JPH03120222A - 免疫増強剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主粟上皇程里公団 本発明は、ビフィドバクテリウム　ロンガム（Ｂｉｆｉ
ｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＩＯｎｇｕｍ）　ＳＢＴ　２
９２８株（微工研菌寄第１０６５７号）の菌体を有効成
分とする生体免疫増強剤に関する。

本発明の生体免疫増強剤は、マイトジェン活性、抗腫瘍
活性及びマクロファージ活性などを高める作用を有して
おり、医薬として有用である。

皿来五伎歪 ビフィズス菌は人および動物の腸管内に常在して主要面
相をなす有用細菌として知られている。

母乳栄養児においては腸内面相のほとんどがこの菌種で
占められていることから、これまでも乳児栄養学の観点
から研究され、育児粉乳成分のいわゆる母乳化の一指標
として関心がもたれてきている。しかし、近年、腸内細
菌に関する生態学的研究が著しく進み、乳幼児にかぎら
ず、成人、老人を含めてビフィズス菌は腸管内において
主要面相をなしていることが解明され、また、ビフィズ
ス面相を高率に維持することが人の健康維持を図る上で
非常に重要であることが明らかにされてきた。

ビフィズス菌の人の健康におよぼす効果としては、腸管
内で乳酸、酢酸を生成することによる腸内病原菌・腐敗
菌の増殖抑制、異常醗酵の低下やビフィズス菌の増殖に
よる螺動亢進を含めた整腸作用等の生態学的な効果と、
抗腫瘍活性、コレステロール上昇抑制作用など菌種、菌
株によって活性の異なる生理学的効果の二種に大きく分
けられる。

近年、ことに後者の面からの研究が多くなされ、これま
でにもビフィズス菌の菌体、細胞壁、菌体内成分あるい
は細胞外多糖類の示す抗腫瘍活性（特開昭５３−１０７
４１５．５２−１１７４９４．５５−７２０５．５８−
２０３９１３）、感染防御作用（特開昭６ｌ−２５７９
３０）、コレラ、大腸菌毒素中和効果（特開昭５９−２
２２４２３）、血清コレステロール上昇抑制作用（特開
昭６２−２５８３２３）等の特許出願が公開されている
。

ビフィズス菌の生態学的な効果を期待するには、腸内細
面相に占めるビフィズス菌の存在割合を高めることが必
要となり、広くビフィズス菌全船に共通する効果である
といえる。これに対し、生理学的効果は菌株によって活
性が異なるので、どのような菌株でも一律に目的の生理
学的効果を期待することはできず、当然、活性の優れた
菌株を選択し、そのビフィズス菌を腸管内で増殖、定着
させることにより、生理的効果がより強く期待できるこ
とになる。ビフィズス菌の示す抗腫瘍活性は菌体、細胞
壁、細胞外多糖類も含め腫瘍細胞に対する細胞毒性がな
いことから、生体に対する免疫賦活能が介在しているも
のと推定されている。しかし、これまで、ビフィズス菌
についてその免疫賦活能を比較、検討し、その性質の優
れた菌株を選別して利用しようとする試みはなされてい
ない。

本発明は上述のような状況に鑑みなされたものであって
、工業的な生産が容易であって、安全性が高く、かつ消
化管系を介して生体に対する免疫賦活活性の優れている
ビフィドバクテリウム菌株を選別して、この菌体を免疫
増強剤として提供することを課題とする。

°　る・めの 本発明者は、健康な成人の腸管内に多く存在する各種ビ
フィドバクテリウム属の菌体について、リンパ球分裂促
進作用（マイトジェン活性）を指標にスクリーニングを
行った結果、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｊｉ
ｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌｏｎｇｕａ）の−菌株に強
いマイトジェン活性のあることを見出し、同時に、この
菌株には、消化管系を介して各種の抗腫瘍活性およびマ
クロファージ活性化作用のあることを確認し、本発明を
なすにいたった。

本発明は、このようなビフィドバクテリウムロンガム（
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｙｓ　Ｌｏｎｇｕａ）の
菌体を有効成分とする生体免疫増強剤に関する。

本発明のこのような菌株は、健康な成人の腸管内容物か
ら分離された約３０菌株について検索した結果えられた
ものである。そして、この菌株は、次の手順にしたがっ
て、培養を行い、その菌体を洗浄し、マイトジェン活性
を測定し、活性の強いものを選択することによって得る
ことができた。

■マイトジェン活性測定用試料の調製 健康な成人由来のビフィドバクテリウム属に属する菌株
の培養にあたっては、ブリックス・リバーブロス、ＰＹ
ＦＧブロス〔いずれも光岡知足著“腸内菌の世界”　（
叢文社１９８０））　、ＣＡＭ培地（日永製薬製）、そ
の他、ビフィドバクテリウム属が生育しうる既知の嫌気
性菌用半合成液体培地であればいずれを用いてもよい０
通常、シードカルチャーからブリックス・リバープロス
に菌体を接種し、３５〜３７℃の温度で２４乃至３６時
間、炭酸ガス置換嫌気条件下で培養する。培養終了後、
遠心分離により菌体を集菌し、滅菌生理食塩水で３回洗
浄した後、ＰＢＳ緩衝液に懸濁し、試料とした。

■マイトジェン活性の測定 マイトジェンはリンパ球を活性化し、その細胞分裂を誘
導、促進する作用のある物質であり、マイトジェン活性
を測定することは免疫賦活４物質や抑制物質をスクリー
ニングする系として広（用いられている。

マイトジェン活性は次のようにして測定した。

Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　Ｎマウス牌細胞を採取、洗浄した後、牛
胎児血清ｌＯ％を含むＲＰＭｌ　１６４０培地に浮遊さ
せた。

肺細胞を５Ｘ１０’／ウエルになるように９６穴マイク
ロプレートに分注し、これに試料を１７１０量づつ添加
して、各ウェル中の菌量が１０’、１０’、１０＠個に
なるようにした。対照ウェルにはコンカナバリンＡ（終
濃度１　ｕｇ／１ｔｄｌ＞　、リボポリサンカライド（
終濃度１００　ｕ　ｇ／Ｉｄ）を加え、３７℃、４８時
間、５％ＣＯｔ条件下で培養した。培養終了後、３−（
４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフエ
ニイルー２Ｈテトラゾリウムブロマイド（以下ＭＴＴと
略記）液１０μｌを添加し、更に３時間培養、生ずるＭ
ＴＴフォルマザンをＥＬＩＳＡリーダーを用い、５６２
−５９５ｎ−で吸光度を測定した〔メディカル・イムノ
ロジー、１２（３）　、４１１−４１５（１９８６）　
）　。

マイトジェン活性比（Ｓ、１．）は次のようにして求め
た。

結果は第１表に示すとおりである。

第工表 注）　　（−）　−Ｓ、１．１．００以下（±）　　−
Ｓ、１．　１．００−１．１９（＋）　−Ｓ、１．１．
２０−１．３９をそれぞれ表わす。

第１表にみられるように、供試菌株２９株のうちＢｉｆ
ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕａ　Ｌｏｎｇｕｔａに属する一
菌株にだけマイトジェン活性が認められた。

本発明のこのような強いマイトジェン活性を示す菌株の
菌学的性質を示すと次のとおりである。

（ａ）形態 桿菌で０．５Ｘ３〜５μの大きさで、ダラム染色性は陽
性を示す、菌体は分枝し、運動性はない。

また、胞子も形成しない。

（ｂ）次の培地における生育状況 ■プリンクス・リバープロス培養 ３７°Ｃ２１６〜２４時間で旺盛な生育を示す。

■ＣＡＭ寒天培養 嫌気条件下、３７℃、１６〜２４時間で旺盛な生育を示
し、直径２ａｌｌＩ前後の白色、扁平なコロニーを形成
する。

■酵母エキス添加リドマス牛乳 ３７°Ｃ１２４時間でよく発育し、酸凝固を示す。

（Ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の還元 ■メチルレッドテスト ■インドールの生成 ■硫化水素の生成 ■デンプンの加水分解 ■色素の生成 ■ウレアーゼ ■オキシダーゼ ■カタラーゼ ［相］生育の範囲 １５°Ｃでは生育せず、２２°Ｃ〜４５°Ｃで生育し、
生育至適温度は３５〜３８°Ｃである。

またｐＨ６，０〜７．０で発育する。

■酸素に対する態度 偏性嫌気性 ■ｔｌ類の醗酵性 （ｉ）　　　Ｌ−アラビノース　＋ （ｉｉ）　　Ｄ−キシロース　　士 （ｉｉｉ）　　Ｄ−グルコース　　＋（ガスは生成しな
い）（ｉｖ）　　　Ｄ−マンノ−ス　　＋ （ｖ）　　　Ｄ−フラクトース　＋ （ｖｉ）　　Ｄ−ガラクトース　＋ （ｖｉ）　　麦芽糖　　　　　　十 （ｖｉ）　　シボ糖　　　　　　十 （ｉｘ）　　乳ＩＩ　　　　　　　　＋（Ｘ）　　トレ
ハロース （ｘｉ）Ｄ−ソルビット （ｘｉｉ）Ｄ−マンニット （ｘ　ｉｉ）イノジット （ｘｉｖ）デンプン その他セロビオース、トレハロース、グリコーゲン、イ
ヌリンを分解せず、リボース、メリビオース、ラフィノ
ース、メレチトーズを分解する。

上記の菌学的性質に基づいて“腸内菌の世界”（光岡知
足著、叢文社刊１９８０）を参照にして分類した結果、
上記参考書の分類性状と一致したので本菌株をビフィド
バクテリウムロンガムＣＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ａ　Ｌｏｎｇｕｍ）と同定した。なお、本菌株はビフィ
ドバクテリウム　ロンガム（Ｂｉｊｉｄｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕ麿ｌｏｎｇｕｍ）ＳＢＴ　２９２８株として微生物
工業技術研究所に「微工研菌寄第１０６５７号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１０６５７）　Ｊの番号で寄託しである。した
がって、本菌株を以下、ＳＢＴ　２９２８株と略記する
。

本発明で用いるマイトジェン活性を有するＳ８７２９２
８株の菌体は、生菌体、死菌体あるいは脱脂乳培養物の
いずれでもよい、これらの菌体は通常次の方法によって
調製される。

■洗浄生菌体 プリンクス・リバーブロス、ＰＹＦＧブロス、ＣＡＭ培
地、その他ビフィドバクテリウム属が生育しうる既知の
嫌気性菌用半合成液体培地にシードカルチャーから菌体
を接種し、３５〜３７℃の温度で２４乃至３６時間、炭
酸ガス置換嫌気条件下で培養する。培養終了後、遠心分
離により菌体を集菌し、滅菌生理食塩水で３回洗浄した
後、ＰＢＳｌｌ街液に懸濁する。

■加熱死菌体 上記で得られた菌体のＰＢＳ緩衝懸濁液を９５°Ｃで１
０分間熱処理した後、凍結乾燥し、加熱死菌粉末を得る
。

■脱脂乳培養物 酵母エキス０．３％を含む無脂乳固形分８〜１２％の脱
脂乳に同培地の前培養物３％を接種し、３５〜３７°Ｃ
で２４時間培養する。得られた培養乳をそのまま使用す
るか、あるいは凍結乾燥し、粉末とじて使用する。

次に、本発明に係るＳＢＴ　２９２８株の菌体について
抗腫瘍活性およびマクロファージ活性化の試験結果を説
明する。

（１）抗腫瘍活性 ■同系型腹水腫瘍に対する生残性改善効果ＢＡＬＢ／ｃ
マウス、雄、６週令、１群１６匹に対し、Ｍｅｔｈ　Ａ
フィブロザルコーマをＩ　Ｘ　１０’個腹腔内に接種し
、同日およびその後１日おきにＰＢＳ緩衝液に懸濁させ
た加熱乾燥死菌体０．１■を計５回にわたり腹腔内に接
種し、生残曲線を求めた。なお、対照群にはＰＢＳ緩衝
液のみを同様に接種した。結果を第１図に示す。

この図から明らかなように、対照群では１５日後まで金
側死亡したのに対し、ＳＢＴ　２９２８株接種群では４
５日後に至るも金側生残し、著しい生残性の改善が認め
られた。

■同種腹水型腫瘍に対する生残性改善効果ＩＣＲマウス
、雄、６週令、１群１２匹に対し、ＳＢＴ　２９２８株
で培養した無脂乳固形分８％の脱脂乳を腫瘍細胞接種２
１日前より飲料水として連日自由摂取させた。腫瘍細胞
接種当日５ａｒｃｏｖ＊ａ　１８０をｌＸｌ０’個腹腔
内に接種し、その後も培養乳の連日投与を続けながら、
マウスの生残性に与える影響について検討した。なお、
対照群には同じ組成の非醗酵脱脂乳を与えた。結果は第
２表に示すとおりである。

第２表 ＳＢＴ　２９２８群　　　１１９．４％第２表にみられ
るように、ＳＢＴ　２９２８株投与群の生残性は経口投
与においても改善され、平均生残日数は対照群が１６．
７５±３．２２日であったのに対し、ＳＢＴ　２９２８
株投与群は１９．６４±３．０４日であり、生残日数比
で対照群に比し１１９．４％、また、腫瘍接種１９日後
の生残率では対照群で８．３％であったのに対し、ＳＢ
Ｔ　２９２８株投与群では４５．５％であった。

（２）箱１回ｍ劃４ｍ ５ＢＴ　２９２８株が示す抗腫瘍活性が腫瘍細胞に対す
る細胞毒性にもとづくものでないことは別に確認した。

したがって、このような効果は生体の免疫能を賦活する
ことによって発現するものといえる。

各種免疫担当細胞において第−量的に重要な機能をはた
すものはマクロファージであることから、ＳＢＴ　２９
２８株のマクロファージの活性化について検討した。ま
た、細胞性免疫活性化の指標として遅延型過敏反応にお
よぼす影響についても検討した。

■マ　ロ　　−ジ　　　　　　イン・　　セイＢＡＬＢ
／ｃマウス、雄、６週令、１群１０匹に対して、１０％
プロテオースベプトン液を２ｄづつ接種、４日後、ハン
クス液を用いて腹腔内を洗浄し、腹腔浸出細胞を回収し
た。常法にしたがい、３７℃、１時間培養後にプラスチ
ックシャーレに付着した細胞をラバーポリスマンで回収
し、マクロファージリッチ画分を得た。この際、試験群
にはＳＢＴ　２９２８株の加熱乾燥死菌体０．１ａ＋ｇ
をプロテオースペブトン液に混ぜて接種した。対照群、
試験群より回収したマクロファージ２Ｘ１０’個を群毎
にＭｅｔｈ　Ａ細胞Ｉ　ＸＩＯ’個と混合したものをＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に接種し、２１日後に腫瘍
を摘出、その重量を比較した。結果を第２図に示す。

第２図から明らかなように、ＳＢＴ　２９２８株接種群
において腫瘍増殖は有意に抑制された（Ｗｉｌｃｏｘｏ
ｎの検定Ｐ＜０．０５）　、このことから、ＳＢＴ　２
９２８株の腹腔内接種により、腹腔マクロファージが抗
腫瘍活性を有する状態にまで活性化されているものとい
える。

■　　　　　　　　ＤＴＨ ＣＤＦ　＋　（ＢＡＬＢ／ｃ　Ｘ　ＤＢＡ／２）マウス
、雌、６週令、１群２２匹を設け、腫瘍接種１１日前か
ら隔日ごとに６回にわたりＳＢＴ　２９２８株の加熱乾
燥死菌体１０■をＰＢＳ緩衝液に懸濁した状態で経口投
与した。腫瘍細胞接種当日、５ａｒｃｏｅｓａ　１８０
５　ＸＩＯ’個を背部皮下に接種すると共に、以後、連
日２０日間にわたり同様に菌体の経口投与を続けた。こ
の間、対照群にはＰＢＳ緩衝液のみを投与した。腫瘍接
種後１１日目間後左足跋部皮下に羊赤血球を１０’個１
０．０５ｄを接種し、また、１７日目間後右足蹟部に羊
赤血球を再感作した。以後、１８〜２０日目の３目間に
わたり後右足踵部の厚さを測定し、さらに２１日量定腫
瘍を摘出し、両群の腫瘍重量を比較した。結果を第３図
、第４図に示す。

これらの図から明らかなように、ＳＢＴ　２９２８株投
与群ではＤＴＨ反応が有意に高＜　（Ｔｕｋｅｙの検定
Ｐ＜０．０１）　、同時に腫瘍増殖も有意に抑制されて
いた（Ｗｉ　Ｉｃｏｘｏｎの検定Ｐ　＜０．０１）。

これらの結果から、ＳＢＴ　２９２８株は消化管系を介
してマクロファージを始めとする宿主の細胞性免疫系を
刺激、活性化させ、各種抗腫瘍効果を発現させることが
明らかである。したがって、本菌株は成人ばかりではな
（、生体免疫機能が充分に期待できない乳幼児や高齢者
、病後者、あるいは重篤なる感染症患者や術後患者に対
して有効な免疫賦活在として利用できる。また、本菌株
では生菌体であっても死菌体であってもほぼ同等の効果
が期待できる。

本発明に係わる免疫増強剤は経口的に投与される。菌体
自体を有効成分とする場合には、嫌気性菌用半合成液体
培地で培養して得られる菌体を集菌、洗浄し、そのまま
凍結乾燥するか、あるいは９０″Ｃで１０分間加熱した
後、凍結乾燥する。経口投与において培養乳を用いる場
合には酵母エキス０゜３％を含む無脂乳固形分８〜１２
％の脱脂乳に本菌株を接種、培養し、得られる培養乳を
そのままの状態で用いるか、あるいは凍結乾燥して用い
る。

投与方法としては特に限定されるものではなく、粉末、
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、醗酵孔、あるいは通常の食
品との同時摂取等の経口的利用が可能である。各種経口
剤の製造に当っては、常法として使用される賦形剤、結
合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等を用いることが出
来る。

投与量は年齢、体重、病態の程度によって異なるが、通
常、成人では乾燥菌体量として１００〜５０００ｍｇを
１日数回に分けて摂取するのが適当である。

以下、実施例により本発明による免疫増強剤の調製を具
体的に示す。

実施例１ ブリックス・リバープロスで培養したＳＢＴ　２９２８
株を種菌とし、ファーメンタ−中で滅菌した同培地に１
％接種する。ヘッドスペースに炭酸ガスを吹き込みつつ
、３７℃で２４時間培養する。培養終了後、連続遠心分
離機により国体を回収し、冷却した滅菌生理食塩水で３
回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液に懸濁して凍結乾燥する。培地
１０ｊ！当り凍結乾燥粉末１５ｇ、粉末１ｇ当り１９１
１個の菌体が得られる。

この凍結乾燥粉末２０ｇを、コーンスターチ４５ｇ、結
晶セルロース３０ｇおよびカルボキシメチルセルロース
５ｇと均一に混合し、打錠機で圧縮成型して１錠２００
ｍｇの錠剤を得た。この錠剤１錠には５ＢＴ２９２８株
の面体が４０１１ｇ含有されており、成人１日５〜１５
錠を数回に分けて服用する。

実施例２ 酵母エキス０．３％、無脂乳固形分８％から成る脱脂乳
に、同培地で培養した種菌を３％接種し、３７℃で２４
時間培養した。培養終了後、全量を凍結乾燥した。脱脂
乳１０１当り凍結乾燥粉末９２ｇが得られ、粉末１ｇ当
り１０１・個の生菌体が得られた。

この凍結乾燥粉末を実施例１と同様の方法で製剤とし、
成人に服用させる。

１里坐苅呈 本発明の生体免疫増強剤は、ビフィドバクテリウム属に
属する菌株のなかから特にマイトジェン活性の高い菌株
を選択し、これを有効成分とするものであり、マクロフ
ァージ活性、抗腫瘍活性が高（、経口的に投与されて、
生体の免疫系を刺激、活性化し、生体免疫増強効果を発
揮するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係わるＳＢＴ　２９２８株の腹水型腫
瘍に対する生残性改善効果を、第２図は上記菌体による
マクロファージ活性化効果を、第３図はその時の遅延方
過敏反応におよぼす影響を、第４図は上記菌体の経口投
与による固形腫瘍増殖抑制効果をそれぞれ示したもので
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂ
   ａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）ＳＢＴ２９２８株（微
   工研菌寄第１０６５７号）の菌体を有効成分とする生体
   免疫増強剤。