KR20010101531A - 개선된 미생물 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제품 내에서 증가된 성장/수확 가능성 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 미생물 제제로서, 난소화성 전분을 기질로 하거나 난소화성 전분을 함유하는 배지에서 성장 또는 배양시킨 미생물을 포함하는 제제; 그 제조 방법 및 미생물 제제를 함유하는 제품을 제공한다.

Description

개선된 미생물 제제 {IMPROVED MICROBIAL PREPARATIONS}
프로바이오틱 제품, 예를 들면 용액, 분말, 정제 및 캡슐은 건강 증진을 위해 경구로 투여된다. 마찬가지로 식품을 소비하는 것은 생존을 위해서 뿐 아니라 프로바이오틱 미생물의 첨가를 통해서와 같이 더 나은 건강상의 이점을 위해서이다. 동물 사료 또한 동물의 성장 및 능력을 보조하기 위해 프로바이오틱 미생물을 첨가하여 제조되고 있다. 건강상 이점을 위해 프로바이오틱 조성물을 소비하는 최근의 추세는 처리공정을 거친 유제품을 포함한 광범위한 처리 식품 및 사료 제품의 봉입체를 비롯한 다양한 조제에서 프로바이오틱 미생물이 사용되도록 인도해왔다. 미생물은 또한 우유, 육류, 채소 제품과 같은 일정한 범위의 발효 식품을 제조하기 위한 종균 배양물(starter culture)로서 첨가된다.
본 명세서에서 사용하는 용어로서 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 미생물이란 숙주 동물 내장의 미생물 균형을 개선함으로써 숙주 동물에 유익한 효과를 주는 생체 미생물 공급 보충물을 말한다. 이것은 Journal of Applied Bacteriology, 1989, 66, pp. 365-378 "Probiotics in Man and Animals-A Review"에서 R. Fuller(AFRC Institute of Food Research, Reading Laboratory, UK)가 제시한 정의이며, 이어서 인간을 위한 보충물과 식품을 포함하는 것으로 확장되었다. 프로바이오틱 또는 프로바이오틱 미생물은 또한 비강 또는 질관(vaginal tract)으로 전달될 수 있으며, 각각의 전달 부위에서 숙주의 미생물 균형을 개선함으로써 숙주에 유익한 효과를 주는 생 미생물 보충물 또는 약제를 포함한다.
장 미생물총(gut microflora)의 조성과 그 양은 질병, 생활 양식, 여행, 기타 요인에 의해 유도되는 상황이나 스트레스에 영향을 받을 수 있다. 개체의 건강과 안녕에 긍정적 효과를 주는 미생물이 대장에서 상주하도록 조장될 수 있으면 이 미생물은 숙주의 생리적 안녕을 개선할 것이다.
유익한 미생물 또는 프로바이오틱의 도입은 통상 식품, 음료, 요구르트와 같은 발효된 유제품, 캡슐, 과자류 및 그 밖의 형태에서 미생물을 숙주의 대장 또는 다른 관련 부위에 살아 있는 상태로 그 미생물이 도달하는 방식으로 미생물을 섭취함으로써 달성된다.
프로바이오틱 미생물을 처리 식품에 봉입시키는 데 있어서 한 가지 문제는 상기 미생물이 종종 식품 내에서 소정의 기간 동안 살아남을 수 없다는 점이다. 식품을 제조하고 저장하는 동안 종종 생존 가능한 미생물의 수가 상당히 감소된다.예를 들면, 유제품의 일반적 저장 수명은 제품이 변질되기 전의 기간을 기준으로 계산된다. 이러한 제품에 프로바이오틱 미생물이 첨가되면, 요구되는 유익한 효과를 얻도록 원하는 수의 미생물을 장에 전달하는 것에 관해, 그 제품에 대해 기재된 저장 수명은 적용될 수 없을 수도 있다.
미생물의 다른 용도에는 생물방제(biocontrol) 및 생물정화(bioremediation)가 포함된다. 이러한 용도에 적합한 미생물로서 성장/수확 가능성이 증가되거나 생존율/회수율이 증가된 미생물을 포함하는 미생물 제제는 유리할 것이다. 예를 들면, 특정 비피도박테리아 및 애시도필루스 균주는Escherichia coli및Salmonella spp에 대해 활성을 가지며 이것은 상기 박테리아가 생물방제제로서 적용될 수 있음을 의미한다. 다른 미생물도 생물방제에 적용될 수 있는데, 그 예로는 여러 가지 진균 및Bacillus종이 있다. 또한, 슈도모나스가 생물정화에 효능이 있는 것으로 알려져 있으며 본 발명은 그 미생물의 생존을 증진시키는 데 적용될 수 있다. 통상적으로 사용되는 다른 생물정화 미생물은 알칼리제니스(Alcaligenes)이다.
본 발명자들은 전분, 말토스 또는 난소화성 전분(resistant starch), 특히 식이 섬유를 함유하는 전분 형태 또는 그러한 전분 유래의 난소화성 전분을 미생물 증식 배지 중에 봉입함으로써 상기 미생물의 성장 및 수율을 증가시킬 수 있는 동시에 미생물 제제 또는 종균 배양 및 식품과 사료 제품 내에서의 제조 기간중과 이들 제품의 저장 수명에 해당하는 기간에 걸쳐 미생물의 생존을 증대시킬 수 있으며, 소화관을 통해 지나가는 동안 미생물의 생존율을 향상시킨다는 놀라운 발견을하였다.
식이 섬유는 AOAC(International Association of the Official Analytical Chemistry)에 의해 다음 방법으로 측정되는 식품 중의 총 식이 섬유로 정의된다: 효소-중량법(Method 985.29), Assoc. Off. Anal. Chemists, Official Methods of Analysis, 16th Ed. Arlington VA, USA, 1995. 미생물이 성장한 후 미생물 제제에 난소화성 전분을 더 첨가하는 것은 미생물을 더욱 강하게 하고, 따라서 미생물의 생존율을 높여주게 된다. 난소화성 전분 배지 상에서 성장시키고 및/또는 앞에서 제시한 바와 같은 후속 제품에 난소화성 전분을 첨가함으로써 더욱 강한 종균 배양물을 제조할 수 있기 때문에, 이러한 발견은 또한 생물방제제 및 생물정화제에 적용할 수 있는 동시에 미생물이나 종균 배양물을 첨가하여 발효시킨 식품에도 적용할 수 있다.
본 발명은 일반적으로 성장/수확 가능성이 증가되거나 사용 시 생존율/회수율율이 증가된 미생물을 함유하는 미생물 제제(microbial preparation)에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 제제는 특히 프리바이오틱(prebiotic) 제제 및 프로바이오틱(probiotic) 제제에서의 봉입체(inclusion)에 적합하고, 또한 프로바이오틱 미생물을 함유하는 식품, 사료, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 약물 제품류 및 미생물을 첨가하여 발효시킨 제품류에 적합하다.
도 1은 전분을 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의Bifidobacterium균주 D의 성장을 나타내는 그래프.
도 2는 전분을 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의Bifidobacterium균주 E의 성장을 나타내는 그래프.
도 3은 전분을 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의Bifidobacterium균주 C의 성장을 나타내는 그래프.
도 4는 프로바이오틱계 음료 중에서 전분-성장 미생물의 생존/회수 나타내는 그래프로서, 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 5는 요구르트형 발효유 음료 중에서 전분-성장 미생물의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 6은 오렌지 쥬스 중에서 전분-성장 미생물의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 7은 부가적인 난소화성 전분을 포함한 프로바이오틱계 음료 중에서 전분-성장 미생물의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 8은 부가적인 난소화성 전분을 포함한 요구르트형 발효유 제품 중에서 전분-성장 미생물의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 9는 부가적인 난소화성 전분을 포함한 오렌지 쥬스 중에서 전분-성장 미생물의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 10은 난소화성 전분의 존재 하에 성장시킨 후 동결-해빙 사이클에 노출시킨 균주의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 11은 난소화성 전분의 존재 하에 성장시킨 후 동결-해빙 사이클에 노출시킨 균주의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 추가로 전분 1을 첨가하여 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 12는 난소화성 전분의 존재 하에 성장시킨 후 동결-해빙 사이클에 노출시킨 균주의 생존/회수를 나타내는 그래프로서, 전분 2(0.5%)의 존재 하에 추가로 전분 1을 첨가하여 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 평가한 것.
도 13은 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨 후, 전분이 첨가되지 않은 다양한 형태의 요구르트 중에 넣은Bifidobacterium균주 C의 생존을 나타내는 그래프.
도 14는 글루코스(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 또는 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시키고 전분이 첨가된 다양한 형태의 요구르트 중에 넣은Bifidobacterium균주 C의 생존을 나타내는 그래프.
제1 양태에서, 본 발명은 성장/수확 가능성이 증가되거나, 생존율/회수율이 증가된 미생물을 제품 또는 발효물 중에 포함하는 개선된 미생물 제제에 있다.
바람직하게, 상기 제품은 식품, 사료, 뉴트로슈티칼, 약제, 생물방제 또는 생물정화 제품이다.
바람직하게, 미생물 제제는 전분, 말토스 또는 난소화성 전분을 기질로 하거나 함유하는 배지에서 성장시킨 미생물을 포함한다. 본 발명에 특히 적합한 난소화성 전분의 한 형태는 고 아밀로오스 옥수수 전분 또는 그것에 유래하는 물질을 함유하는 전분이다.
사용상 상기 제제는 제품 중의 미생물의 성장/수확 가능성 또는 생존율/회수율을 더욱 높이기 위해 부가적 난소화성 전분과 혼합할 수 있다. 가용성 전분, 말토스 또는 난소화성 전분을 기질로 하거나 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 제품에 첨가된 부가적 난소화성 전분에 미생물이 결합하는 능력이 증대되고, 따라서 미생물의 성장/수확 가능성 또는 생존율/회수율이 높아진다는 사실이 밝혀졌다.
본 발명의 제1 양태에 따른 개선된 미생물 제제 중의 미생물은 특히 폭기(aeration), 시어(sheer), 동결건조, 동결, 고-중-저 물의 활성을 포함하는 건조, 고온, 저온, 압력 및 압력 변동, pH의 고저, 담즙산, 수분, 삼투 몰농도(osmolarity)의 고저, 고농도 염, 또는 이들의 조합을 포함하는 스트레스에 내성을 갖는다.
본 발명에 따른 미생물 제제는 특히 프로바이오틱스, 종균 배양, 생물방제제 또는 생물정화제 용도에 적합하다.
제2 양태에서, 본 발명은 제품 내에 증가된 성장/수확 가능성, 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 개선된 미생물 제제의 제조 방법으로서, 난소화성 전분을 기질로 하거나 함유하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 단계 및 배양된 미생물을 수확하는 단계를 포함하는 방법에 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 제2 양태에 따른 방법으로 제조된 제품 내에 증가된 성장/수확 가능성, 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 개선된 미생물 제제에 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 성장/수확 가능성, 또는 생존율/회수율이 증가된미생물을 함유하는 제품으로서, 본 발명의 제1 또는 제3 양태에 따른 미생물 제제를 포함하는 것에 있다.
바람직하게, 상기 제품은 식품, 사료, 뉴트로슈티칼, 약제, 생물방제 또는 생물정화 제품이다.
바람직한 일 실시예에서, 상기 식품은 미생물의 성장/수확 가능성, 또는 생존율/회수율을 더욱 높이기 위해 난소화성 전분을 포함할 수도 있다.
제5 양태에서, 본 발명은 제품 내에서 성장/수확 가능성, 또는 생존율/회수율이 증가된 미생물을 제조하기 위해 난소화성 전분을 미생물 배지에 사용하는 용도에 있다.
본 발명에 특히 적합한 난소화성 전분의 한 형태는 난소화성 전분을 함유하는 전분이다. 바람직하게, 상기 전분은 적어도 40%(w/w)의 아밀로오스를 함유한다. 바람직한 형태에서 상기 전분은 아밀로오스 함량이 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 또는 적어도 90%(w/w)인 옥수수 전분이다. 상기 전분은 또한 화학적, 물리적, 또는 효소적으로 처리되거나 변성될 수 있다. 화학적 변성은 산화, 교차결합, 에테르화, 에스테르화, 산성화, 덱스트린화, 또는 이들의 조합에 의해 행해질 수 있다.
전분은 또한 다수의 물리적 또는 화학적 수단에 의해 난소화성 전분 함량을 높이도록 처리될 수 있다. 바람직한 수단 중 하나는 수분 존재 하에 전분을 열처리하는 것(열-수분 처리)으로, 이것은 감압, 대기압 또는 양압 하에 수분을 증가시킨 상태에서 가열하는 방법, 여러 가지 온도 및 압력을 통한 사이클 기법 등을 포함하는 다수의 방법으로 달성할 수 있다. 가열은 100 내지 180℃, 바람직하게는 120 내지 150℃ 수준이며, 수분은 10 내지 80%, 바람직하게는 20 내지 60% 수준이 될 수 있다. 또한 전분 중의 난소화성 전분의 함량을 증가시키기 위해 고압 가열의 반복 및 급속 냉각을 이용할 수도 있다. 이러한 방법 및 조건은 처리하는 전분 중의 난소화성 전분의 레벨을 원하는 만큼 증가시키기 위해 변경할 수 있음을 이해할 것이다.
또한 전분으로부터 지방 및/또는 미네랄을 제거하기 위해 용매 추출로 처리할 수도 있다.
본 발명에서의 용도에 적합한 프로바이오틱 미생물은 다양하며,Saccharomyces와 같은 이스트,Bifidobacterium,Bacteroides,Clostridium,Fusobacterium,Propionibacterium,Streptococcus,Enterococcus,Lactococcus,Staphylococcus,Leuconostoc,Peptostreptococcus및Lactobacillus속과 같은 박테리아 등이 포함된다. 그러나 본 발명은 이러한 특정 미생물에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 종균 배양물은 비한정적으로 락토바실루스를 포함하는 젖산 박테리아, 락토코쿠스 및 스트렙토코쿠스, 류코노스톡, 및 이스트를 포함한다.
바람직하게 생물방제 또는 생물정화 제품에 사용되는 미생물은 비피도박테리아, 애시도필루스, 진균류,Bacillus종, 슈도모나스 및 알칼리제니스 등을 포함한다. 그러나 다른 미생물종도 본 발명에 따른 용도에 적합한 후보임을 이해할 것이다.
본 발명은 또한 상호 작용하여 대장, 비관(nasal tract), 또는 질관 내에서 향상된 성장 및/또는 활성을 나타내도록 비전분 이용물을 포함하는 상이한 균주 또는 종의 미생물을 포함한다.
본 발명의 제1, 제2, 제3 및 제4 양태의 바람직한 실시예에서, 상기 미생물 제제는 액상이거나 동결 또는 건조될 수 있는 종균 배양물 또는 프로바이오틱 제제이다. 상기 제제는 또한 다른 미생물 첨가제를 함유하는 식품 및 사료 제품을 포함할 수 있다. 이들 제품은 유체계(fluid-based) 또는 고체계 제품을 포함한다. 유체계 식품은 식용 성분이 전지우유, 우유 고형분, 유지방, 크림, 탈지분유, 유제품에 사용될 수 있는 우유 유래의 다른 성분 또는 유도체를 포함하는 1종 이상의 우유를 기재로한 성분인 유제품, 수계 유체, 시리얼 및 콩을 기초로한 음료와 같은 식물 추출물 및 첨가제 등을 포함한다. 고체계 식품에는 스넥 바, 아침식사용 시리얼, 빵, 과자, 추출 식품, 뮤즐리 바, 건포도 롤 빵(bun), 비스켓, 사료용 펠렛, 코팅 식품, 정제, 식품 첨가제, 건강 보조제, 및 약물 제제 등이 포함된다.
본 발명의 제4 양태에 따른 식품에는 프로바이오틱 미생물을 함유하고 전달하는 데 적합한 임의의 식품이 포함된다. 그 예로서는 비제한적으로, 식료품, 과일 음료, 얼음, 과자, 코팅제 또는 외피제, 요구르트, 요구르트 음료, 비발효 음료, 향첨가 우유 음료, 변성 우유 음료, 아이스크림, 및 유제품 디저트 등이 포함된다.
본 발명의 제4 양태에 따른 식품, 사료, 뉴트라슈티칼 또는 약물 제품의 제조에는 당 기술분야에서 사용되는 표준 방법을 사용할 수 있다. 난소화성 전분은별도로 첨가할 수도 있고, 식품의 일부를 이루는 1종 이상의 성분과 조합하여 사용할 수도 있다. 난소화성 전분을 별도로 첨가할 경우, 난소화성 전분은 식품, 사료, 뉴트라슈티칼 또는 약물 제품 내의 다른 성분과 긍정적 효과 및/또는 상승효과를 내도록 작용할 수 있다.
제품 내에서 미생물의 생존율 증가라는 것은 난소화성 전분으로 성장시킨 미생물을 함유하지 않는 유사 제품 중의 동일한 미생물의 예상 생존율을 초과하는 증가를 말한다.
바람직한 형태에서, 난소화성 전분은 Hi-maizeTM및 Culture ProTM범주의 난소화성 전분 제품이다. 난소화성 전분은 약 0.01 내지 10%(w/w)의 농도로 배지에 사용할 수 있고, 미생물 제제를 제조하는 동안 및 액상 식품, 사료, 뉴트라슈티칼 또는 약물 제품 중에 후속하여 첨가할 수 있다. 난소화성 전분은 0.1 내지 5%(w/w)의 농도로 사용하는 것이 바람직하고, 약 1%(w/w)의 농도가 더욱 바람직하다. 난소화성 전분 및/또는 식이 섬유를 함유하는 전분은 건조 식품, 사료, 뉴트라슈티칼 또는 약물 제품, 및 미생물 제제에 제품 또는 제제 총량에 대해 약 0.1 내지 90%(w/w)의 농도로 사용할 수 있다. 상기 전분을 약 1 내지 10%(w/w)로 사용하는 것이 바람직하다.
난소화성 전분은 유체계 식품의 경우에 0.1 내지 5%w/v의 농도, 고체계 식품의 경우에 0.1 내지 15%(w/w)의 농도, 그리고 사료, 뉴트라슈티칼 또는 약물 제품의 경우에 0.1 내지 95%(w/w)의 농도로 사용하는 것이 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
난소화성 전분의 사용에 따른 추가의 이점은 식품, 사료, 뉴트라슈티칼 또는 약물 제품을 처리하는 동안 임의의 단계에서 부가적 난소화성 전분을 첨가할 수 있다는 점이다. 난소화성 전분의 물성은 처리 제품을 제조하는 데 관련되는 공정에 의해 불리한 영향을 받지 않는다. 하나의 명백한 이점은 공정의 종말에 난소화성 전분을 무균 형태로 첨가할 필요가 없다는 것이다. 제품은 전분의 물성에 불리한 영향의 우려가 없이 저온살균 등으로 처리할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "난소화성 전분(resistant starch)"에는 Brown, McNaught 및 Moloney(1995) Food Australia 47: 272-275에 정의된 RS1, RS2, RS3 및 RS4로 지정되는 형태가 포함된다. 본 발명에는 변성 또는 비변성 난소화성 전분 또는 그 혼합물 중 어느 것이나 사용될 수 있다.
WO 94/03049 및 W0 94/14342에는 아밀로오스 함량이 50%(w/w) 이상, 특히 80%(w/w) 이상인 옥수수 전분, 아밀로오스 함량이 27%(w/w) 이상인 쌀 전분, 또는 35%(w/w) 이상인 밀 전분을 포함하는 난소화성 전분인 고 아밀로오스 전분이 기재되어 있다. 또한, 아밀로오스 함량이 50% 이상이고 난소화성 전분 함량이 높은 특별한 과립 크기의 전분으로서 옥수수, 보리 및 콩을 포함하는 것이 기재되어 있다. 그러나 본 발명은 이러한 형태의 난소화성 전분에 한정되지 않는다. 예를 들면 바나나 및 감자와 같은 줄기식물 등의 원료에 유래하는 다른 형태의 난소화성 전분 및 그의 변성 형태가 포함된다.
적합한 화학적 처리로는 산화반응, 교차결합, 에테르화, 에스테르화, 산성화, 덱스트린화 등의 화학적 변성이 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 다른 변성 방법이 당업자에게 잘 알려진 물리적, 효소적 또는 다른 수단에 의해 유도될 수 있다.
또한 전분의 구조 또는 조직을 변경함으로써 난소화성 전분의 효소 감수성의 정도를 조절하는 것이 유용할 수도 있다. 예로써, 2작용성 시약, 열/수분 처리 및 열적 어닐링을 이용하는 교차결합 및 산이나 효소 희석(enzyme thinning)을 들 수 있다. 전분의 변성은 전분의 결정성을 조작함으로써 행할 수도 있다. 그러한 변성 방법은 공지되어 있으며 이 방법으로 제조된 전분은 본 발명에 적합할 것이다.
난소화성 전분은 옥수수(maize)로부터 유래되거나 얻어지는 것이 바람직하다. 그러나, 난소화성 전분의 다른 원료도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면 수수, 밀, 보리, 귀리, 쌀 등의 시리얼, 감자와 타피오카와 같은 줄기식물, 완두콩과 같은 콩류, 및 기타 유전학적으로 변성된 식물종에 유래하는 전분이 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 Hi-maizeTM및 Culture ProTM은 Starch Australasia Limited 제품으로서 70% 이상의 아밀로오스를 함유하는 고 아밀로오스 전분으로부터 제조된 제품을 가리킨다. 본 발명에 적합한 난소화성 전분 함유 고 아밀로오스 전분은 AU 660560에 제시되어 있다.
본 명세서를 통해 전후 관계상 달리 요구되지 않는 한 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)"나 "포함하는(comprising)"과 같은 단어는 언급된 성분, 정수나 단계, 또는 복수의 성분, 정수나 단계를 의미하되, 다른 성분, 정수나단계, 또는 복수의 성분, 정수나 단계를 배제하는 것은 아님을 이해할 것이다.
본 발명의 보다 명확한 이해를 위하여 이하에서 실시예 및 도면을 참고로 바람직한 형태를 설명한다.
본 발명자들은 난소화성 전분을 미생물 배지에 봉입하고 선택적으로 난소화성 전분 성장 미생물을 함유하는 미생물 제제의 후속 제조 단계에 첨가함으로써 제제 및 제품의 제조 및 저장 중 미생물의 성장, 회수 및/또는 생존율이 놀랍고도 예상외의 증가를 가져옴을 발견하였다.
실시예 1
비피도박테리움 균주 LaftiTM13B를 1%(w/w)의 글루코스 또는 난소화성 전분(Culture ProTM)으로 보충한 한천 기초 배지(BM) 상에서 혐기성 방식으로 성장시켰다. 성장 후의 세포를 인산완충 식염수(PBS)를 사용하여 플레이트로부터 수확하고, 분획을 PBS 또는 과립상 전분(10% w/w)을 함유하는 PBS와 혼합하였다. 혼합물 중의 분획을 동결 건조시켰다. 동결 건조하기 전에 상기 세균성 혼합물을 pH 3.5에서 글리신 완충액에 첨가하고 동결 건조 후 재수화시킴으로써 낮은 pH에 대한 LaftiTM13B 세포의 감수성을 평가하였다. 트립톤 이스트 추출 펩톤 플레이트(TYP: Tryptone Yeast Extract Peptone plates)를 사용하여 pH 3.5에 첨가하였을 때와 3시간 후에 콜로니 형성 단위를 측정하여 생존 세포의 수를 세었다. 3시간 경과에 따른 생존율의 감소를 표 1에 제시한다. 전분 존재 하에 성장시킨 세포의 내성이 더 크고 전분의 봉입이 그 내성을 더욱 높이는 것으로 나타났다.
[표 1]Bifidobacterium세포의 3시간 경과 시 생존율 감소
성장 후 전분의 존재 생존율의 감소
글루코스로 성장시킨 세포 - 26 x 102
글루코스로 성장시킨 세포 + 15 x 102
전분으로 성장시킨 세포 - 26
전분으로 성장시킨 세포 + 5
실시예 2
비피도박테리움 균주 LaftiTM13B를 1%(w/v) 글루코스 또는 고 아밀로오스 옥수수 전분 과립(Culture ProTM)으로 보충한 기초 배지(BM)에서 예비 배양하였다. 혐기성 방식으로 성장시킨 배양균을 1%(w/v) 글루코스 또는 Culture ProTM을 공통적으로 함유하는 BM 한천 상 또는 배양액(broth) 중에 접종하였다(10 ㎕). 플레이트에 점 접종 또는 살포하고 나서 혐기성 방식으로 48시간 배양하였다. 배양액에서의 성장 또는 살포 플레이트로부터 수확한 세포를 콜로니 형성 유닛(CFU)을 헤아려 정량화하였다. 점 접종시킨 플레이트 상의 성장에 관하여, 콜로니의 크기를 측정하고 비피도박테리움 세포에 의해 전분의 활용의 지표가 되는 콜로니 주위의 투명대(cleared zone)의 크기를 측정하여 정량화하였다. LaftiTM13B는 전분 함유 배지를 사용하여 예비 배향한 경우 전분 함유 배지 상에서 더욱 빨리 성장하며 전분을 함유한 한천 플레이트 상에서 더 큰 콜로니와 투명대를 생성하는 것으로 나타났다. 또한, 대조군 배양액(글루코스) 및 전분 배양액 모두에서 예비 배양된 세포에 있어서, 글루코스 배지에 비하여 전분 함유 배지로부터의 수율이 더 높았다.
결과
전분 존재 하에 성장시킨 후의 생존하는 미생물의 회수가 글루코스 대조군보다 더 높고 빨랐다.
예를 들면 낮은 pH, 담즙산, 산, 열, 수분, 압력, 동결 건조, 분무 건조, 등의 스트레스 조건의 단독 또는 조합에 노출된 후 전분 배지에서의 성장이 미생물수율을 높였다.
전분 배지에서 성장시키기 전에 전분 배지에서 예비 배양시키는 것이 위에서 예시한 스트레스 조건에 노출된 후 회수율/생존율을 높이는 동시에 수율을 높였다.
전분 배지에서 성장시킨 후 전분을 첨가시키는 것이 위에서 예시한 스트레스 조건에 대한 내성을 높였다.
난소화성 전분을 함유하는 두 가지 전분, 즉 과립형 고 아밀로오스 옥수수 전분인 전분 1(난소화성 전분 약 20%(w/w)) 및 전분 2(난소화성 전분 약 60%(w/w)), 그리고 균주 A, B, C, D, E 및 F로 지칭되는 일정 갯수의Bifidobacterium균주를 사용한 실시예에 따라 본 발명을 더욱 예시한다.
실시예 3
천연 과립형 옥수수 전분의 존재 하에Bifidobacterium균주 D,Bifidobacterium균주 E 및Bifidobacterium균주 C의 성장과 수율을 연구하였다. 전분의 예비 배양균을 20ml PYG 배양액에서 18시간 동안 성장시키고, 글루코스(0.5%), 전분 1(0.5%), 전분 2(0.5%), 또는 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%)의 혼합물을 함유하는 PY 성장 배지 20ml에 접종(0.1ml 분획)하는 데 사용하였다. 상기 배양균을 37℃ 혐기성 체임버에서 배양하고, 배양균 ml당 콜로니 형성 유닛(CFU/ml-1)으로 측정되는 생존 가능 세포의 수를 모니터하기 위해 0, 4, 7, 12, 24, 31, 48, 및 72 시간의 시점에 샘플링하였다.Bifidobacterium균주 D에 대한 도 1에 제시된 결과는 0.25% 글루코스와 함께 전분1(0.25%)을 봉입한 것이 0.5% 글루코스 단독의 경우에 비해 균주 D의 높은 성장 및 수율을 가져온 것을 나타낸다.Bifidobacterium균주 E에 있어서(도 2), 글루코스 대조군에 비해 전분 2 배양액에서 성장이 더 빨랐다. 균주 E에 대한 성장은 또한 글루코스 대조군에 비해 전분 1+글루코스 배양액에서도 높았다.Bifidobacterium균주 C에 대해서는 상이한 성장 패턴과 수율이 나타났다. 도 3에 제시된 바와 같이, 여러 가지 배양액에 대해 성장율은 뚜렷하게 다르지 않지만, 이 균주를 글루코스 중에 성장시킨 경우 약 18시간 시점에서 최대 수율이 얻어진 후 급속히 사멸하였다. 전분 1 또는 전분 2를 봉입한 경우에 균주는 높은 수율을 유지하였다.
실시예 4
글루코스(0.5%), 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C에 대해 식품 중의 전분 배양 미생물의 생존/회수를 평가하였다. 비피도박테리움 세포를 40시간 동안의 혐기성 배양 후 수집하고 식품 중에 희석하여 식품 ml당 약 105CFU의 수율을 얻었다. 시험 대상으로 한 식품에는 오렌지 쥬스, 프로바이오틱계 음료 및 요구르트형 발효 유제품이 포함되었다.Bifidobacterium균주 C 세포를 함유하는 식품을 실온(가속화 저장 조건을 위함)에 저장하고 0, 1, 2, 5 및 6일의 시점에 샘플링하여Bifidobacterium균주 C 세포의 생존을 정량화하였다. 도 4에 나타낸 결과를 보면, 균주를 전분 1 또는 전분 2 존재 하에 사전 배양한 경우 프로바이오틱계 음료에서 균주 C의 생존율이 높았다. 마찬가지로, 전분 배양 세포에 대한 요구르트형 발효 유제품(도 5) 및 오렌지 쥬스(도 6)에서도 균주 C의 높은 생존율이 확인되었다.
실시예 5
난소화성 전분 존재 하에 배양된 미생물에 부가적인 난소화성 전분을 봉입하는 것이 그 미생물을 식품에 첨가하였을 때 생존율이 높아졌다. 이것은 글루코스(0.5%), 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C를 사용하여 조사되었다. 비피도박테리움 세포를 40시간 동안의 혐기성 배양 후 수집하여 2.5% 전분 1에 1시간 동안 혼합하였다. 이어서 균주 세포와 전분 과립의 혼합물을 원심분리하여 수집하고 식품에 첨가하여 식품 ml당 약 105CFU의 수율을 얻었다. 시험 대상으로 한 식품에는 오렌지 쥬스, 프로바이오틱계 음료 및 요구르트형 발효 유제품이 포함되었다. 부가적인 전분이 첨가된Bifidobacterium균주 C 세포를 함유하는 식품을 실온(가속화 저장 조건을 위함)에 저장하고 0, 1, 2, 5 및 6일의 시점에 샘플링하여Bifidobacterium균주 C 세포의 생존을 정량화하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, 부가적 전분 1을 봉입한 것이 프로바이오틱계 음료에 있어서, 그리고 도 8에 나타낸 바와 같이 요구르트형 발효 유제품에 있어서, 사용된 성장 배지에 무관하게 박테리아의 생존을 연장하였다. 부가적인 전분은 오렌지 쥬스에 있어서도 균주 C의 생존을 연장시켰다(도 9).
실시예 6
Bifidobacterium균주 C를 사용하여, 무게 20g의 암컷 생쥐의 식도로 위장까지 관 삽입으로 글루코스 기재 플레이트 또는 전분 1 또는 전분 2 기재 플레이트로부터 수확한 세포의 현탁액을 주입하였다. 상기 세균성 현탁액은 희석제 ml당 약 108에 해당하는 일관된 광학 밀도로 표준화하였다. 새로 배출한 변 샘플 중의 비피도박테리움 세포의 수를 PAM 한천 플레이트를 사용하여 세고 PCR을 사용하여 동질성을 확인하였다. 변 샘플은 비피도박테리움 투여 후 4, 10, 24 및 48시간 경과 시 채집하였다. 글루코스 배양 세포로 투여된 생쥐에서는 비피도박테리움 세포가 검출되지 않았다(표 2). 전분 1 한천 상에서 배양된 균주 C로 투여된 생쥐는 경구 투여 후 4시간 및 10시간 후 검출하였을 때 변 1g당 약 log 7 CFU이었다. 24시간 및 48시간 샘플에서는 그 수가 감소하였으나 여전히 검출되었다. 전분 2 한천 상에서 배양된Bifidobacterium균주 C를 생쥐에게 식도로 위장까지 투여한 경우, 투여 후 4시간 및 10시간에 변 1g당 약 log 8 CFU가 검출되었고, 24시간 및 48시간 샘플에서는 감소하였다. 난소화성 전분 기재의 한천 상에서 배양하는 것이 생체내 조건에 대한 내성이 큰 비피도박테리움 세포를 제공한다는 결론을 얻었다.
[표 2] 글루코스 한천, 전분 1 한천 또는 전분 2 한천 상에서 배양된Bifidobacterium균주 C를 경구 식도를 통해 투여한 생쥐의 새로 받아낸 변으로부터Bifidobacterium균주 C의 회수
투여 후 시간(h) 글루코스 한천 배지(습윤중량 g당 CFU) 전분 1 한천 배지(습윤중량 g당 CFU) 전분 2 한천 배지(습윤중량 g당 CFU)
4 ND 5.8 x 106 2.5 x 108
10 ND 2.5 x 107 6.0 x 107
24 ND ＞106 ＞106
48 ND ＞105 ＞105
ND : 검출되지 않았음
실시예 7
난소화성 전분 존재 하에 배양된 미생물은 비피도박테리움 균주를 난소화성 전분 존재 하에 성장시킨 후 동결-해동 사이클에 노출시킨 이하의 실시예에 예시된 바와 같이 물리적 스트레스에 내성이 더 큰 것으로 나타났다.Bifidobacterium균주 C는 글루코스(0.5%), 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시켰다. 상기 비피도박테리움 세포를 40시간에 걸친 혐기성 성장 후 수집하고 그 샘플을 2분하였다. 샘플 하나는 바로 동결하였고(-20℃), 다른 하나는 1시간 동안 2.5% 전분 1과 혼합하였다. 이어서 세포와 전분 과립의 혼합물을 원심분리하여 수집하고 또한 -20℃로 동결시켰다. 샘플을 4일간 매일 실온에서 해동하는 과정을 포함하는 동결-해동 사이클의 0, 1, 2, 3 및 4시간 경과 후 생존 가능한 비피도박테리움 세포를 정량화하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, 물리적 스트레스에 노출하기 전에 난소화성 전분 존재 하에 성장시키는 것이 비피도박테리움의 생존율을 높였다. 또한, 동결 전에 난소화성 전분을 추가하는 것이 비피도박테리움 세포의 생존율을 더욱 향상하였다(도 11 및 도 12).
실시예 8
난소화성 전분 존재 하에 성장시키고, 이어서 높은 온도에서 저장하기 전에 동결 건조시킨 박테리아가 전분 없는 상태에서 성장시킨 것에 비해 높은 온도에서 더 큰 내성을 가졌다. 3종의Bifidobacterium균주 A, B 및 D를 pH 조절하면서 각각 발효조에서 성장시켰다. 세포 생체물질을 수확하고 동결 건조시켰다. 이어서, 건조된 분말을 42℃에서 7일간 저장하고 매일 4일간 샘플링 한 후, 7일째 생존 가능한 비피도박테리아를 정량화하였다. 그 결과를 건조 분말 1g당 콜로니 형성 유닛으로 표현하였다. 표 3에 제시한 바와 같이, 전분 1 존재 하에 성장시킨 세포가 난소화성 전분 없는 상태에서 성장시킨 것보다 양호한 생존율을 보이거나, 더 높은 수준의 회수율을 나타냈다.
[표 3] 동결건조된Bifidobacterium균주 A, B 및 C의 42℃ 배양에서의 생존
시간(d) 균주 A 균주 B 균주 C
전분 미사용 전분 사용 전분 미사용 전분 사용 전분 미사용 전분 사용
0 10.52 10.59 10.58 10.56 10.65 10.58
1 10.30 10.23 10.23 10.40 10.11 10.20
2 9.11 10.11 7.83 10.08 7.76 9.83
3 7.26 10.00 5.00 9.53 5.00 8.53
4 4.60 9.48 4.00 8.08 4.00 5.68
7 0.00 8.04 0.00 0.00 0.00 1.30
실시예 9
Clostridium butyricum을 전분 첨가되지 않은 배양액에서 성장시킨 후 그 생존을 모니터하였다. 새포를 수확하고 전분 1을 2.5%, 전분 2를 2.5%, 셀룰로스를2.5%, 또는 전분3을 2.5% 함유하는 pH 3.8 완충액 중에 재현탁하고, 3시간 후 얻어진 생존 가능 세포를 정량화하였다. 그 결과를 초기 생존 가능 개체수에 대한 백분율로 표현한다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 전분 2의 존재가 생존을 높였다. 셀룰로스는 난소화성 전분의 경우에 볼 수 있었던 생존율 저하에 대한 보호가 없었다.
[표 4] 난소화성 전분이 없는 상태로 성장시킨 후 pH 3.8의 완충액에 현탁시킨 2.5%의 전분 1, 2 또는 3과 혼합한Clostridium butyricum의 생존율. pH 3.8에 노출시키고 3시간 후에 생존율의 저하를 모니터하였다.
전분 첨가 구분 pH 3.8에서 3시간 후 생존 백분율
전분 미첨가 80.5
전분 1 71.3
전분 2 111.3
셀룰로스 ND
전분 3 66.0
ND = 검출되지 않았음
실시예 10
다당류와 같은 식품 성분들과 난소화성 전분 존재 하에 성장시킬 경우 및/또는 추가의 난소화성 전분이 미생물에 봉입될 경우 미생물의 생존율을 높이는 효과 사이에는 상승 효과가 있는 것으로 나타났다. 이것은 글루코스(0.5%), 전분 1(0.25%)+글루코스(0.25%), 전분 2(0.5%), 또는 전분 2(0.25%)+글루코스(0.25%)의 존재 하에 성장시킨Bifidobacterium균주 C의 성장으로 입증할 수 있다. 40시간에 걸친 혐기성 성장 후 비피도박테리움 세포를 수집하고 그 샘플을 2분하였다. 샘플 중 하나는 바로 사용하였고, 다른 하나는 1시간 동안 2.5% 전분 1과 혼합하였다. 이어서 세포 단독 또는 세포와 전분 과립의 혼합물을 원심분리하여 수집하고, 요구르트형 발효유 중에 재현탁하고 이것을 다시 실온에서 저장하고, 0, 1, 2, 5 및 6일에 각각 샘플링하여 생존 가능한 비피도박테리움을 테스트하였다. 도 13 및 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 요구르트 B 중의 다당류의 존재와 난소화성 전분의 존재 하의 성장 사이에는 글루코스에 비하여 명백한 상승 효과가 있었다.
실시예 11
박테리아 새포가 표면에 부착된 것이 부착되지 않은 세포보다 스트레스 조건에 양호하게 생존하는 것을 입증하였다. 이 실시예에서 난소화성 전분 1에서 성장시킨 비피도박테리움 세포가 전분 1 과립에 부착한 것이 글루코스 배양 세포가 나타낸 것보다 2배 양호한 것으로 밝혀졌다.Bifidobacterium균주 C의 세포를 PYG에서 24시간 성장시키고 원심분리에 의해 수확한 후 pH 7.0 또는 pH 2.5에서 2.5% 전분 1 용액 중에 재현탁하였다. 1시간 동안의 배양 후, 전분 과립에 대한 부착을 평가하고 이어서 pH를 7.0에서 2.5로, 또한 2.5에서 7.0으로 바꾸었다. 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 균주 C의 세포는 pH 7.0에서 잘 부착되었으나 pH 2.5에서는 그렇지 않았으며, pH를 7.0에서 2.5로 바꾸었을 때 세포는 부착한 상태를 유지한 반면 pH를 2.5에서 7.0으로 올렸을 때는 부착이 증가되었다.
[표 5] Bifidobacterium 균주 C가 전분 1에 부착하는 데 대한 pH 효과
1h 배양 후 측정 2h 배양 후 측정
pH 부착(%) pH 부착(%)
7.02.5 88.818.3 7.02.5 86.713.4
7.02.5 88.119.51 2.5로 pH 변화6.8로 pH 변화 75.572.8
용도
(i) 본 발명은 예방제 및 치료제로서의 용도 뿐 아니라 숙주에게 유익함을 제공하기 위한 식품 및 사료 조성물에서의 용도를 포함하여 프로바이오틱 미생물이 사용될 수 있는 경우에 적용할 수 있다.
(ⅱ) 본 발명은 비강 및 질관과 같은 비소화관 적용을 위해 프로바이오틱 미생물이 사용될 수 있는 경우에 적용할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명은 생물방제 및 생물정화와 관련되는 경우에 적용할 수 있다.
(ⅳ) 프로바이오틱 미생물은 전분계 배지에서 성장시킬 수 있고, 성장 후 직접 사용하거나 추가의 전분과 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 프로바이오틱 현탁액은 직접 사용하거나, 추가의 첨가제가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 동결 및/또는 건조시킨 후 사용할 수 있다.
(ⅴ) 상기 (ⅱ)에 기재된 프로바이오틱 미생물은 제조 도중 또는 완결 시에 식품 및 사료에 첨가될 수 있다.
(ⅵ) 상기 (ⅲ)에 기재된 식품 및 사료에 부가하여, 또한 전분을 프로바이오틱 미생물의 첨가 전 또는 첨가 후에 식품 또는 사료에 첨가할 수 있다.
(ⅶ) 본 발명은 또한 발효 식품의 제조에 사용되는 종균 배양물을 포함하는미생물에 적용되며, 이들 미생물을 전분계 배지에서 성장시키고 성장 후 선택적으로 추가의 전분과 혼합하여 동결 및/또는 건조시킴으로써 미생물의 생존율을 높인다. 이들 미생물이 하나의 성분으로 식품에 첨가될 경우, 제조 전, 제조 도중, 또는 제조 후에 부가적인 전분을 그 식품에 첨가할 수 있다.
본 발명은 젖산 박테리아 및 비피도박테리아와 같은 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 많은 다양한 미생물에 있어서, 고형물 제제 및 액상 제제에서 배지 내에 난소화성 전분의 존재가
미생물의 성장 및/또는 수율을 증가시킬 수 있고;
식품, 뉴트라슈티칼 및/또는 기능성 식품을 포함한 건강 식품, 건강보조제, 유아와 노인을 위해 만들어진 식품 및 식품 제형, 약물 제품, 소장(小腸) 내 공급 제제와 같은 의료용 식품, 애완동물용 사료, 수중 생물, 조류용 사료와 보조제, 스포츠 및 능력강화 식품 및 보조제에 있는 미생물의 생존율 또는 회수율을 증가시킬 수 있다는 사실을 포괄한다.
제시된 실시예가 주로 식품 및 프로바이오틱 제품에 관한 것이지만, 예를 들면 생물방제 및 생물정화 등의 다른 용도에 유용한 다른 미생물도 성장/수확 가능성 또는 생존율/회수율을 증가시킬 수 있음을 이해할 것이다.
성장 후 미생물에 부가적 난소화성 전분을 첨가할 경우, 성장율 및 생존율을 높일 수 있으며, 난소화성 전분 없이 성장시킨 세포에 첨가하고 이어서 전분과 혼합한 경우에도 그러하다.
또한, 난소화성 전분 존재하에 성장시킨 미생물은 폭기, 전단, 동결, 건조,동결건조, 고온, 저온, 온도의 변화, 압력의 변화, 고압, 저압, 낮은 pH, 높은 pH, 수분, 생체내 조건 등의 스트레스에 더 큰 내성을 갖는다.
RS1, RS2, RS3 및 RS4형을 포함하는 난소화성 전분은 난소화성 전분을 함유하는 천연 전분 및/또는 화학적 변성과 효소적 변성을 모두 포함하는 그 변성물, 및/또는 그 혼합물일 수 있다. 실시예에서는 두 가지 상이한 전분을 사용하였으나, 당업자는 다른 형태의 난소화성 전분도 본 발명의 용도에 적합함을 이해할 것이다.
앞에서 제시한 성장/수확 및/또는 생존 또는 회수의 제고는 또한 미생물 제제의 제조 및 저장에도 적용된다.
부가하여, 미생물의 성장/수확 및/또는 생존 또는 회수를 모니터하면 놀랍게도 이당류, 올리고당류 및 다당류를 포함하는 다른 식품 성분과의 상승 효과를 확인할 수 있다. 단백질과 지방과 같은 다른 식품 성분도 상승작용을 할 수 있음을 이해할 것이다.
또한 난소화성 전분 배양 세포가 전분 과립에 더 잘 부착하며 따라서 더욱 양호한 생존 또는 회수를 보장하는 것을 알았다. 난소화성 전분은 낮은 소화율을 가지기 때문에 단백질 및 지질을 포함하는 다른 비소화성 화합물도 미생물의 성장/수확 및/또는 생존 또는 회수를 높여줄 수 있음을 이해할 것이다.
종래의 기술은 프로바이오틱 조성물 내의 난소화성 전분의 존재는 프로바이오틱 미생물이 소비되는 동안 및 소비된 후 그 미생물의 생존율을 높여줌을 제시하였다(AU 687253). 본 출원인에 의한 종래의 이 특허는 부가적 전분을 첨가한 비피도박테리아를 사용한 데이터를 제시하고 있다. 반면에 본 발명은 난소화성 전분 배양 세포가 추가의 전분을 첨가하지 않고 더욱 강건하다는 예상 외의 발견에 따른 것이다. 놀랍게도, 미생물을 난소화성 전분 존재 하에 성장시키코, 선택적으로 전분 배양 세포에 부가적 전분을 첨가하면, 미생물의 성장/수확 및/또는 생존 또는 회수가 향상된다. 즉, 난소화성 전분의 존재 하에 성장시킨 미생물 세포가 더욱 강건하다. 또한, 전분이 없는 상태로 성장시킨 세포에 난소화성 전분을 첨가하면 그 세포의 강건함을 높일 수 있다.
당업자는 특정한 실시예에 제시된 본 발명에 대하여 폭넓게 기재된 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않고 많은 변경 및/또는 변형을 이룰 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 실시예는 모든 점에서 예시적인 것이며 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.

Claims (75)

  1. 제품 내에서 증가된 성장/수확 가능성 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 미생물 제제로서,
    난소화성 전분(resistant starch)을 기질로 하거나 난소화성 전분을 함유하는 배지에서 성장 또는 배양시킨 미생물을 포함하는 미생물 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제품이 식품, 사료, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 약품, 생물방제(biocontrol), 및 생물정화(bioremediation) 제품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    난소화성 전분을 추가로 포함하는 미생물 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 RS1, RS2, RS3 또는 RS4형인 미생물 제제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수, 쌀, 보리, 밀, 콩, 감자, 및 바나나로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전분에서 유래하는 미생물 제제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 적어도 40%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 전분에서 유래하는 미생물 제제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수 전분에서 유래하는 미생물 제제.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 70%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 제제.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 80%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 제제.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 90%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 제제.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전분이 화학적, 물리적, 및/또는 효소적으로 처리되거나 변성되는 미생물 제제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 화학적 변성이 산화, 교차결합(cross bonding), 에테르화, 에스테르화, 산성화, 덱스트린화, 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 제제.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 물리적 처리가 전분의 난소화성 전분 함량을 높이거나 또는 증가시키기 위한 열-수분 처리인 미생물 제제.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 처리가 전분으로부터 지방 및/또는 미네랄을 제거하기 위한 용매 추출에 의한 것인 미생물 제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    사용 시 상기 미생물이 폭기(aeration), 시어(sheer), 동결건조, 동결, 고-중-저 물의 활성을 포함하는 건조, 고온, 저온, 압력 및 압력 변동, pH의 고저, 담즙산, 수분, 삼투 몰농도(osmolarity)의 고저, 고농도 염, 또는 이들의 조합을 포함하는 스트레스에 실질적으로 내성을 갖는 미생물 제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로바이오틱, 종균 배양물(starter culture), 생물방제 또는 생물정화 제품인 미생물 제제.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 미생물이Saccharomyces, Bifidobacterium,Bacteroides,Clostridium,Fusobacterium,Propionibacterium,Streptococcus,Enterococcus,Lactococcus,Staphylococcus,Peptostreptococcus및Lactobacillus속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로바이오틱 미생물인 미생물 제제.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 미생물이 락토바실루스를 포함하는 락트산 박테리아, 락토코쿠스, 스트렙토코쿠스, 류코노스톡, 및 이스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종균 배양물인 미생물 제제.
  19. 재16항에 있어서,
    상기 미생물이 비피도박테리아, 애시도필루스, 진균,Bacillus종, 슈도모나스(pseudomonads) 및 알칼리제니스(Alcaligenes)로 이루어지는 군으로부터 선택되며 생물방제 또는 생물정화용에 적합한 미생물 제제.
  20. 제품 내에서 증가된 성장/수확 가능성 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 미생물 제제를 제조하는 방법으로서,
    난소화성 전분을 기질로 하거나 난소화성 전분을 함유하는 배지에서 미생물을 성장시키거나 배양하는 단계 및 배양된 미생물을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제품이 식품, 사료, 뉴트라슈티칼, 약품, 생물방제, 및 생물정화 제품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 제제의 제조 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 RS1, RS2, RS3 또는 RS4형인 미생물 제제의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수, 쌀, 보리, 밀, 콩, 감자, 및 바나나로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전분에서 유래하는 미생물 제제의 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 적어도 40%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 전분에서 유래하는 미생물 제제의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수 전분에서 유래하는 미생물 제제의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 70%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 제제의 제조 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 80%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 제제의 제조 방법.
  28. 제25항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 90%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 제제의 제조 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전분이 화학적, 물리적, 및/또는 효소적으로 처리되거나 변성되는 미생물 제제의 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 화학적 변성이 산화, 교차결합, 에테르화, 에스테르화, 산성화, 덱스트린화, 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 제제의 제조 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 물리적 처리가 전분의 난소화성 전분 함량을 높이거나 또는 증가시키기 위한 열-수분 처리인 미생물 제제의 제조 방법.
  32. 제29항에 있어서,
    상기 처리가 전분으로부터 지방 및/또는 미네랄을 제거하기 위한 용매 추출에 의한 것인 미생물 제제의 제조 방법.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 농도 0.01 내지 10%(w/w)로 배지에서 사용되는 미생물제제의 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 농도 0.1 내지 5%(w/w)로 배지에서 사용되는 미생물 제제의 제조 방법.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 농도 1%(w/w)로 배지에서 사용되는 미생물 제제의 제조 방법.
  36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    사용 시 상기 미생물이 폭기, 시어, 동결건조, 동결, 고-중-저 물의 활성을 포함하는 건조, 고온, 저온, 압력 및 압력 변동, pH의 고저, 담즙산, 수분, 삼투 몰농도의 고저, 고농도 염, 또는 이들의 조합을 포함하는 스트레스에 내성을 갖는 미생물 제제의 제조 방법.
  37. 제20항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물 제제가 프로바이오틱, 종균 배양물, 생물방제 또는 생물정화 제품인 미생물 제제의 제조 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 미생물이Saccharomyces, Bifidobacterium,Bacteroides,Clostridium,Fusobacterium,Propionibacterium,Streptococcus,Enterococcus,Lactococcus,Staphylococcus,Peptostreptococcus및Lactobacillus로 이루어지는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 프로바이오틱 미생물인 미생물 제제의 제조 방법.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 미생물이 락토바실루스를 포함하는 락트산 박테리아, 락토코쿠스, 스트렙토코쿠스, 류코노스톡, 및 이스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종균 배양물인 미생물 제제의 제조 방법.
  40. 제37항에 있어서,
    상기 미생물이 비피도박테리아, 애시도필루스, 진균,Bacillus종, 슈도모나스 및 알칼리젠스로 이루어지는 군으로부터 선택되며 생물방제 또는 생물정화용에 적합한 미생물 제제의 제조 방법.
  41. 제품 내에서 증가된 성장/수확 가능성 또는 증가된 생존율/회수율을 가지며,
    제20항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 제조되는 미생물 제제.
  42. 증가된 성장/수확 가능성 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 미생물을 함유하는 제품으로서,
    제1항 내지 제19항, 및 제41항 중 어느 한 항에 따른 미생물 제제를 포함하는 제품.
  43. 제42항에 있어서,
    식품, 사료, 뉴트라슈티칼, 약품, 생물방제 및 생물정화 제품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 함유 제품.
  44. 제43항에 있어서,
    식품, 사료, 뉴트라슈티칼, 또는 약품으로서, 유체계(fluid-based) 식품, 수계(water-based) 유체, 시리얼 및 식물계(plant-based) 식품, 고체계 식품, 정제(tablet), 식품 첨가물, 건강 보조제, 및 약물 제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 함유 제품.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 유체계 식품이, 식용 성분으로 전지 우유(whole milk), 고형 우유, 유지방, 크림, 탈지 분유, 유제품 용도에 적합한 다른 성분 또는 우유 유도체를 포함하는 1종 이상의 우유를 기재로 한 성분인 우유계 제품을 포함하는 미생물 함유 제품.
  46. 제44항에 있어서,
    상기 고체계 식품이 스넥 바, 아침식사용 시리얼, 빵, 과자, 추출 식품, 뮤즐리 바, 건포도 롤 빵(bun), 비스켓, 사료 펠렛, 코팅 식품을 포함하는 미생물 함유 제품.
  47. 제43항에 있어서,
    프로바이오틱 미생물을 함유하고 전달하는 데 적합한 식품인 미생물 함유 제품.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 식품이 식료품, 과일 음료, 얼음, 과자, 코팅제 또는 외피제, 요구르트, 요구르트 음료, 비발효 음료, 향첨가 우유 음료, 변성 우유 음료, 아이스크림, 및 유제품 디저트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 함유 제품.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    난소화성 전분을 추가로 포함하는 미생물 함유 제품.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 RS1, RS2, RS3 또는 RS4형인 미생물 함유 제품.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수, 쌀, 보리, 밀, 콩, 감자, 및 바나나로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전분에서 유래하는 미생물 함유 제품.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 적어도 40%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 전분에서 유래하는 미생물 함유 제품.
  53. 제51항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수 전분에서 유래하는 미생물 함유 제품.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 70%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 함유 제품.
  55. 제53항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 80%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 함유 제품.
  56. 제53항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 90%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 미생물 함유 제품.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전분이 화학적, 물리적, 및/또는 효소적으로 처리되거나 변성되는 미생물 함유 제품.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 화학적 변성이 산화, 교차결합, 에테르화, 에스테르화, 산성화, 덱스트린화, 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물 함유 제품.
  59. 제57항에 있어서,
    상기 물리적 처리가 전분의 난소화성 전분 함량을 높이거나 또는 증가시키기 위한 열-수분 처리인 미생물 함유 제품.
  60. 제57항에 있어서,
    상기 처리가 전분으로부터 지방 및/또는 미네랄을 제거하기 위한 용매 추출에 의한 것인 미생물 함유 제품.
  61. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 총 제품의 0.1 내지 90%(w/w)의 농도로 첨가되는 미생물 함유 제품.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 1 내지 10%(w/w)로 사용되는 미생물 함유 제품.
  63. 제품 내에서 증가된 성장/수확 가능성 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 미생물을 제조하기 위한 미생물 배양 배지에 사용하는 난소화성 전분의 용도.
  64. 제63항에 있어서,
    상기 제품이 식품, 사료, 뉴트라슈티칼, 약품, 생물방제, 및 생물정화 제품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 난소화성 전분의 용도.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 RS1, RS2, RS3 또는 RS4형인 난소화성 전분의 용도.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수, 쌀, 보리, 밀, 콩, 감자, 및 바나나로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전분에서 유래하는 난소화성 전분의 용도.
  67. 제66항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 적어도 40%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 전분에서 유래하는 난소화성 전분의 용도.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 난소화성 전분이 옥수수 전분에서 유래하는 난소화성 전분의 용도.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 70%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 난소화성 전분의 용도.
  70. 제68항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 80%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 난소화성 전분의 용도.
  71. 제68항에 있어서,
    상기 옥수수 전분이 적어도 90%(w/w)의 아밀로오스 함량을 갖는 난소화성 전분의 용도.
  72. 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전분이 화학적, 물리적, 및/또는 효소적으로 처리되거나 변성되는 난소화성 전분의 용도.
  73. 제72항에 있어서,
    상기 화학적 변성이 산화, 교차결합, 에테르화, 에스테르화, 산성화, 덱스트린화, 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 난소화성 전분의 용도.
  74. 제72항에 있어서,
    상기 물리적 처리가 전분의 난소화성 전분 함량을 높이거나 또는 증가시키기 위한 열-수분 처리인 난소화성 전분의 용도.
  75. 제72항에 있어서,
    상기 처리가 전분으로부터 지방 및/또는 미네랄을 제거하기 위한 용매 추출에 의한 것인 난소화성 전분의 용도.
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