塞米松（购于Sigma-Aldrich Company，D4902-25）的上述预混液，其余各组均更换前期配制的活菌样品或灭活培养物样品，将细胞培养板置于5% CO2培养箱中，37℃培养36 h后，各组分别吸取160μL细胞培养液，4℃，1000rpm/min，离心20 min，收集上清液，使用Human IL-6 (Interleukin 6)ELISA试剂盒（购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-H6156) 检测IL-6含量，本实验设置3个平行对照组，结果以Mean±SD表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析，*，表示与模型组比较，p<0.05；**，表示与模型组比较，p<0.01；***，表示与模型组比较，p<0.001；#，表示与K12比较，p<0.05。
实验结果：如图3所示，模型对照组细胞上清液中IL-6的表达显著高于正常对照组（P<0.001）；阳性对照组-地塞米松能够显著抑制THP-1细胞中促炎因子IL-6的表达（P<0.001）；与模型对照组相比，约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2灭活培养物与活菌均能够显著降低促炎因子IL-6的表达（P<0.01），其灭活培养物抗炎作用优于K12，表明约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2灭活培养物与活菌均在体外具有一定的抗炎作用。
实施例7：约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2的体外细胞黏附试验
菌株培养：从菌保管中分别接种约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2、唾液链球菌K12、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）GG（LGG，CICC 6141，中国工业微生物菌种保藏管理中心）菌液200 μL至5 mL无氧三混液体培养基中，37℃厌氧培养至对数生长后期。将培养后菌液以无菌PBS（武汉博士德生物工程有限公司，PYG0021）离心洗涤2次，使用含10% FBS（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，SH30084.03）的MEM（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，10370-021）培养基将菌株稀释为5×108 CFU/mL，待用。
分别取100 μL稀释后菌悬液加入含Hep-2细胞的96孔细胞培养板。加样完毕后，96孔细胞培养板置于水平离心机中，1000 g 离心1min，设置孵育时间为3 h，孵育至规定时间后，用无菌PBS洗涤2次，洗去未黏附菌株，洗涤后每孔加入50 μL胰酶细胞消化液（兰杰柯科技有限公司，BL501A），置于37℃培养箱消化细胞，待Hep-2细胞消化变成球状后，每孔加入150 μL含10%FBS的MEM培养基，反复吹打约1 min，待显微镜检确定细胞和菌株消化分离后，吸取20 μL上述混合液用0.1%吐温80-PBS在96孔板依次进行10倍梯度稀释，选择合适稀释梯度倾注已溶解的无氧三混固体培养基，37℃培养48 h后计数，本实验设置3个平行对照组，结果以Mean±SD表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析， ***，表示与LGG比较，p<0.001；###，表示与K12比较，p<0.001。
结果如图4所示，黏附Hep-2细胞3h后，约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2黏附率显著高于LGG及K12，约翰逊氏乳杆菌Ljohn-2具有较好的黏附能力，有利于菌株在口腔定殖。
Claims (10)
1.一种约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物，所述菌株为保藏编号为CCTCC NO: M 2024403的Ljohn-2菌株。
2.权利要求1所述的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物的培养方法，包括将所述约翰逊氏乳杆菌接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的约翰逊氏乳杆菌。
3.一种食品组合物、日用品组合物、保健品组合物或药物组合物，其活性成分含有权利要求1所述的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物，或含有权利要求2所述的培养方法得到的约翰逊氏乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的食品组合物、日用品组合物、保健品组合物或药物组合物，其特征在于，还含有唾液联合乳杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的食品组合物、日用品组合物、保健品组合物或药物组合物，其特征在于，所述约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物作为唯一活性成分。
6.根据权利要求3所述的食品组合物、日用品组合物、保健品组合物或药物组合物，其特征在于，所述组合物的单个制剂中含有106~1012 CFU的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株。
7.根据权利要求3所述的食品组合物、日用品组合物、保健品组合物或药物组合物，其特征在于，将所述约翰逊氏乳杆菌制备成口香糖、咀嚼软糖、含漱液、牙膏、口喷剂或含片。
8.权利要求1所述的约翰逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）菌株或其纯培养物，或权利要求2所述的培养方法得到的约翰逊氏乳杆菌在制备改善口腔健康的日用品、保健品或药品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述改善口腔健康是指预防、改善或减缓龋齿、牙周病和口臭。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述约翰逊氏乳杆菌通过抑制口腔病原菌、与口腔病原菌共凝集和抗炎来预防、改善或减缓龋齿、牙周病和口臭。
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