JP2015203030A - プロバイオティクス菌株を用いてヒアルロン酸の分泌を増強する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
分析するべき培地は、体積比4の95パーセントエタノールで3回洗浄され、非糖成分を沈殿させる。次にその上清を体積比1の水に再び溶解させ、さらに分析する。ヒアルロン酸の含有量は、カルバゾール法により測定される(BitterおよびMuir, 1962, Anαl Biochem. 4:330-334)。まず硫酸を用いてヒアルロン酸を不安定なヘキスロン酸へと加水分解する。ヘキスロン酸は、カルバゾール試薬と反応してピンク色に発色する。D−グルクロン酸を標準として用いる。その標準の0.25mL、試料およびブランクの溶液を氷の上の各管にそれぞれ加える。次に、0.95%の四ホウ酸ナトリウムを含む1.5mLの硫酸試薬をそれぞれの管にゆっくりと加え、よく混合する。次にそれらの管を移動させ、10分間沸騰水浴させる。室温まで冷却した後、50μLのカルバゾール試薬をそれぞれの管に添加する。次にもう一度すべての管を5分間沸騰水浴させ、室温まで冷却させる。それぞれの反応物の光学濃度が波長525nmで測定される。プロバイオティクス菌株1グラム当たりのヒアルロン酸含有量は、以下の式により計算される。
プロバイオティクス1グラム当たりのヒアルロン酸含有量=(Abs.−0.073)/0.006)×100)×2.07)/((20/100))
ここで略語および数値は以下のように表される。
Abs.=プロバイオティクスの吸光度
100=100倍希釈
2.07=変換係数
20/100=プロバイオティクス粉末の溶液に対する比
ストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121は、健康なヒトの母乳から単離される。新鮮な母乳試料の適切な希釈液をMRS−Cys寒天板上に広げ、lactobacilli spp. およびStreptococcus sppを単離する。これらの板を嫌気性の条件下に37℃で48時間インキュベートした。インキュベーションおよび計数の後、寒天板から5〜10個の単離物が選択された。それらの単離物は、各タイプのコロニー形態について少なくとも一つはそれを表すサンプルを含んでいた。それらの単離物を光学顕微鏡により観察し、それらの形態およびグラム染色を特定した。
(2.1 生化学的同定)
細菌を分類するためにグラム染色法を用いた。グラム染色法では、まず細菌検体をクリスタルバイオレットに染色し、次にヨウ素溶液で処理した後、アルコールで脱色し、そしてサフラニンで対比染色される。
同一の細菌種では、16S rDNA配列にはほとんど違いが無い。なぜなら、個別の微生物種はそれぞれ独自のDNA配列を有しているからである。したがって、本発明では、16S rDNAを細菌種の同定に用いる。
人工腸液(AIS)は、Hasjimら (Jovin Hasjim, Gautier Cesbron Lacau ら, Biomacromolecules 2010, 11, 3600-3608)により提案された処方に基づき、一部修正を加えながら作成される。この実施の形態では、人工腸液は消化酵素を含んでおり、その消化酵素は、8mg/mLのパンクレアチン、13U/mLのa−アミラーゼ、および1.12U/mLのアミログルコシダーゼを含み、それらが0.2Mの酢酸緩衝液(0.49mM MgCl2,200mM CaCl2,pH6.0)に添加されることにより人工腸液を構成する。次に滅菌化されたMRSブロスがAISに添加される。これにより、腸内の細菌成長用の栄養分としての一般的な食品摂取を模倣する。ストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121の播種は、人工腸管の環境を生むためにヒトの体温である37℃で行われる。細菌の成長とHAの生成を監視するために、培地はさまざまな時点で採取される。細胞培養液の成長は、従来の平板菌数測定法を用いて測定される。培養液は、さまざまな時点で採取され、希釈され、そしてコロニー計数のため、MRS寒天板へと移される。図1に示すように、AISにおけるストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121によるHA生成は、播種後、24時間で最高値に達し、コロニーの個数も同時に最大となる。図2に示すように、pHの減少は、酸を生成するプロバイオティクスの成長を示しており、そしてその成長は、AISにおける培養液から得られた平板菌数に基づき表される。
母乳から取られたストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121の皮膚、眼、および関節の健康状態、ならびに血中のHA含有量に及ぼす効能を評価する。
臨床治験が25歳〜40歳の8人の被検者(n=8)に対して行われた。これらの被検者には、28日間のあいだ、1日に二回(朝と夕方)、1カプセルあたり103CFUから1012CFUの投与量でストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121のカプセルが数個投与された。一方、コントロール群の3人の被検者たち(n=3)は、ストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121を含有しないカプセルを一日に数個経口摂取した。
臨床治験が25歳〜40歳の8人の被検者(n=8)に対して行われた。これらの被検者には、28日間のあいだ、1日に二回(朝と夕方)、1カプセルあたり103CFUから1012CFUの投与量でストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121のカプセルが数個投与された。
臨床治験が25歳〜40歳の5人の被検者(n=5)に対して行われた。これらの被検者には、7日間と28日間のあいだ、1日に二回(朝と夕方)、1カプセルあたり103CFUから1012CFUの投与量でストレプトコッカス・サーモフィラスDSM 28121のカプセルが数個投与された。
Claims (20)
- 被検者におけるヒアルロン酸の分泌を増強する方法であって、前記被検者にある用量のストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)DSM 28121を含む組成物を1日に二回投与することを有し、前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121の用量は103CFUから1012CFUである、方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121は母乳から単離される、請求項1に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121はプロバイオティクス菌株である、請求項1に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121は経口投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121は前記被検者の腸内において生存しコロニー形成することにより、その数を増大させる能力を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記被検者の血中ヒアルロン酸含有量が増大する、請求項1に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121は活性または不活性である、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、食料製品、健康食品サプリメント、医薬品またはスキンケア製品である、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物はストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121の代謝物をさらに有する、請求項8に記載の方法。
- 前記被検者における皮膚水和度が向上する、請求項1に記載の方法。
- 前記被検者におけるドライアイの症状が改善する、請求項1に記載の方法。
- 前記被検者における関節膨張、関節痛および硬直症の症状が改善する、請求項1に記載の方法。
- 被検者の血中ヒアルロン酸含有量を増強する方法であって、前記被検者にある用量のストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121を含む組成物を投与することを有し、
前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121の用量は103CFUから1012CFUである、方法。 - 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121は母乳から単離される、請求項13に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121はプロバイオティクス菌株である、請求項13に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121は前記被検者の腸内において生存しコロニー形成することにより、その数を増大させる能力を有する、請求項13に記載の方法。
- 前記ストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121は活性または不活性である、請求項13に記載の方法。
- 前記組成物は、食料製品、健康食品サプリメント、医薬品またはスキンケア製品である、請求項13に記載の方法。
- 前記組成物はストレプトコッカス・サーモフィラス DSM 28121の代謝物をさらに有する、請求項18に記載の方法。
- 単離されたプロバイオティクス菌株であるストレプトコッカス・サーモフィラスであって、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)に受入番号DSM 28121で委託された、プロバイオティクス菌株。
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