CN114606164B - 一株副干酪乳杆菌Probio-01及其制备益生菌口腔制剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物益生菌剂技术领域，具体涉及一株副干酪乳杆菌Probio‑01，并进一步公开其制备益生菌口腔制剂的用途，特别涉及所述副干酪乳杆菌Probio‑01在调节口腔菌群平衡和缓解牙龈炎症中的应用。本发明筛选并保藏的所述副干酪乳杆菌Probio‑01，经体外抑菌试验、动物模型试验和临床人群试验的验证，具有调节口腔菌群平衡和治疗及改善牙龈炎症的功效。本发明所述副干酪乳杆菌Probio‑01灭活菌体及其代谢物，可显著改变牙菌斑菌群丰富度和多样性，调节牙菌斑菌群结构，进而有效改善牙龈炎患者牙菌斑菌群的紊乱状态，在制备预防和/或治疗牙龈炎症的产品中，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物益生菌剂技术领域，具体涉及一株副干酪乳杆菌Probio-01，并进一步公开其制备益生菌口腔制剂的用途，特别涉及所述副干酪乳杆菌Probio-01在调节口腔菌群平衡和缓解牙龈炎症中的应用。
背景技术
随着我国居民生活质量的提高，口腔健康已成为备受关注的公共健康问题。长期以来，一些口腔常见疾病，如龋齿、牙周病及粘膜病等发病率逐年上升，而口腔致病菌则是引起这些疾病的关键性因素。口腔是一个多菌群共生的动态平衡微生物环境，在口腔定植的微生物种类复杂，包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等，这些微生物在口腔不同部位共栖竞争和拮抗，构成口腔微生态系。随着医疗技术的发展，人们已意识到口腔问题的根本原因在于有害菌在口腔中的大量繁殖导致口腔微生物菌群的失衡。目前研究证实，口腔内己知细菌种类多达700余种，口腔中微生物之间、微生物与宿主口腔组织之间，只有保持良好的生态平衡，口腔才能保持健康状态。如果外来微生物或由于其他因素影响，导致口腔微生态中固有的个别或几种微生物比例明显增高成为定植部位的优势菌，特别是致病菌的比例增高，会使得原有的口腔微生态平衡被打破，将会出现菌群失调，进而导致口腔疾病；反之，口腔疾病也可以导致菌群失调。可见，宿主口腔的微生态状况与口腔的健康和疾病有着密切关系，只有健康、平衡的菌群环境，才使得口腔以及全身才得以保持健康。
“益生菌”一词最早起源于希腊语，即“对生命有益(for life)”。目前，益生菌多指食用后可改善宿主肠道菌群生态平衡，提高宿主健康水平的活菌制剂。近年来的研究表明，益生菌的无生命菌体和/或其代谢产物同样能够对人体健康发挥作用，并且其相应的功能物质基础也逐渐被识别。益生菌菌体及其代谢产物的主要成分包括磷壁酸、肽聚糖、有机酸、细菌素、胞外多糖和神经递质类物质等，并且不同组分的益生功能不尽相同，目前研究最多的为乳酸杆菌和双歧杆菌的菌体及其代谢产物。
由于益生菌菌体及其代谢产物具有化学结构明确、保质期长、安全性更高和稳定性更强等优势，因而对胃肠道生理环境和生产加工条件具有更强的耐受力和包容性，在食品和医学等领域具有较好的应用前景，有望成为未来微生物领域研究的新方向和热点。一直以来，在口腔清洁护理用品中，抑制口腔致病菌多采用添加化学抑菌剂的方式实现。但抑菌剂的长期使用会使得口腔菌群失调，导致更加严重的口腔问题和口腔疾病。益生菌和/或其代谢产物可以平衡口腔菌群，特别是其抑菌成分可以抑制致病微生物，其菌体表面成分可以作为抗原刺激机体，促进免疫耐受的形成，在预防龋齿、牙周病、牙龈炎症等方面会产生显著的效果。口腔制剂中添加益生菌，可充分发挥益生菌的作用，通过温和改变口腔微生态结构，使得口腔菌群分布向着更加平衡合理的状态转变，进而预防和改善口腔生理状态，减少疾病的发生。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有调节口腔菌群结构平衡及治疗、缓解或改善口腔炎症功效的副干酪乳杆菌；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述副干酪乳杆菌Probio-01及其灭活物、代谢物用于制备益生菌制剂尤其是口腔益生菌制剂的用途。
为解决上述技术问题，本发明所述的一株副干酪乳杆菌Probio-01，其分类命名为lactobacillus paracaseiProbio-01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18636，保藏日期为2019年10月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还公开了所述的副干酪乳杆菌Probio-01及其灭活物、代谢物用于制备益生菌制剂的用途。
在本发明方案中，所述灭活物包括但不限于灭活的菌体、发酵产物、培养物等经常规灭活处理的物质，所述代谢物包括但不限于经培养、发酵、代谢、提取所得物质。
进一步的，所述益生菌制剂包括口腔益生菌制剂。
本发明还公开了一种益生菌制剂，所述益生菌制剂的活性成分包括所述的副干酪乳杆菌Probio-01的灭活物和/或代谢物。
具体的，所述益生菌制剂在液体、半固体和固体中的任何状态均可发挥健康作用，其剂型包括散剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、膏剂、液体制剂、凝胶剂、喷雾剂或固体饮料中的至少一种。
本发明还公开了一种制备所述益生菌制剂的方法，包括将所述副干酪乳杆菌Probio-01进行菌体培养的步骤，以及按照常规工艺、添加常规辅料进行选定剂型加工的步骤。
前述“常规工艺”包括但不限于传统的工艺手段，诸如压片、分散、造粒等本领域常规的制剂手段；前述“常规辅料”包括但不限于本领域已知的辅料载体、赋形剂、佐剂、粘合剂、溶剂等种类及原料成分。
本发明还公开了所述的副干酪乳杆菌Probio-01及其灭活物、代谢物或者所述益生菌制剂用于制备具有如下(1)-(4)中至少一项功效的口腔功能性产品的用途：
(1)调节口腔菌群结构平衡的益生菌口腔制剂；
(2)治疗、缓解或改善口腔炎症功效的益生菌口腔制剂；
(3)抑制口腔致病菌的益生菌口腔制剂；
(4)增加口腔有益微生物的益生菌口腔制剂。
具体的，所述口腔功能性产品包括口腔护理产品、功能性药物、功能性食品、保健品或功能性辅助材料，包括但不限于常规的牙膏、漱口水、咀嚼片、洁口片、凝胶、口腔清新剂、口含片、口腔炎喷雾剂、固体饮料等。
具体的，所述口腔炎症包括牙龈炎症。
具体的，所述口腔致病菌包括变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和/或具核梭杆菌。
本发明还公开了所述副干酪乳杆菌Probio-01用于制备口腔致病菌拮抗剂的用途，尤其是变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和/或具核梭杆菌的抑制剂之用。
具体的，所述口腔功能性产品中，所述副干酪乳杆菌Probio-01的有效菌体数量为不少于1×108个/日。
本发明筛选并保藏的所述副干酪乳杆菌Probio-01，经体外抑菌试验、动物模型试验和临床人群试验的验证，具有调节口腔菌群平衡和治疗及改善牙龈验证的功效。本发明所述副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物，可显著改变牙菌斑菌群丰富度和多样性，调节牙菌斑菌群结构，进而有效改善牙龈炎患者牙菌斑菌群的紊乱状态，在制备预防和/或治疗牙龈炎症的产品中，具有巨大的应用前景。
本发明还公开了含有所述副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物的益生菌口腔制剂，经临床实验证明，所述益生菌口腔制剂可改善牙龈炎患者的临床症状，显著降低牙龈指数(GI)、菌斑指数(PLI)和牙龈探诊出血指数(BOP)，该益生菌口腔制剂可以通过调节口腔菌群的组成有效改善口腔健康，从根本上缓解牙龈炎患者临床症状，是一种非常健康、安全、有效、值得保护的口腔健康方式。
本发明筛选并保藏的所述副干酪乳杆菌Probio-01，经体外抑菌实验，可显著降低口腔中有害微生物的相对丰度，显著增加口腔中有益微生物的相对丰度，对口腔致病菌尤其是变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和/或具核梭杆菌具有较高的抑制作用，可有效调节口腔菌群的平衡，保护口腔健康。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为副干酪乳杆菌Probio-01对口腔常见致病菌的抑制作用结果；
图2为副干酪乳杆菌Probio-01(P-A)组小鼠口腔菌群α-多样性相关指数分析；
图3为副干酪乳杆菌Probio-01(P-A)组小鼠口腔菌群α-多样性相关曲线分析；
图4为副干酪乳杆菌Probio-01(P-A)组小鼠唾液微生物β-多样性分析；
图5为牙龈炎炎症临床指标变化分析；
图6为牙菌斑菌群的丰富度和多样性差异分析；
图7为牙菌斑菌群结构变化分析；
图8为牙菌斑菌群中优势菌群差异分析；
图9为牙龈炎炎症临床指标与优势菌群的相关性分析；
图10为牙龈炎炎症相关菌属的相对丰度变化分析。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明如下实施例及实验例中，保藏株副干酪乳杆菌Probio-01，已于2019年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.18636，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明保藏菌株副干酪乳杆菌Probio-01的菌体培养采用已知的培养方式即可，诸如菌体的活化及增值培养，采用已知的适宜的培养基/培养液即可，具体的培养条件参照本领域常规操作即可。
本发明如下实施例中使用的“副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末”的具体获得方法包括：取保存的副干酪乳杆菌Probio-01接种于无菌培养基(蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、K2HPO4 2g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g，定容至1L，121℃，15min条件下灭菌)中，在37℃恒温环境下发酵至pH4.60，经85℃、20min杀菌处理，浓缩、再经喷雾干燥或冷冻干燥处理后获得所述灭活菌体及其代谢物粉末，流式细胞仪检测菌体数量高于1×1011个/g时保存备用。
实施例1益生菌牙膏
本实施例所述益生菌牙膏为磷酸氢钙型牙膏，是以所述副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为0.8wt％)，配合通常牙膏制备原料而制成的牙膏产品。
所述益生菌牙膏的配方如下：磷酸氢钙40wt％、甘油12wt％、山梨醇18wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末0.8wt％、羧甲基纤维素钠1.2wt％、二氧化硅0.5wt％、焦磷酸钠0.5wt％、月桂醇硫酸酯钠1.5wt％、糖精钠0.2wt％、香精1.0wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
所述益生菌牙膏的制作方法包括：用甘油将羧甲基纤维素钠均匀分散后，吸入到真空制膏机中，再加山梨醇和部分去离子水使粘合剂膨胀胶溶，另取部分去离子水将焦磷酸钠、糖精钠溶解后，也吸入到真空制膏锅中，混匀，再分别加入二氧化硅、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末、磷酸氢钙、月桂醇硫酸酯钠，在真空状态下，充分脱气混匀，最后加入香精，再次在真空状态下，进行高速搅拌充分乳化混匀，即得磷酸氢钙型牙膏。
实施例2益生菌牙膏
本实施例所述益生菌牙膏为磷酸氢钙型牙膏，是以所述副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为1.5wt％)，配合通常牙膏制备原料而制成的牙膏产品。
所述益生菌牙膏的配方如下：磷酸氢钙43wt％、甘油8wt％、山梨醇23wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末1.5wt％、羧甲基纤维素钠0.7wt％、二氧化硅0.9wt％、焦磷酸钠0.2wt％、月桂醇硫酸酯钠2.3wt％、糖精钠0.15wt％、香精1.4wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
所述益生菌牙膏的制备方法同实施例1。
实施例3益生菌牙膏
本实施例所述益生菌牙膏为碳酸钙型牙膏是以所述副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为0.8％)，配合通常牙膏制备原料而制成的牙膏产品。
所述益生菌牙膏的配方如下：碳酸钙43wt％、山梨醇24wt％、甘油5wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末0.8wt％、羧甲基纤维素钠1.1wt％、月桂醇硫酸酯钠1.0wt％、糖精钠0.22wt％、薄荷香精1.0wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
所述益生菌牙膏的制备方法包括：先将山梨醇和甘油加入到真空制膏机中，再加入羧甲基纤维素钠充分混匀，然后加入大部分去离子水，再次混匀，在真空搅拌状态下，依次加入副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末、糖精钠(预先用水溶解)、碳酸钙、月桂醇硫酸酯钠，在真空状态下，吸入制膏机高速搅拌充分混匀，最后加入香精，再次在真空状态下，进行高速搅拌充分乳化混匀，即得碳酸钙型牙膏。
实施例4益生菌牙膏
本实施例所述益生菌牙膏为碳酸钙型牙膏是以所述副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为1.5wt％)，配合通常牙膏制备原料而制成的牙膏产品。
所述益生菌牙膏的配方如下：碳酸钙47wt％、山梨醇20wt％、甘油10wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末1.5wt％、羧甲基纤维素钠0.8wt％、月桂醇硫酸酯钠1.4wt％、糖精钠0.15wt％、薄荷香精1.3wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
所述益生菌牙膏的制备方法包括同实施例3。
实施例5益生菌漱口剂
本实施例所述漱口剂是以副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为0.8wt％)，配合通常漱口剂制备原料而制成的漱口剂产品。
本实施例所述益生菌漱口水的配方包括：甘油5wt％、聚氧乙烯氢化蓖麻油3wt％、糖精钠0.15wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末0.8wt％、苯甲酸钠0.05wt％、柠檬酸钠0.2wt％、香精0.8wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
本实施例所述益生菌漱口水的制备方法如下：将香精溶解于聚氧乙烯氢化蓖麻油中，加入甘油搅拌使溶解，再加入副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末、糖精钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠，及余量的去离子水溶解后过滤即可。
实施例6益生菌漱口剂
本实施例所述漱口剂是以副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为0.05wt％)，配合通常漱口剂制备原料而制成的漱口剂产品。
本实施例所述益生菌漱口水的配方包括：甘油10wt％、聚氧乙烯氢化蓖麻油4wt％、糖精钠0.2wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末0.05wt％、苯甲酸钠0.1wt％、柠檬酸钠0.1wt％、香精1.2wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
本实施例所述益生菌漱口水的制备方法同实施例5。
实施例7益生菌凝胶剂
本实施例所述凝胶剂是以副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为1.2wt％)，配合通常凝胶剂制备原料而制成的产品。
本实施例所述凝胶剂的配方如下：丙二醇2wt％、甘油8wt％、己二醇1wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末1.2wt％、卡波姆0.2wt％、黄原胶0.8wt％、透明质酸钠0.05wt％、精氨酸0.6wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
本实施例所述凝胶剂的制备方法如下：将丙二醇、甘油、己二醇混合均匀，将卡波姆、黄原胶、透明质酸粉末分别均匀分散于多元醇的混合液中，在1000r/min的搅拌速度下，缓慢加入1/2去离子水，加水完成后，再加入副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末，缓慢搅拌均匀后真空脱气，同时降低搅拌速度约为300r/min，加入事先溶解成溶液的精氨酸进行中和，再加入余量的去离子水，搅拌均匀即得凝胶剂。
实施例8益生菌凝胶剂
本实施例所述凝胶剂是以副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末为主要有效成分(添加量为0.5wt％)，配合通常凝胶剂制备原料而制成的产品。
本实施例所述凝胶剂配方如下：丙二醇5wt％、甘油3wt％、己二醇4wt％、副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物粉末0.5wt％、卡波姆0.6wt％、黄原胶0.3wt％、透明质酸钠0.2wt％、精氨酸0.3wt％、去离子水余量，以上均为重量百分比。
本实施例所述凝胶剂的制备方法同实施例7。
实验例
如下实验例结合功效验证试验对本发明提供的副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物对口腔致病菌的抑制及调节口腔菌群结构，进而有效改善牙龈炎患者口腔菌群的紊乱状态效果进行评价。
1、副干酪乳杆菌Probio-01对口腔常见致病菌的抑制作用
本实验例通过将副干酪乳杆菌Probio-01分别与变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和具核梭杆菌进行共培养，评价副干酪乳杆菌Probio-01对于口腔常见病原菌的抑制效果。
将上述致病菌以最适生长条件活化三代后依2％接种量接种到对应液体培养基中，加入副干酪乳杆菌Probio-01菌粉(灭活菌体及代谢产物，菌体数量＞109个·mL-1)，于37℃下共培养，并分别于15min、1h、3h、5h、8h和24h分别取样。采用平板倾注法统计活菌数，各致病菌所用培养基及培养条件具体如下表1所示，所述菌体的抑制率依照如下公式进行计算：
抑菌率＝(对照组菌数-实验组菌数)/对照组菌数×100％；
各实验组抑菌率计算结果如附图1所示，各组别从左至右依次为具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和变形链球菌的抑制率结果。
表1致病菌培养条件
如图1所示的结果，根据上述实验组共培养至15min、1h、3h、5h、8h、24h的活菌计数结果显示，副干酪乳杆菌Probio-01对选定的口腔致病菌(变异链球菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌)均有显著抑制作用(P<0.01)。
其中，致病菌变异链球菌与龋齿有关，经与所述副干酪乳杆菌Probio-01共培养15min时即可受到抑制，5h时抑制率高于50％，24h时抑制率高于90％；伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌均与牙周炎症相关，经与副干酪乳杆菌Probio-01共培养15min时，其存活率均显著下降(P＜0.05)，5h时抑制率高于50％，24h时抑制率均高于65％。
可见，本发明筛选的副干酪乳杆菌Probio-01可有效对抗口腔常见病原菌，降低有害菌相对丰度，在缓解口腔健康问题方面具有巨大的潜力。
2、益生菌对小鼠口腔微生态的影响
采用8周龄的SPF级雄性C57BL/6J小鼠，适应性喂养3天后，腹腔注射4％水合氯醛(0.1ml/10g)麻醉，在小鼠右上颌第二磨牙结扎丝线诱发口腔菌群紊乱模型。造模24小时后，将模型动物随机分组，每组动物10只，具体如下：
(1)正常对照组(Control)：进行麻醉但不结扎，给予超纯水，记为C组；
(2)模型对照组(Model)：进行麻醉并结扎，成功造模，给予超纯水，记为M组；
(3)益生菌样品组：进行麻醉并结扎，成功造模，给予含副干酪乳杆菌Probio-01的益生菌样品(含副干酪乳杆菌Probio-01菌体数8×108个/g)，记为P-A组。
上述各组分别采用间隔12小时以液体涂抹牙龈的方式给药，100μL/次，P-A组给予益生菌样品，C组和M组同步给予超纯水，连续给药15天，给药后30分钟内禁食禁水。末次药后12小时，用无菌的棉签擦拭每只小鼠口腔采集唾液样本。
所述副干酪乳杆菌Probio-01(P-A)组小鼠口腔菌群α-多样性相关指数分析结果及α-多样性相关曲线分析结果分别见附图2-3所示。由图2所示P-A组小鼠唾液微生物α-多样性结果可见，与模型组相比，实验组均具有显著差异(P＜0.01)。根据P-A组的稀释性曲线(图3中A)和Shannon指数曲线(图3中B)结果显示，实验组曲线随测序量增加而趋向平缓，各样本的OTU数量或多样性指数(Shannon index)并不会随测序量的增加而继续增加，表明本研究的所有样本序列充分，目前的测序量能覆盖样本中的绝大部分物种，数据可以用于分析。
所述副干酪乳杆菌Probio-01(P-A)组小鼠唾液微生物β-多样性结果如图4所示，图中各个点分别表示不同样品，不同颜色代表不同分组，点与点之间的距离表示差异程度，在坐标图上距离越近的样品，相似性越高。结果显示，对照组和模型组的样品点分别具有聚类现象，且不同组间的样品点距离较远，表明对照组和模型组小鼠的口腔菌群多样性存在差异。口内局部给予益生菌P-A后，其样品点趋于对照组和模型组之间，表明给益生菌P-A后在一定程度上能使模型组小鼠口腔微生物多样性趋向正常水平。
综上，本发明所述副干酪乳杆菌Probio-01(益生菌样品P-A)能有效调节口腔菌群紊乱状态。
3、益生菌牙膏临床人群试验
本实验例采用单中心、随机分组、双盲、平行对照的研究方法进行临床效果考察。为保证试验结果的可靠性，受试者均经过2周的洗脱期，洗脱期使用不含益生菌成分且其余成份与试验组牙膏完全相同的牙膏。将受试者进行分组，每组33人，具体如下：
(1)正常组：牙龈健康，使用除不含益生菌外，其余成分与试验组牙膏完全相同的牙膏，记为N组；
(2)空白对照组：患牙龈炎，使用除不含益生菌外，其余成分与试验组牙膏完全相同的牙膏，记为B组；
(3)试验F组：患牙龈炎，使用含有副干酪乳杆菌Probio-01的灭活菌体及其代谢产物成分的益生菌牙膏(实施例1益生菌牙膏)，记为F组；
每一组受试者均按照试验要求使用相应牙膏刷牙，每天2次。在受试者使用牙膏前(洗脱期后)、使用牙膏一个月后、三个月后分别采集口腔样本并收集临床数据。
临床数据统计结果
临床上通常采用牙龈指数(GI)、菌斑指数(PLI)、牙龈探诊出血指数(BOP)三种指标检测牙龈炎症临床症状的变化。其中，GI常用于观察牙龈状况，检查牙龈颜色和质的改变，指数越高，牙龈炎越重；PLI常用于评价口腔卫生状况和衡量牙周病防治效果，指数越高，牙齿表面菌斑量越多，面积越大；BOP表示用探针轻触牙龈沟检测是否有血出现，百分率越高，牙龈越易出血。图5为牙龈炎炎症临床指标变化分析结果，实验结果表明，使用益生菌牙膏可显著降低牙龈炎患者的GI值、PLI值和BOP值，有效缓解牙龈炎症问题。
口腔菌群变化分析结果
实验结束后，分别对3组受试者的口腔菌群进行分析，结果如图6-10所示。
如图6所示的牙菌斑菌群的丰富度和多样性差异分析结果显示，N组人群的口腔菌群丰富度和多样性显著增加，菌群结构出现明显的分离趋势；B组患者口腔菌群的丰富度和多样性呈先显著增加后恢复到基线水平的趋势，菌群的整体结构无显著性变化；F组患者使用益生菌牙膏后口腔菌群的丰富度和多样性显著增加，菌群结构无明显的分离趋势。实验结果表明，牙龈炎症会影响人体口腔菌群丰富度和多样性的变化，破坏口腔菌群的正常发展；使用益生菌牙膏(含副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物)可显著改变口腔菌群的丰富度和多样性，调节口腔菌群结构，对菌群的调节趋势与正常组相一致，可有效缓解牙龈炎患者口腔菌群的失衡。
如图7所示的牙菌斑菌群结构变化分析结果显示，在整个实验过程中，F组口腔菌群的丰富度和多样性与对照组相比均无显著差异；F组在使用益生菌牙膏前丰富度显著高于正常组，在使用1个月后显著性消失。结果表明，使用益生菌牙膏一个月即可显著缩小牙龈炎患者菌群结构与正常牙龈口腔菌群结构之间的差异，有效缓解牙龈炎患者口腔菌群的失衡。
如图8所示的牙菌斑菌群中优势菌群差异分析结果显示，经数据分析得到6个优势菌门和21个优势菌属。其中，0天时，Campylobacter,Capnocytophaga,Paludibacter,Veillonella的相对丰度与正常组具有显著差异，在使用益生菌牙膏后显著性消失；Leptotrichia，Rothia，Corynebacterium和Fusobacterium的相对丰度在使用益生菌牙膏后出现显著性差异。结果表明，使用益生菌牙膏可以改变部分优势菌属的相对丰度，进而有效调节牙龈炎患者口腔菌群结构组成，显著降低牙龈炎患者与牙龈正常人群口腔菌群组成之间的差异。
如图9所示的牙龈炎炎症临床指标与优势菌群的相关性分析结果显示，PLI值、BOP值和GI值与优势菌群之间呈现极显著的一致性(p<0.001)，且相关菌群与PLI值、BOP值和GI值之间呈现显著相关性(r>|0.6|，p<0.05)。罗斯氏菌属(Rothia)是一种口腔内常见的共生细菌，其代谢合成的肠杆菌素可有效改善口腔健康；梭菌属(Fusobacterium)是口腔中常见菌属，是导致牙周疾病的常见致病菌。
如图10所示的牙龈炎炎症相关菌属的相对丰度变化分析结果显示，使用益生菌牙膏一个月可显著增加Rothia的相对丰度，Rothia与PLI值、BOP值和GI值呈显著负相关，可有效减轻牙龈炎患者症状。使用益生菌牙膏一个月可显著降低Fusobacterium的相对丰度，Fusobacterium与PLI值、BOP值和GI值呈显著正相关，可有效减轻牙龈炎患者症状。结果表明，使用益生菌牙膏可通过调节口腔菌群的组成对抗牙龈炎症问题。
可见，本发明所述口腔益生菌制剂(含副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物)，可显著改变口腔菌群的丰富度和多样性，调节口腔菌群结构并使其趋于正常组，可有效缓解牙龈炎患者口腔菌群的失衡，进而减轻其临床症状。
综上，本发明所述含副干酪乳杆菌Probio-01灭活菌体及其代谢物的益生菌口腔制剂可显著改变口腔菌群的丰富度和多样性，通过调节口腔菌群的组成可有效改善牙龈炎患者口腔菌群的紊乱程度，从而有效缓解牙龈炎症。本发明通过体外抑菌试验、动物模型实验和临床实验表明对调节口腔菌群平衡和缓解牙龈炎症有效，为深入研究益生菌及代谢产物在其相关产品的开发和制备方面提供了一种全新的思路。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (5)
1.一株副干酪乳杆菌Probio-01，其特征在于，其分类命名为lactobacillusparacaseiProbio-01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18636，保藏日期为2019年10月8日。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌Probio-01用于制备具有如下(1)-(4)功能的口腔益生菌制剂或口腔护理产品的用途；
(1)调节口腔菌群结构平衡的益生菌口腔制剂；
(2)治疗、缓解或改善口腔炎症功效的益生菌口腔制剂；
(3)抑制口腔致病菌的益生菌口腔制剂；
(4)增加口腔有益微生物Rothia的相对丰度。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：
所述口腔炎症包括牙龈炎症；
所述口腔致病菌包括变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和/或具核梭杆菌。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述口腔益生菌制剂包括散剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、膏剂、液体制剂、凝胶剂或喷雾剂中的至少一种；
所述口腔护理产品包括牙膏、漱口剂、凝胶剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述口腔益生菌制剂或口腔护理产品中，所述副干酪乳杆菌Probio-01的有效菌体数量为不少于1×108个/日。
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