TWI824594B - 新穎嗜熱鏈球菌菌株及其益生菌組合物與用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種生產唾液酸及玻尿酸的新穎嗜熱鏈球菌菌株及其益生菌組合物與抗氧化、抗發炎、及減緩乾眼症的用途，本發明之新穎嗜熱鏈球菌及/或其代謝產物可以用於製備醫藥品、食品、保健品、及/或外用品。

Description

新穎嗜熱鏈球菌菌株及其益生菌組合物與用途
本發明係關於一種新穎嗜熱鏈球菌 ( Streptococcus thermophilus)菌株及其益生菌組合物與用途，尤其係關於一種生產唾液酸及/或玻尿酸的新穎嗜熱鏈球菌菌株及其益生菌組合物與抗氧化及抗發炎的用途。
燕窩在傳統上可用於抗老美顏、孕婦調理、及免疫調節，而燕窩中的主要功效成分為唾液酸 (sialic acid)，又名燕窩酸，是神經胺酸中胺基酸或羥基氫被取代之衍生物的總稱，唾液酸是組成黏液(mucus)、醣蛋白 (glycoproteins)、及神經節苷脂 (gangliosides)的重要成分，因此對細胞膜、細胞膜受體、及大腦的正常發育非常重要，其廣泛存在於動物組織中，尤其燕窩中還有較多量的唾液酸，唾液酸具有提高智力及記憶力、抗老年癡呆、抗病毒、提高腸道對維生素、礦物質的吸收、及免疫調節等生理作用。隨著對唾液酸生物活性的瞭解與可應用性提升，對唾液酸的需求也隨之增加，然而從燕窩中取得唾液酸不只費時，也容易因萃取方法使用非極性液體而存有工業汙染，因此改以從食源性物質例如牛奶或蛋黃中萃取唾液酸，但是此種方法的產率及純度都較低，無法有效應用於生產唾液酸。
玻尿酸 (hyaluronic acid, HA)屬於一種線性醣胺多醣 (glycosaminoglycan)，廣泛分布於動物的結締組織、上皮組織、及神經組織等處，例如皮膚、眼睛、及關節的濃度最高，且為細胞外基質的主要成分。玻尿酸具有傷口癒合、舒緩關節不適、及增加皮膚彈力與保濕等功效，而玻尿酸的含量會因年齡增加而逐漸減少，因此隨著年齡增加需要額外補充，才得以維持較佳的生理機能。過去玻尿酸的來源主要是以非食用之流行鏈球菌或雞冠進行萃取，然而文獻指出雞冠萃取的蛋白質含量高，可能會導致過敏反應的產生，而非食用之流行鏈球菌則需經完全滅菌與純化後才能使用於產品中，且並不具備益生菌的功能。
綜上所述，唾液酸與玻尿酸具有豐富的機能性，但是目前尚無安全且同時具備產生兩者的功能性產品。因此，找尋一源自於人體且可良好適應腸胃道環境且安全的新菌株，而可大量生產唾液酸與玻尿酸，又同時安全並可定殖於體內，以提升體內唾液酸與玻尿酸含量，達到美容與保健的用途，著實有其必要性。
為解決前述問題，本發明之一目的在提供一種生產唾液酸的嗜熱鏈球菌 ( Streptococcus thermophilus) iHA318菌株，其寄存編號係為BCRC 911114。
本發明又一目的在提供一種益生菌組合物，包含一嗜熱鏈球菌iHA318菌株及/或其代謝產物，其寄存編號係為BCRC 911114。
在本發明之較佳實施例中，該嗜熱鏈球菌iHA318菌株係使用一培養基進行培養，且該培養基的營養源係為小分子氮源，且較佳地該培養基的營養源係為尿素，更佳為0.4-0.6%尿素。
在本發明之較佳實施例中，該嗜熱鏈球菌iHA318菌株係為活菌或死菌。
本發明之又一目的在提供一種如前所述的益生菌組合物益生菌組合物用於生產唾液酸及/或玻尿酸的用途。
在本發明之較佳實施例中，該益生菌組合物係為一醫藥品、一營養補充品、一保健食品、一食品、一保養品、一外用品、或其任意組合。
本發明之又一目的在提供一種如前所述的益生菌組合物用於製備抗氧化及/或抗發炎之醫藥組成物的用途。
在本發明之較佳實施例中，該益生菌組合物係提升一神經細胞及/或一免疫細胞的抗氧化能力。
在本發明之較佳實施例中，該益生菌組合物係降低一免疫細胞的一發炎反應。
本發明之又一目的在提供一種如前所述的益生菌組合物用於製備預防及/或治療乾眼症之醫藥組成物的用途
在本發明之較佳實施例中，該益生菌組合物含有至少1 10 10CFU的該嗜熱鏈球菌iHA318菌株。
在本發明之較佳實施例中，該醫藥組成物係為一醫藥品、一營養補充品、一保健食品、一食品、一保養品、一外用品、或其任意組合。
在本發明之較佳實施例中，該醫藥組成物可以進一步包含一醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、輔劑、及/或食品添加劑。此外該醫藥組成物的劑型可以係為一溶液、一懸浮液、一半固態製劑、一固態製劑、一明膠膠囊、一軟膠囊、一錠劑、一丸劑、一糖漿、一口含錠、一片劑、一口嚼膠、及/或一冷凍乾燥粉末製劑。
本發明之又一目的在提供一種益生菌組合物用於生產唾液酸及/或玻尿酸的用途，其中該益生菌組合物包含一嗜熱鏈球菌iHA318菌株，其寄存編號係為BCRC 911114。
本發明提供一種新穎的嗜熱鏈球菌iHA318菌株，並測得該嗜熱鏈球菌iHA318菌株的最適培養配方係使用尿素作為營養氮源，且最適濃度為0.4-0.6%尿素，可以大幅提升iHA318菌株的活性並大幅提升菌數生長數量。
本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株及/或其代謝產物可以有效提升神經細胞與免疫細胞在氧化傷害中的細胞存活率，因此具有優異的神經細胞與免疫細胞抗氧化活性，而可以應用於抗氧化之醫藥組成物的製備；本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株及/或其代謝產物亦可以有效降低免疫細胞所促發的發炎反應，因此具有優異的免疫細胞抗發炎活性，而可以應用於抗發炎之醫藥組成物的製備。
此外，相較於同樣分離自母乳的嗜熱鏈球菌ST002菌株、及習知的嗜熱鏈球菌BCRC 14017菌株，本發明之嗜熱鏈球菌新穎iHA318菌株可以更有效地分泌唾液酸與玻尿酸，且所分泌的玻尿酸涵蓋廣範圍的分子量，因此本發明之嗜熱鏈球菌新穎iHA318菌株不僅可以應用於唾液酸與玻尿酸的生產，還可以應用於皮膚保濕、免疫調節、乾眼症、抗發炎與抗氧化等用途。
爲使本發明所屬技術領域中具通常知識者瞭解本發明之目的、特徵、及功效，茲藉由下述具體實施例，並配合所附之圖式，對本發明詳加說明如下。
本文中所使用的所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為本發明所屬技術領域中具通常知識者可共同瞭解的意義。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例僅係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何本發明所屬技術領域中具通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差 (SD)表示，個此之間的差異以學生 t檢驗(student's t-test)分析。
本文所述的「益生菌株 (Probiotic或Probiotic bacteria)」係為一微生物，其菌體、混合菌株、萃取物、或代謝產物對於宿主本身係具有正面影響，通常源自於個體內、有益於個體健康的細菌，亦可指外來補充、對個體可能有益的某些微生物。
本文所述的「代謝產物」係為一微生物代謝後所分泌的物質，更具體地，可以係為培養時細菌分泌至細菌培養基中的物質，在本發明中嗜熱鏈球菌iHA318菌株的代謝產物可以包含唾液酸及玻尿酸。
本文所述之嗜熱鏈球菌的學名「 Streptococcus thermophilus」等同於 「 Streptococcus salivarius subsp. thermophilus」。
依據本發明，有關細菌培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關抗氧化活性分析的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關抗發炎活性分析的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關唾液酸純化及其含量分析的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關玻尿酸純化及其含量與分子量分析的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
除非本文中有另外說明，所謂「治療」不應被解釋為治療一個體直至完全恢復，而應包含將一個體的疾病進展或症狀維持在一實質上靜態的程度、增加一個體的恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、或提高一個體的生命品質。
本發明提供一種新穎的嗜熱鏈球菌 ( Streptococcus thermophilus) iHA318菌株，其是一種具有分泌唾液酸與玻尿酸的能力且具有抗氧化與抗發炎功效的益生菌株；本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株係分離自母乳檢體，透過API ®50 CHL微生物鑑定套組(BioMerieux)確定為嗜熱鏈球菌；同時也利用習知的方法萃取本發明嗜熱鏈球菌iHA318菌株的總RNA (total RNA)並進行反轉錄後，採用16S rDNA作為標的基因進行細菌鑑定，其中使用3組不同的通用引子 (universal primer)以聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)，對前述總RNA的反轉錄產物進行16S rDNA的擴增，再將擴增成功且長度較長的 PCR 產物進行定序解碼，該3組引子如下表1所示；其中，關於萃取總RNA及反轉錄的方法誠屬本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。定序所得之核酸片段如序列辨識編號SEQ ID NO：7所示，接著將該核酸片段與美國國家生物技術資訊中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 基因庫 (GenBank)中，他種嗜熱鏈球菌16S rRNA基因序列進行比對後，具有99%以上的序列一致性，因此確認本發明iHA318菌株為嗜熱鏈球菌 ( Streptococcus salivarius subsp. thermophilus或稱 Streptococcus thermophilus)。 表1
組別 通用引子 序列編號 序列
1 27F SEQ ID NO：1 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1525R SEQ ID NO：2 AAGGAGGTGWTCCARCC
2 8F2 SEQ ID NO：3 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG
806R SEQ ID NO：4 GGACTACCAGGGTATCTAAT
3 FD1 mod SEQ ID NO：5 AGAGTTTGATCYTGGYTYAG
16S1RR-B SEQ ID NO：6 CTTTACGCCCARTRAWTCCG
本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的生理特徵如下：生長溫度為35 oC至40 oC、於適當培養基生長24小時後之生長酸鹼值為pH 4.6、氧氣影響則為兼性厭氧 (facultative anaerobic)；本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的培養方法如下：將該iHA318菌株接種於瓊脂培養基  (De Man, Rogosa and Sharpe, MRS)或M17液態培養基，並於37 oC厭氧環境進行培養；本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株之菌落的外觀特徵如下：邊緣完整、菌落呈微白色且較大、表面平滑隆起；本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的型態特徵則如下：呈鏈球狀、無孢子形成、且無移動性；而本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的格蘭氏染色結果為陽性。
本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株已於2022年3月11日，寄存於台灣的食品工業發展研究所 (Food Industry Research and Development Institute, FIRDI) 的生物資源保存及研究中心 (Biosource Collection and Research Center, BCRC)，且寄存編號為BCRC 911114。同時，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株亦已於2021年8月17日，寄存於德國微生物菌種保存中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，且寄存編號為DSM 33978。
相較於習知的嗜熱鏈球菌BCRC 14017菌株，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株具有抗氧化與抗發炎的活性功效，基於此些有益的生物活性，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株預期具有可用於提升一個體抗氧化及/或抗發炎的潛力，因此本發明另提供一種包含本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的益生菌組合物。
本發明的益生菌組合物可以應用於製備一醫藥組成物的用途，該醫藥組成物係用以提升個體抗發炎及/或抗氧化的能力；其中，該醫藥組成物可以係為一醫藥品、一營養補充品、一保健食品、一食品、一外用品、一保養品、或其任意組合，且可以進一步包含一醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、輔劑、及/或食品添加劑。
在本發明之一較佳實施例中，將本發明的益生菌組合物配製於一醫藥學上可接受的載劑 (pharmaceutically acceptable vehicle)中，並製成一適用於口服投藥 (oral administration)的劑型 (dosage form)，且該醫藥組成物較佳為呈一選自於下列群組中的劑型：溶液 (solution)、懸浮液 (suspension)、粉末 (powder)、錠劑 (tablet)、丸劑 (pill)、糖漿 (syrup)、口含錠 (lozenge)、片劑 (troche)、口嚼膠 (chewing gum)、膠囊 (capsule)、及其類似者。
依據本發明，該醫藥學上可接受的載劑可以包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑 (solvent)、緩衝液 (buffer)、乳化劑 (emulsifier)、懸浮劑 (suspending agent)、分解劑 (decomposer)、崩解劑 (disintegrating agent)、分散劑 (dispersing agent)、黏結劑 (binding agent)、賦形劑 (excipient)、安定劑 (stabilizing agent)、螯合劑 (chelating agent)、稀釋劑 (diluent)、膠凝劑 (gelling agent)、防腐劑 (preservative)、潤濕劑 (wetting agent)、潤滑劑 (lubricant)、吸收延遲劑 (absorption delaying agent)、脂質體 (liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水 (normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水 (phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液 (aqueous solution containing alcohol)、及其組合。
依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在本發明另之一較佳實施例中，可以將本發明的益生菌組合物製備成一食品產品，並以可食用性材料配製成包含但不限於：飲料 (beverages)、發酵食品 (fermented foods)、烘培產品 (bakery products)、保健食品 (health foods)、營養補充品  (nutritional supplement)、以及膳食補充品 (dietary supplements)。
依據本發明，該可食性材料係選自於由水 (water)、流體乳品 (fluid milk products)、牛奶 (milk)、濃縮牛奶 (concentrated milk)；發酵乳品 (fermented milk)，諸如優酪乳 (yogurt)、酸乳 (sour milk)、冷凍優格 (frozen yogurt)、乳桿菌發酵飲料 (lactic acid bacteria-fermented beverages)；奶粉 (milk powder)；冰淇淋 (ice cream)；乳酪 (cream cheeses)；乾酪 (dry cheeses)；豆奶 (soybean milk)；發酵豆奶 (fermented soybean milk)；蔬果汁 (vegetable-fruit juices)；果汁 (juices)；運動飲料 (sports drinks)；甜點 (confectionery)；果凍 (jellies)；糖果 (candies)；嬰兒食品 (infant formulas)；健康食品 (health foods)；動物飼料 (animal feeds)；中草藥材 (Chinese herbals)；膳食補充品 (dietary supplements) 所組成之群組。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物 (food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。 細胞培養方法
在本發明之實施例中，神經細胞的測試是使用PC12細胞進行，PC12細胞是購自財團法人食品工業發展研究所，編號為BCRC 60048。使用RPMI-1640培養基 (Sigma)進行培養，其中添加2 mM的麩醯胺酸 (glutamine；Sigma)、1.5 g/L的碳酸氫鈉 (sodium bicarbonate；Sigma)、4.5 g/L的葡萄糖 (glucose；Sigma)、10 mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸 (HEPES；Sigma)、1 mM的丙酮酸鈉 (sodium pyruvate；Sigma)、100 U/mL的青黴素/鏈黴素 (penicillin/streptomycin；Sigma)、10%的馬血清 (horse serum；Hyclone, Logan, UT, USA)、及5%的胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS；Gibco)。PC12細胞的培養方法為：將1.5 10 4/well的細胞接種於96孔培養盤中，其中每孔含有100 L的培養基，並於5%的CO 2、37 oC環境下培養。
在本發明之實施例中，免疫細胞的測試使用小鼠單核球巨噬細胞 (以下稱Raw264.7細胞)進行，Raw264.7細胞是購自財團法人食品工業發展研究所，編號為BCRC No.60001。使用DMEM培養基 (Dulbecco's Modified Eagle Medium；Gibco)進行培養其中添加10 %的胎牛血清 (Gibco)、1%的L-麩醯胺酸 (Gibco)、及1%的青黴素-鏈黴素兩性黴素 (Penicillin-streptomycin Amphoteric, AA；Gibco)。Raw264.7細胞的培養方法為：將1 10 4/well的細胞接種於96孔培養盤中，其中每孔含有100 L的培養基中，並於5%的CO 2、37 oC環境下培養。
以下將詳細說明：本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的最適培養配方；以及本發明益生菌組合物提升神經細胞抗氧化能力、提升免疫細胞抗氧化與抗發炎能力的功效測試；並比較本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株與習知菌株於分泌唾液酸及玻尿酸的能力差異。以證實本發明之益生菌組合物具有所請的功效，而能用於製備對應功效之組合物。 實施例 1 本發明之嗜熱鏈球菌 iHA318 菌株的最適培養配方
在本發明之一實施例中，為了得到最適合用以培養本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的配方，先測試含有不同營養源(氮源)的培養基對iHA318菌株生長造成的差異，以找出iHA318菌株的最適營養源，再將該最適營養源以不同濃度配置在培養基中，以測試營養源濃度對iHA318菌株生長造成的差異，以找出iHA318菌株的最適營養源濃度。
首先，將本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的凍管原菌解凍，並取出1 mL的菌液加入9 mL的無菌水，於靜置1小時後取出10 L的稀釋液加入10 mL下列表2的培養基A至G中，其中培養基A至G所有成分皆相同，除了5 g營養源在培養基B至G分別依序為脫脂奶粉、胰蛋白酶大豆 (tryptic soy)、尿素 (urea)、肉萃取物 (meat extract)、酵母萃取物 (yeast extract)、及酪蛋白 (casein)，再以無菌水定量至總體積為1 L後，於37 oC培養24小時，並將不同培養基的菌液混合均勻後取出10 mL，加入90 mL的無菌水進行系列稀釋至適當濃度後，取出1 mL以傾注培養法以MRS瓊脂培養基於37 oC厭氧培養48小時後，進行菌數分析。 表2
培養基編號 A B C D E F G
Proteose Peptone No.3 10g 10g 10g 10g 10g 10g 10g
Beef Extract 10g 10g 10g 10g 10g 10g 10g
Yeast Extract 5g 5g 5g 5g 5g 5g 5g
Magnesium Sulfate 0.1g 0.1g 0.1g 0.1g 0.1g 0.1g 0.1g
Dextrose (Glucose) 20g 20g 20g 20g 20g 20g 20g
Polysorbate 80 1g 1g 1g 1g 1g 1g 1g
Ammonium Citrate 2g 2g 2g 2g 2g 2g 2g
Sodium Acetate 5g 5g 5g 5g 5g 5g 5g
Manganese Sulfate 0.05g 0.05g 0.05g 0.05g 0.05g 0.05g 0.05g
Dipotassium Phosphate 2g 2g 2g 2g 2g 2g 2g
5 g營養源 無 脫脂奶粉 胰蛋白酶大豆 尿素 肉萃取物 酵母萃取物 酪蛋白
H 2O 定量至1L
本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株在含有前述不同營養源之培養基的生長菌數分析如圖1所示，其中可以看出相較於未添加營養源的培養基A，添加尿素作為營養源的培養基D可以大幅提升200%本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的生長菌數，其餘培養基皆僅能提升10-50%不等的菌數生長數量，且添加酵母萃取物的培養基F反而會降低本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的生長數量。此結果顯示，相較於諸如脫脂奶粉、胰蛋白酶大豆、肉萃取物、酵母萃取物、酪蛋白等大分子氮源，使用諸如尿素等小分子氮源為更適合用以培養本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的最適營養源，且小分子氮源如分子氮、胺基酸應皆有助於嗜熱鏈球菌iHA318菌株的生長。
接著，為進一步瞭解最適合用以培養本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的尿素濃度，將本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的凍管原菌解凍，並取出1 mL的菌液加入9 mL的無菌水，於靜置1小時後取出10 L的稀釋液加入10 mL下列表3的培養基D-1至D-5中，其中分別含有0%、0.10%、0.50%、1.00%、或5%的尿素，並以無菌水定量至總體積為1 L後，於37 oC培養24小時時，並將不同培養基的菌液混合均勻後取出10 mL，加入90 mL的無菌水進行系列稀釋至適當濃度後，取出1 mL以傾注培養法以MRS瓊脂培養基於37 oC厭氧培養48小時後，進行菌數分析。 表3
培養基編號 D-1 D-2 D-3 D-4 D-5
Urea 濃度 0% 0.10% 0.50% 1.00% 5%
Proteose Peptone No3 10g 10g 10g 10g 10g
Beef Extract 10g 10g 10g 10g 10g
Yeast Extract 5g 5g 5g 5g 5g
Magnesium Sulfate 0.1g 0.1g 0.1g 0.1g 0.1g
Dextrose (Glucose) 20g 20g 20g 20g 20g
Polysorbate 80 1g 1g 1g 1g 1g
Ammonium Citrate 2g 2g 2g 2g 2g
Sodium Acetate 5g 5g 5g 5g 5g
Manganese Sulfate 0.05g 0.05g 0.05g 0.05g 0.05g
Dipotassium Phosphate 2g 2g 2g 2g 2g
urea 0g 1g 5g 10g 50g
H 2O 定量至1L
本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株在含有不同濃度尿素之培養基的生長菌數分析如圖2所示，其中可以看出相較於未添加尿素營養源的培養基D-1，添加0.5%尿素作為營養源的培養基D-3可以大幅提升逾200%本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的生長菌數，其餘培養基皆無法有效促進菌數生長數量。此結果顯示，0.5%尿素濃度為最適合用以培養本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的最適營養源濃度。 實施例 2 本發明之嗜熱鏈球菌 iHA318 菌株的神經細胞抗氧化功效
在本發明之一實施例中，為了測試本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株對神經細胞的抗氧化活性，使用氧化劑刺激經iHA318菌株及其代謝產物處理後的神經細胞PC12細胞，並測試該PC12細胞的存活率以分析本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株提升細胞抗氧化活性的能力；在本發明之實施例中以過氧化氫(H 2O 2)作為氧化劑。
首先，將本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的冷凍管取出後解凍，並以1%的濃度接種至MRS培養基，在37 oC厭氧環境下培養16-24小時，以活化iHA318菌株。同時將PC12細胞以1.5 10 4/well的量接種於96孔培養盤中，其中每孔含有100 L的培養基，並於5%的CO 2、37 oC環境下培養24小時後移除細胞培養基，以供後續試驗使用。
接著，取出100 L經活化的菌液放置於10 mL的MRS培養基中，在37 oC厭氧環境下培養16-24小時後。接著，將菌液經20-50倍稀釋後備用，例如20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、或45-50倍稀釋，其中可以進一步移除菌液中的細菌也可以不移除，較佳則為以離心或過濾的方式移除其中的細菌，僅保留細菌培養液，並分成以下三組處理PC12細胞：(1) 控制組：僅加入100 L的細胞培養基處理，並未再以過氧化氫作用；(2) 對照組：加入100 L的細胞培養基於37 oC下處理4小時後，以最終濃度為100 M的過氧化氫(Sigma；以細胞培養基配置)作用24小時；(3) 實驗組：加入100 L前述iHA318菌株的細菌培養液於37 oC下處理4小時後，以最終濃度為100 M的過氧化氫(Sigma；以細胞培養基配置)作用24小時；接著將各組的細胞培養基移除後，加入100 L的MTT試劑(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide；Gibco)，於37 oC下作用2小時後移除，並加入100 L的二甲基亞碸 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)反應 10分鐘，接著檢測各組於570 nm下的吸光值，以量化PC12細胞的細胞存活率，結果如圖3所示，其中以控制組的存活率為100%。
由圖3可以看出，相較於未經過氧化氫作用的控制組，經過氧化氫作用後，比較組的PC12細胞僅有31.82%的細胞存活率；然而，以本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株處理後，再經過氧化氫作用的實驗組PC12細胞有58.65%的細胞存活率，相較於比較組可以明顯地提升26.83%的比率。此結果顯示，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以有效提升神經細胞在氧化傷害中的細胞存活率，因此具有優異的神經細胞抗氧化活性。 實施例 3 本發明之嗜熱鏈球菌 iHA318 菌株的免疫細胞抗氧化與抗發炎功效
在本發明之一實施例中，為了測試本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株對免疫細胞的抗氧化與抗發炎活性，分別使用氧化劑與促發炎劑刺激經iHA318菌株及其代謝產物處理後的免疫細胞Raw264.7細胞，並分別測試該Raw264.7細胞的存活率、以及該Raw264.7細胞分泌之發炎介質的分泌量，以分析本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株提升細胞抗氧化與抗發炎活性的能力；在本發明之實施例中以AAPH (2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)作為氧化劑，且以脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS)為促發炎劑，並以亞硝酸鹽檢測試劑 (Griess reagent)檢測發炎介質一氧化氮 (NO)的分泌量。
首先，將本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的冷凍管取出後解凍，並以1%的濃度接種至MRS培養基，在37 oC厭氧環境下培養16-24小時，以活化iHA318菌株。接著，取出100 L經活化的菌液放置於10 mL的MRS培養基中，在37 oC厭氧環境下培養16-24小時。同時將Raw264.7細胞以1 10 4/well的量接種於96孔培養盤中，其中每孔含有100 L的培養基，並於5%的CO 2、37 oC環境下培養24小時後移除細胞培養基，以供後續試驗使用。
在抗氧化功效的試驗中：將菌液經80-100倍稀釋後備用，例如80-85、85-90、90-95、或95-100倍稀釋，其中可以進一步移除菌液中的細菌也可以不移除，較佳則為以離心或過濾的方式移除細菌，僅保留細菌培養，並分成以下三組處理Raw264.7細胞：(1) 控制組：僅加入100 L的細胞培養基處理，並未再以AAPH作用；(2) 對照組：加入100 L的細胞培養基於37 oC下處理24小時後，以最終濃度為60 mM的AAPH (Sigma；以細胞培養基配置)作用；(3) 實驗組：加入100 L前述iHA318菌株的細菌培養液於37 oC下處理24小時後，以最終濃度為60 mM的AAPH (Sigma；以細胞培養基配置)作用；接著將各組的細胞培養基移除後，加入100 L的的MTT試劑 (Gibco)，於37 oC下作用2小時後移除，並加入100 L的二甲基亞碸 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)反應 10分鐘，接著檢測各組於570 nm下的吸光值，以量化Raw264.7細胞的細胞存活率，結果如圖4所示，其中以控制組的存活率為100%。
由圖4可以看出，相較於未經過AAPH作用的控制組，經AAPH作用後，比較組的Raw264.7細胞僅有59.93%的細胞存活率；然而，以本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株處理後，再經AAPH作用的實驗組Raw264.7細胞相當於控制組的細胞存活率，相較於比較組可以明顯地提升50.3%的比率。此結果顯示，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以有效提升免疫細胞在氧化傷害中的細胞存活率，因此具有優異的免疫細胞抗氧化活性。
在抗發炎功效的試驗中：將菌液經20-50倍稀釋，例如20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、或45-50倍稀釋，再以離心或過濾的方式移除細菌，僅保留細菌培養液，並分成以下三組處理Raw264.7細胞：(1) 控制組：僅加入100 L的細胞培養基處理，並未再以脂多醣作用；(2) 對照組：加入100 L的細胞培養基於37 oC下處理24小時後，以最終濃度為1 g/mL的脂多醣(Sigma；以細胞培養基配置)作用48小時；(3) 實驗組：加入100 L前述iHA318菌株的細菌培養液於37 oC下處理24小時後，以最終濃度為1 g/mL的脂多醣 (Sigma；以細胞培養基配置)作用48小時；接著分別收集50 L各組的細胞上清液，加入50 L的亞硝酸鹽檢測試劑 (Sigma)反應15分鐘，若細胞上清液中含有一氧化氮會使溶液呈現紫色，因此檢測各組於550 nm下的吸光值，以量化Raw264.7細胞分泌的一氧化氮濃度，來表示細胞被激發的發炎反應，結果如圖5所示，其中以控制組的一氧化氮濃度為100%。
由圖5可以看出，若將經脂多醣作用後之比較組Raw264.7細胞的一氧化氮分泌量定義為100%，則以本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株處理後，再經脂多醣作用的實驗組Raw264.7細胞，其一氧化氮分泌量僅有25.22%，相較於比較組可以明顯地降低74.74%的比率。此結果顯示，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以有效降低免疫細胞所促發的發炎反應，因此具有優異的免疫細胞抗發炎活性。 實施例 4 本發明之嗜熱鏈球菌 iHA318 菌株減緩乾眼症的功效
在本發明之一實施例中，為了測試本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株對減緩個體乾眼症的功效，募集5位年齡介於25-40歲具有眼睛乾澀困擾的受試者，每日服用50 mg本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株 (相當於每日攝取1 10 10CFU) 共28日，並分別於服用的第0天、第7天、第14天、第21天、及第28天填寫眼表疾病指數量表 (OSDI，為國際慣用於評估乾眼症的量表)，以評估本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株對預防及/或治療個體乾眼症的功效，結果如圖6所示。
由圖6可以看出，隨著服用本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株的天數增加，受試者眼表乾澀不適的症狀會逐漸地緩解，且服用28天後可以減少36.4%的眼表乾澀不適感，此結果顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以有效舒緩個體眼表不適感，而可以有效用於預防及/或治療乾眼症的症狀。 實施例 5 本發明之嗜熱鏈球菌 iHA318 菌株分泌唾液酸的功效
在本發明之一實施例中，為了測試本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株分泌唾液酸的功效能力，透過比色法分析iHA318菌株的唾液酸分泌量，並比較同樣分離自母乳檢體的嗜熱鏈球菌ST002菌株、以及購買自財團法人食品工業發展研究所的嗜熱鏈球菌BCRC 14017菌株於分泌唾液酸的能力差異。
首先，將嗜熱鏈球菌ST002菌株、BCRC 14017菌株、以及本發明之iHA318菌株的冷凍管取出後解凍，並以1%的濃度接種至MRS培養基或M17液態培養基，在37 oC厭氧環境下培養16-24小時，以活化此三種菌株。接著，分別取出100 L經活化的菌液，放置於10 mL的MRS培養基或M17液態培養基，在37 oC厭氧環境下培養16-24小時。
接著，分別取出等量的菌液進行分析，可以將其中的唾液酸純化後再量化其分泌量，也可以對菌液進行前處理後直接量化其唾液酸含量；其中，唾液酸的純化可以直接使用菌液，也可以使用細菌培養液(以離心方式移除菌液中的細菌細胞)，並使菌液或細菌培養液水解及脫鹽，再使用離子交換樹脂純化出其中的純唾液酸；而在本發明之實施例中則是分別取出4 mL的菌液先進行唾液酸分析的前處理：加入50 L的8N氯化氫 (HCl)，均勻混合後於80 oC下反應2小時，待冷卻後加入50 L的氫氧化鈉 (NaOH)並均勻混合；接著，於適當稀釋後取出40 L的溶液為待測樣本，以進行唾液酸的含量分析，並同樣取40 L的N-乙醯神經胺酸 (N-Acetylneuraminic acid)作為標準品：於待測樣本與標準品中加入20 L的0.2M高碘酸鈉 (NaIO 4) (溶於9M的磷酸 (H 3PO 4)中)，於室溫下反應20分鐘，再加入200 L含10%偏亞砷酸鈉 (NaAsO 2)與0.2M Na 2IO 4(含0.01% KI，溶於0.1M硫酸 (H 2SO 4)中)的溶液，混合均勻直至棕色消失，接著加入600 L的0.6%硫巴比妥酸 (thiobarbituric acid) (含7%硫酸鈉 (Na 2SO 4)的水溶液)，混合均勻後於100 oC下反應15分鐘，待冷卻後加入400 L的環己酮，再以12,000 g離心5分鐘，取出上清液測量於549 nm的吸光值，並以標準品的吸光值繪製標準曲線，以內差法算出待測樣本的唾液酸濃度，即可得到嗜熱鏈球菌ST002菌株、BCRC 14017菌株、以及本發明之iHA318菌株所分泌的唾液酸濃度，結果如圖7所示。
由圖7可以看出，嗜熱鏈球菌ST002菌株以及BCRC 14017菌株僅能分泌約35 ppm的唾液酸，然而以同樣方式進行菌株的培養，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以產出約75 ppm的唾液酸，為其他二種菌株的2倍以上。此結果顯示，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以更有效地分泌唾液酸，而可以應用於唾液酸的生產以及美容與保健的用途。 實施例 6 本發明之嗜熱鏈球菌 iHA318 菌株分泌玻尿酸的功效
在本發明之一實施例中，為了測試本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株分泌玻尿酸的功效能力，透過比色法分析iHA318菌株的玻尿酸分泌量，並比較嗜熱鏈球菌ST002菌株、及BCRC 14017菌株於分泌玻尿酸的能力差異。
首先，將嗜熱鏈球菌ST002菌株、BCRC 14017菌株、以及本發明之iHA318菌株的冷凍管取出後解凍，並以實施例4所述方法活化此三種菌株。接著，分別取出100 L經活化的菌液，放置於10 mL的MRS培養基或M17液態培養基，在37 oC厭氧環境下培養16-24小時。
接著，分別取出10 mL的菌液先進行玻尿酸純化的處理：加入40 mL的95%酒精混合均勻後，以5000 rpm離心10分鐘並移除上清液，再次加入40 mL的95%酒精混合均勻後，於5000 rpm離心10分鐘並移除上清液，以水定量至10 mL；接著，於適當稀釋後取出100 L的溶液放置於玻璃試管中為待測樣本，以進行玻尿酸的含量分析，並同樣取100 L的葡萄醣醛酸作為標準品：樣本於冰浴中緩慢加入600 L的硼砂硫酸液，混合均勻後置於100 oC水浴槽反應10分鐘，待降至室溫後置於冰浴，再加入20 L的咔唑溶液，混合均勻後置於100 oC 水浴槽中反應15分鐘，待降至室溫後，混合均勻並取100 L的反應溶液於96孔盤中，測量於525 nm的吸光值，並以標準品的吸光值繪製標準曲線，以內差法算出待測樣本的玻尿酸濃度，再乘稀釋倍數與轉換係數2.07，即可得到嗜熱鏈球菌ST002菌株、BCRC 14017菌株、以及本發明之iHA318菌株所分泌的玻尿酸濃度，結果如圖8所示。
由圖8可以看出，嗜熱鏈球菌ST002菌株及BCRC 14017菌株僅能分泌0.11 g/L及0.06 g/L的玻尿酸，然而以同樣方式進行菌株的培養，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以產出1.71 g/L的玻尿酸，為其他二種菌株的15倍以上。此結果顯示，本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株可以更有效地分泌玻尿酸，而可以應用於玻尿酸的生產或美容與保健的用途。
為進一步瞭解本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株所分泌之玻尿酸的分子量，將前述iHA318菌株培養並經玻尿酸純化後，調整為適當濃度以常規手段進行分子量的測定。結果如圖9所示，其中可以看出本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株所分泌的玻尿酸分子量分別為：＜1,000 Da：1.90%；1,000-2,000 Da ： 4.70%；2,000-5,000 Da：58.10%；5,000-10,000 Da： 15.30%；10,000-20,000 Da：10.80%；＞20,000 Da：9.20% ，並在此區間具有一定的功效。此結果顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株能夠分泌廣泛分子量範圍的玻尿酸，而可以應用於皮膚、眼睛、關節等不同部位的美容與保健。
綜上所述，本發明提供一種新穎的嗜熱鏈球菌iHA318菌株，並測得該嗜熱鏈球菌iHA318菌株的最適培養配方，以提升iHA318菌株的活性並大幅提升菌數生長數量。本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株及/或其代謝產物可以有效提升神經細胞與免疫細胞在氧化傷害中的細胞存活率，因此具有優異的神經細胞與免疫細胞抗氧化活性，同時亦可以有效降低免疫細胞所促發的發炎反應，因此具有優異的免疫細胞抗發炎活性。相較於同樣分離自母乳的嗜熱鏈球菌ST002菌株、及習知的嗜熱鏈球菌BCRC 14017菌株，本發明之嗜熱鏈球菌新穎iHA318菌株可以更有效地分泌唾液酸與玻尿酸，因此可以應用於唾液酸與玻尿酸的生產，並應用於保濕、免疫調節、乾眼症、抗氧化與抗發炎等用途。
無。
圖1顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株在含有不同營養源之培養基的生長菌數分析結果。 圖2顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株在含有不同濃度尿素之培養基的生長菌數分析結果。 圖3顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株提升神經細胞抗氧化能力的功效結果。 圖4顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株提升免疫細胞抗氧化能力的功效結果。 圖5顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株提升免疫細胞抗發炎能力的功效結果。 圖6顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株減緩乾眼症的功效結果。 圖7顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株相較於習知菌株大量分泌唾液酸的結果。 圖8顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株相較於習知菌株大量分泌玻尿酸的結果。 圖9顯示本發明之嗜熱鏈球菌iHA318菌株所分泌的玻尿酸分子量分析結果。
國內寄存資訊：嗜熱鏈球菌iHA318菌株寄存於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心；2022年03月11日；寄存編號為BCRC 911114。 國外寄存資訊：嗜熱鏈球菌iHA318菌株另寄存於德國微生物菌種保存中心；2021年8月17日；寄存編號為 DSM 33978。 
                         序列表
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          tggagagttt gatcctggct cag                                               23
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          ggactaccag ggtatctaat                                                   20
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<223> 合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          agagtttgat cytggytyag                                                   20
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          ctttacgccc artrawtccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  755]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  嗜熱鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          gcgtgctata catgcaagta gaacgctgaa gagaggagct tgctcttctt ggatgagttg       60
          cgaacgggtg agtaacgcgt aggtaacctg ccttgtagcg ggggataact attggaaacg      120
          atagctaata ccgcataaca atggatgaca catgtcattt atttgaaagg ggcaattgct      180
          ccactacaag atggacctgc gttgtattag ctagtaggtg aggtaatggc tcacctaggc      240
          gacgatacat agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag      300
          actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg gggcaaccct gaccgagcaa      360
          cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgtaagtc aagaacgggt      420
          gtgagagtgg aaagttcaca ctgtgacggt agcttaccag aaagggacgg ctaactacgt      480
          gccagcagcc gcggtaatac gtaggtcccg agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc      540
          gagcgcaggc ggtttgataa gtctgaagtt aaaggctgtg gctcaaccat agttcgcttt      600
          ggaaactgtc aaacttgagt gcagaagggg agagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat      660
          gcgtagatat atggaggaac accggtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct      720
          gaggctcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagt                                 755

Claims (13)

  1. 一種生產唾液酸及玻尿酸的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)iHA318菌株，其寄存編號係為BCRC 911114，其中該嗜熱鏈球菌iHA318菌株係使用一培養基進行培養，且該培養基的營養源係為小分子氮源。
  2. 一種益生菌組合物，包含一嗜熱鏈球菌iHA318菌株及/或其代謝產物，其寄存編號係為BCRC 911114，其中該嗜熱鏈球菌iHA318菌株係使用一培養基進行培養，且該培養基的營養源係為小分子氮源。
  3. 如請求項2所述的益生菌組合物，其中該培養基的營養源係為尿素。
  4. 如請求項2所述的益生菌組合物，其中該嗜熱鏈球菌iHA318菌株係為活菌或死菌。
  5. 一種益生菌組合物用於生產唾液酸及玻尿酸的用途，其中該益生菌組合物係為如請求項2所述的益生菌組合物。
  6. 如請求項5所述的用途，其中該益生菌組合物係為一醫藥品、一營養補充品、一保健食品、一食品、一保養品、一外用品、或其任意組合。
  7. 一種益生菌組合物用於製備抗氧化之醫藥組成物的用途，其中該益生菌組合物係為如請求項2所述的益生菌組合物。
  8. 如請求項7所述的用途，其中該益生菌組合物係提升一神經細胞及/或一免疫細胞的抗氧化能力。
  9. 一種益生菌組合物用於製備抗發炎之醫藥組成物的用途，其中該益生菌組合物係為如請求項2所述的益生菌組合物。
  10. 如請求項9所述的用途，其中該益生菌組合物係降低一免疫細胞的一發炎反應。
  11. 一種益生菌組合物用於製備預防及/或治療乾眼症之醫藥組成物的用途，其中該益生菌組合物係為如請求項2所述的益生菌組合物。
  12. 如請求項11所述的用途，其中該益生菌組合物含有至少1×1010CFU的該嗜熱鏈球菌iHA318菌株。
  13. 如請求項7、9、或11中任一項所述的用途，其中該醫藥組成物係為一醫藥品、一營養補充品、一保健食品、一食品、一保養品、一外用品、或其任意組合。
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