WO2020203667A1 - 有用微生物の菌体の保護方法 - Google Patents

有用微生物の菌体の保護方法 Download PDF

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useful microorganism
microorganisms
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麻記 今岡
篤 神村
知子 尊田
智恵 高山
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三菱商事ライフサイエンス株式会社
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    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention provides a composition containing useful microorganisms such as probiotics imparted with gastric juice decomposition stability, and in particular, useful microorganisms provided in the form of foods and drinks and compositions for preparing foods and drinks.
  • the present invention relates to providing a composition containing useful microorganisms that imparts and retains the stability of useful microorganisms to the decomposition action by gastric juice when the composition is ingested, that is, the stability of gastric juice decomposition. ..
  • the present invention relates to a method for protecting the useful microorganism in an environment harsh for the survival of the useful microorganism, such as temperature, humidity, and salt concentration, in addition to pH.
  • Probiotics was defined by the British microbiologist Fuller in 1989 as "a living microorganism that has a beneficial effect on humans by improving the balance of the intestinal flora” and is a product concept of probiotics. Is defined and provided as "a product containing living microorganisms and microbial metabolites that act on the normal flora in vivo, especially in the intestinal tract, and benefit the organism by improving its balance”.
  • the beneficial effects of "probiotics” on humans include intestinal regulation, maintenance and improvement of intestinal flora, suppression of growth of harmful bacteria and viruses, immunosuppression, and suppression of carcinogen production. Has been reported and is widely used in pharmaceuticals and foods.
  • the intestinal probiotics In order to ingest probiotics in a food-like form and bring about useful functions of probiotics, the intestinal probiotics should be ingested at the same time as the stability of probiotic products during production and distribution storage.
  • gastric juice decomposition stability There is a problem of stability against gastric juice decomposition action before reaching the inside, that is, gastric juice decomposition stability, and in order to exert the effective function of probiotics, it is necessary to clear the hurdle to the decomposition action. It becomes important.
  • Microorganisms used in probiotics include lactic acid-producing bacteria such as Lactobacillus, Enterococcus, and Lactococcus, Bifidobacterium, yeast (Saccharomyces), fungi (Aspergillus oryzae), and spore-acidic bacteria (Bacillus).
  • lactic acid-producing bacteria such as Lactobacillus, Enterococcus, and Lactococcus
  • Bifidobacterium yeast (Saccharomyces), fungi (Aspergillus oryzae)
  • spore-acidic bacteria Bacillus
  • Clostridium and many other microorganisms are used, but in food and drink, lactic acid-producing bacteria such as Lactobacillus, Enterococcus, and Lactococcus are mainly used.
  • Granules include (A) wheat, soybean, rice, collagen, gelatin-derived hydroalcohol-soluble protein, or at least one of zeins, a layer containing fats and oils and excipients, and (B) wheat, soybean, When the granulated product is ingested by forming a granulated product consisting of two layers including rice, collagen, a hydrous alcohol-soluble protein derived from gelatin, or a layer containing at least one of zein.
  • a method for preventing decomposition in gastric fluid is disclosed by having a structure that does not dissolve in the stomach but dissolves for the first time in the intestinal tract.
  • Cited Document 3 a method for enhancing the effect of lactic acid bacteria by encapsulating lactic acid bacteria cells in a fat-soluble capsule formed by a film containing gelatin and a fat-adding agent in a capsule such as a soft capsule.
  • lactic acid bacteria are (a) coated with sodium alginate to form a primary coating, and (b) the primary coating of corn protein extract, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, and shelac.
  • a method of protecting lactic acid bacteria from gastric acid at the time of ingestion by coating with one or more release-controlled coating bases selected from among them to form a secondary coating is cited in Reference 5, Cited. Document 6 discloses a method of mixing a living lactic acid bacterium with an oil / fat composition such as chocolate to prevent the lactic acid bacterium from being killed by gastric acid at the time of ingestion.
  • Reference 7 describes a gastric fluid composed of a dry-stabilized microorganism (probiotics), sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose and its derivatives, methacrylic acid derivative and galactomannan, and a mixture thereof in a probiotic preparation. It is disclosed that by containing a decomposition-resistant substance as a matrix component of the microorganism (probiotics) and a gastric fluid decomposition-resistant substance, a probiotic preparation stabilized against the decomposition action of gastric fluid is provided. ing.
  • a nutritional product for a person who has difficulty swallowing is prepared as a nutritional product containing an aqueous solution of a biopolymer for foods such as microbial hydrophilic colloid such as xanthan gum, gellan gum, and curdran, and is used for a person who has difficulty swallowing.
  • a biopolymer for foods such as microbial hydrophilic colloid such as xanthan gum, gellan gum, and curdran
  • a starch, and a nutritional supplement, and a thickener formulation in which the viscosity of the nutritional formulation is adjusted is prepared as a thickener formulation for people who have difficulty swallowing, and nutrition of the food at a cold storage temperature.
  • thickener formulations for people with swallowing that have been improved to minimize an increase in the viscosity of the composition and to provide a consistent viscosity of the nutritional composition during long storage periods and at different temperatures.
  • a product containing probiotics is disclosed as one of the components such as carbohydrates, proteins, fats, phytonutrients, vitamins and minerals to be blended as nutritional components. ..
  • these nutritional products for dysphagia and thickener formulations for dysphagia have been shown to contain probiotics as one of the formulations, but in particular, probiotics.
  • probiotics as one of the formulations, but in particular, probiotics.
  • An object of the present invention is to provide a composition containing useful microorganisms such as probiotics imparted with gastric juice decomposition stability, particularly in the form of a food or drink or a composition for preparing a food or drink.
  • a composition containing a useful microorganism which imparts and retains the stability of the useful microorganism against the decomposition action by gastric juice when the composition is ingested, that is, the stability of gastric juice decomposition resistance.
  • an object of the present invention relates to a method for protecting the useful microorganism in an environment harsh for the survival of the useful microorganism such as temperature, humidity and salt concentration.
  • the present invention comprises (A) a dried cell or a dry cell preparation of a useful microorganism and (B) a powder of a polycationic polymer selected from chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine. It comprises a composition containing a useful microorganism imparted with gastric juice decomposition stability, which is characterized by the above.
  • the composition containing the useful microorganism of the present invention is prepared as a powder mixture of the dried bacterial cells or the dry bacterial cell preparation of the useful microorganism and the powder of the polycationic polymer, and the powder mixture is blended. Therefore, since it can be produced, it can be applied to various compositions, and it is possible to provide a useful microbial preparation having storage stability and gastric fluid decomposition resistance stability.
  • composition containing the useful microorganisms of the present invention can be applied to the composition containing various useful microorganisms, and in particular, (A) dried bacterial cells or dried bacterial cell preparations of useful microorganisms and (B). ) Prepared by mixing powder of a polycationic polymer selected from chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine so that the useful microorganism and the polycationic polymer coexist in contact with each other.
  • a composition containing useful microorganisms having storage stability and gastric fluid decomposition resistance stability can be provided.
  • the mixing ratio of the polycationic polymer of (B) with respect to the dried bacterial cells of the useful microorganism of (A) or the dry bacterial cell preparation is the ratio of the useful microorganism of (A).
  • the polycationic polymer (B) can be mixed in the range of 0.2 parts by weight to 2500 parts by weight with respect to 1 part by weight of the dried cells, and particularly for foods and drinks and food and drink preparation. In preparing the composition, preferably, it is mixed in the range of 0.2 parts by weight to 2500 parts by weight, and the mixture is blended with foods and drinks and raw materials of the food and drink preparation composition to contain useful microorganisms. Can manufacture things.
  • the present invention relates to (1) (A) dried bacterial cells or dried bacterial cell preparations of useful microorganisms, and (B) chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine in the process of producing a composition containing useful microorganisms.
  • the powder of the polycationic polymer selected from the above is added to the powder of the polycationic polymer of (B) with respect to 1 part by weight of the dried cells of the useful microorganism of (A) or the dry cell preparation.
  • the method for producing a composition containing the useful microorganism is a powder prepared by mixing and treating the useful microorganism and a polycationic polymer.
  • a method for producing a food or drink which comprises blending a body mixture or a granulated product thereof with a raw material for producing a food or drink, or blending the powder mixture or a granulated product thereof with a raw material for a composition for preparing a food or drink. It includes a method for producing a composition containing useful microorganisms, which is a method for producing a composition for preparing food and drink.
  • the present invention comprises (A) dry cells or dry cell preparations of useful microorganisms and (B) polycationic polymer, and the useful microorganisms and the polycationic polymer are in contact with each other. It includes the invention of a method of imparting storage stability and gastric fluid decomposition resistance to useful microorganisms in the beneficial microorganisms by preparing them as a powder mixture by mixing them so as to coexist in the state.
  • the present invention is selected from (A) dried bacterial cells or dried bacterial cell preparations of useful microorganisms and (B) chitosan, chitosan oligosaccharides, chitin, polylysine, and protamine in a composition containing useful microorganisms.
  • the powder of the polycationic polymer is mixed and treated so that the useful microorganism and the powder of the polycationic polymer coexist in a contact state to prepare a powder mixture, or the powder mixture is further prepared. It includes a method of imparting gastrostomy-resistant decomposition stability to useful microorganisms in a composition containing useful microorganisms by granulating.
  • the present invention comprises the following invention.
  • the polycationic polymer of (B) is based on 1 part by weight of the dry cells of the useful microorganisms in the dry cells of the useful microorganisms or the preparation of the dry cells of the useful microorganisms of (A).
  • the chitosan compounded as the polycationic polymer of (B) is a chitosan low molecular weight polymer having a molecular weight of 50,000 to 100,000, a medium molecular weight polymer of chitosan having a molecular weight of 100 to 1 million, or a chitosan polymer having a molecular weight of 1 million or more.
  • the selected polycationic polymer powder is used, and the polycationic polymer powder of (B) is used with respect to 1 part by weight of the dried cells in the dried cells or the dry cell preparation of the useful microorganism (A).
  • a step of preparing the useful microorganism and the polycationic polymer as a powder mixture coexisting in a contact state by mixing treatment in the range of 0.2 parts by weight to 2500 parts by weight and (2) A method for producing a composition containing useful microorganisms, which is characterized by having a step of blending a powder mixture with a composition raw material containing useful microorganisms, and which imparts gastric fluid decomposition stability.
  • the powder mixture obtained in step (1) is further subjected to a granulation step, and contains useful microorganisms.
  • a method for producing a composition to be produced. As a method for producing a composition containing useful microorganisms, a powder mixture prepared by mixing and treating a useful microorganism and a polycationic polymer or a granulated product thereof is blended with a raw material for producing food and drink.
  • the present invention is characterized by a method for producing a food or drink, or a method for producing a food or drink preparation composition, which comprises blending the powder mixture or a granulated product thereof with a raw material of the food or drink preparation composition.
  • the method for producing a composition containing the useful microorganism according to the above [6] or [7]. [9]
  • a polycationic property selected from (A) a dry cell or a dry cell preparation of the useful microorganism and (B) chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine.
  • the polymer powder is mixed and treated so that the useful microorganism and the polycationic polymer powder coexist in contact with each other to prepare a powder mixture, or the powder mixture is further granulated.
  • the powder mixture or the granulated product thereof used for imparting storage stability and gastric acid decomposition resistance stability to the composition containing useful microorganisms is (A) dried cells of useful microorganisms or Since it can be prepared as a mixture of dried bacterial cell preparation and (B) polycationic polymer, there are no restrictions on the materials used and product form when applying to various useful microbial products such as foods and drinks, and a wide range of useful microbial products. It is possible to provide a useful microbial product having functions such as effective storage stability, gastric fluid decomposition stability and the like, which are exhibited by the useful microorganism.
  • the method for imparting gastric juice decomposition resistance stability to useful microorganisms of the present invention is not limited to a low pH environment such as gastric juice, but generally, an environment severe for the survival of useful microorganisms, for example, a high pH environment, a high temperature environment, It can also be expected to be used as a method for imparting stability in environments such as low temperature environments, high salt concentration environments, and dry environments.
  • the present invention is a composition containing useful microorganisms, in which (A) a dry bacterial cell or a dry bacterial cell preparation of the useful microorganism and (B) a polycation selected from chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine.
  • the powder of the sex polymer is mixed and treated so that the useful microorganism and the polycationic polymer coexist in contact with each other to prepare a powder mixture, and the powder mixture is added to the composition containing the useful microorganism.
  • By blending comprises providing a composition containing useful microorganisms having maintained gastric fluid decomposition stability.
  • the useful microorganisms contained in the composition containing the useful microorganisms are, in addition to probiotics defined as "living microorganisms that bring about beneficial effects on humans by improving the balance of the intestinal flora".
  • Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Saccharomyces, Candida used in the fermentative production of useful compounds such as amino acids, nucleic acids, and proteins.
  • examples include microorganisms belonging to a genus or the like.
  • specific examples of probiotics include microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, and the like.
  • microorganisms useful not only for humans but also for domestic animals and poultry can be used as probiotics in the present invention.
  • microorganisms belonging to these genera include the following microorganisms:
  • Bifidobacterium include Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus longum (Bifidobacterium). Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium catenulatum, etc.
  • the microorganisms belonging to the genus Lactobacillus include Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantalum, Lactobacillus planta.
  • Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus lactis, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus
  • microorganisms belonging to the genus Enterococcus include (Lactobacillus brevis) and the like, and examples thereof include microorganisms belonging to the genus Enterococcus faecalis and the genus Lactobacillus.
  • Lactococcus plantarum examples include microorganisms belonging to plantarum), Lactococcus raffinolactis, and the like.
  • the useful microorganism in the present invention may be any of the above-mentioned microorganisms, but microorganisms classified into probiotics Lactobacillus, Enterococcus and Lactococcus are more preferably used, and Lactobacillus and Enterococcus are more preferably used. Microorganisms belonging to are more preferably used.
  • the probiotics are mixed as dried cells or a dry cell preparation, but as the dried cells, the useful microorganism cells are subjected to a drying treatment such as freeze-drying.
  • the dried cells obtained by serving are preferably used.
  • the dried cells can also be used as a dry cell preparation containing an excipient such as starch.
  • polycationic polymer used in the present invention examples include polycationic polymers selected from putrecin, cadaverine, spermine, spermine, agmatin, chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine, and chitosan is preferable. , Chitosan oligosaccharides, chitin, polylysine and protamine. It can be said that these polycationic polymers are substances that often exert a bacteriostatic effect.
  • Chitosan which is used as a polycationic polymer in the present invention, is a linear polysaccharide composed of poly- ⁇ 1 ⁇ 4-glucosamine, and is industrially obtained mainly from the exoskeleton of crustaceans such as crabs and shrimp. It can be obtained by deacetylating chitin by boiling treatment in a concentrated alkali or the like. Since chitosan is treated under harsh conditions such as boiling in concentrated alkali, the poly- ⁇ 1 ⁇ 4-glucosamine structure also has a number of molecular weights due to chain breakage depending on the treatment conditions. From 100,000 to over 1 million.
  • low molecular weight chitosan having a molecular weight of 50,000 to 100,000
  • medium molecular weight chitosan having a molecular weight of 100 to 1 million
  • high molecular weight chitosan having a molecular weight of 1 million or more, all of which can be obtained from commercially available products. it can.
  • Chitosan oligosaccharide is another name for oligo N-acetylglucosamine. It has a structure in which about 1 to 6 N-acetylglucosamines are linked, and deacetylated chitosan is treated with hydrochloric acid, and the dissolved product is enzymatically decomposed with chitosanase. And can be manufactured.
  • the chitosan oligosaccharide itself can be obtained from commercially available products.
  • Chitin itself is another name for poly- ⁇ 1-4-N acetylglucosamine, and is a linear nitrogen-containing mucopolysaccharide polymer that constitutes the exoskeleton of arthropods and crustaceans. It is a raw material compound for chitosan oligosaccharides. Chitin itself can be obtained from commercially available products.
  • Polylysine is another name for ⁇ -poly-L-lysine, and is a cationic polymer having a peptide bond between an ⁇ -amino group and a carboxyl group existing in the side chain of an L-lysine residue.
  • Polylysine is produced by a fermentation method using a bacterium of the genus Streptomyces (Streptmyces albulus), but polylysine itself can be obtained from a commercially available product.
  • Protamine is the main component of protein extracted from the testes of fish (salmonids, clupeidae milt) and is used as a food additive. Protamine products can be obtained from commercially available products.
  • the composition containing the useful microorganism of the present invention can be applied to the composition containing the useful microorganism in the food and drink composition and the pharmaceutical composition, and in particular, as a composition containing the useful microorganism in the field of food and drink. , Can be applied advantageously.
  • the polycationic polymer selected from chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine to be blended in the composition containing useful microorganisms can be used alone or in combination, and the polycationic property.
  • the type, combination, dose, etc. of the polymer can be selected depending on the composition containing the beneficial microorganisms to be targeted.
  • a composition containing useful microorganisms when applied as a composition for food and drink, it can be appropriately adjusted according to the type of food and drink to be targeted and the composition of the target composition. ..
  • the thickening (viscosity) of the thickening polysaccharide can be used as it is.
  • composition containing useful microorganisms of the present invention can be advantageously applied as a composition containing useful microorganisms in the field of food and drink.
  • Foods and drinks in the composition containing useful microorganisms for foods and drinks include, for example, drinking water, milk, milk drinks, lactic acid bacteria drinks, soft drinks containing fruit juice, carbonated drinks, fruit juice drinks, vegetable juice drinks, tea drinks, sports drinks, and the like.
  • Functional drinks vitamin supplement drinks, nutritional balance drinks, consomme soups, potage soups, cream soups, Chinese soups and other soups, miso juices, fresh juices, liquid nutrients that can be used for gastrostomy, bread, confectionery, etc. Solid foods such as noodles can also be mentioned.
  • the composition containing the useful microorganism of the present invention in the sense of promoting the dissolution, mixing, etc. of the composition when producing the composition containing the useful microorganism, a range that does not impair the effect of the present invention.
  • a known method for promoting dissolution / mixing can be used in combination as long as the survival of useful microorganisms in artificial gastric juice or gastric juice is not adversely affected.
  • a dry bacterial cell or a dry bacterial cell preparation of the useful microorganism and a polycation selected from chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin, polylysine, and protamine used in the present invention are used. If the sex polymer can be mixed and the useful microorganism and the polycationic polymer can coexist in a contact state, it can be produced by the method used in the usual method for producing a composition containing useful microorganisms.
  • the method for coexisting the dried bacterial cells or the dry bacterial cell preparation of the useful microorganism in a contact state with the polycationic polymer used in the present invention is not particularly limited, but the powder of the useful microorganism and the polycationic polymer are mixed.
  • a method of mixing useful microorganisms with a polycationic polymer and further granulating the mixture can be adopted.
  • the viable cell count of probiotics is determined by adding a solution in which a composition containing probiotics is dissolved or suspended in a diluted solution to a diluted solution and an artificial gastric solution, respectively, mixing them, and determining. After the lapse of time, the probiotics are appropriately diluted with a diluent, and the probiotics are mixed with a detectable medium (for example, MRS medium), and the temperature (for example, 37 ° C.) and conditions under which the probiotics can grow are obtained. It was determined by a method of culturing for 2 to 3 days under (anaerobic conditions, etc., if necessary).
  • MRS medium for example, MRS medium
  • Amount of probiotic composition used The amount of the probiotic composition of the present invention used depends on the type of food and drink, the degree of viscosity applied to the food and drink, and the like, but when the amount of probiotic to be ingested is used as an index, it is usually once. Use an amount capable of ingesting at least 1 ⁇ 10 7 CFU, preferably 1 ⁇ 10 8 CFU, more preferably 3 ⁇ 10 8 CFU per administration of.
  • sample solution and artificial gastric juice test conditions A 0.1 g sample was weighed from each sample and transferred to a centrifuge tube. 40 ml of the diluted solution was added and mixed with a vortex for 1 minute to prepare a sample stock solution. After dissolving the sample stock solution, it was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. After diluting the sample stock solution to 120,000 pieces / ml with a diluted solution, diluting it to 12,000 pieces / ml with artificial gastric juice, adjusting the pH to 3.2 with 0.1N or 1.0N hydrochloric acid, and further, appropriately diluting the solution. Diluted with, and immediately inoculated, the artificial gastric juice treatment was taken for 0 minutes.
  • Samples diluted to 12,000 pieces / ml with artificial gastric juice and adjusted to pH 3.2 with 0.1N or 1.0N hydrochloric acid were allowed to stand in a constant temperature bath at 37 ° C for 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes.
  • the treatment was 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes.
  • Table 2 shows the viable cell count (cells / ml) detected under each condition. As shown in Table 2, the effect of the polycationic polymer on significantly improving the viable cell count in artificial gastric juice was confirmed. Among them, protamine maintained a viable cell survival rate of 60% or more even after 180 minutes of artificial gastric juice treatment time, and its effect was very high. It was also confirmed that the larger the molecular weight of chitosan, the higher the effect tends to be.
  • Acidophilus preparation Acidophilus powder 120, dried bacterial cells 5% + potato starch 95% (manufactured by Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd.)
  • Chitosan (low molecular weight) “Koyo Chitosan FL-80" molecular weight 50,000 to 100,000, 100% chitosan (manufactured by Koyo Chemical Co., Ltd.)
  • Chitosan (medium molecule) “Koyo Chitosan FM-80”
  • Polylysine 50% polylysine powder, 50% polylysine + 50% cassava-derived dextrin (manufactufact
  • sample solution and artificial gastric juice test conditions A 0.1 g sample was weighed from each sample and transferred to a centrifuge tube. 40 ml of the diluted solution was added and mixed with a vortex for 1 minute to prepare a sample stock solution. After dissolving the sample stock solution, it was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. After diluting the sample stock solution to 120,000 pieces / ml with a diluted solution, dilute it to 12,000 pieces / ml with artificial gastric juice, adjust the pH to 2.9 with 0.1N or 1.0N hydrochloric acid, and then add a diluted solution as appropriate. The diluted product immediately inoculated was treated with artificial gastric juice for 0 minutes.
  • Samples diluted to 12,000 pieces / ml with artificial gastric juice and adjusted to pH 2.9 with 0.1N or 1.0N hydrochloric acid were allowed to stand in a constant temperature bath at 37 ° C for 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes. The treatment was 60 minutes, 120 minutes, and 180 minutes.
  • the present invention is applied to a composition containing various useful microorganisms to provide a composition containing useful microorganisms imparted with gastric juice decomposition stability when ingested from the oral cavity, particularly foods and drinks and foods and drinks.
  • a composition containing a useful microorganism provided in a form such as a composition for product preparation, storage stability during distribution and storage, and decomposition action by gastric juice when the composition containing the useful microorganism is ingested.
  • a composition containing a useful microorganism that imparts and retains stability against gastric juice that is, storage stability and gastric juice decomposition stability.

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Abstract

本発明は、飲食品や、飲食品調製用組成物のような形態で提供される有用微生物を含有する組成物において、該有用微生物を含有する組成物を摂取した場合の胃液による分解作用に対する安定性を付与、保持した有用微生物を含有する組成物を提供することを課題とする。　（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを配合することにより、胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物を提供する。本発明の有用微生物を含有する組成物は、該有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、該ポリカチオン性ポリマーの粉末との粉体混合物として調製することができるから、各種有用微生物を含有する組成物に適用することが可能である。

Description

有用微生物の菌体の保護方法
　本発明は、胃液分解安定性を付与したプロバイオティクス等の有用微生物を含有する組成物を提供すること、特に、飲食品や、飲食品調製用組成物のような形態で提供される有用微生物を含有する組成物において、該組成物を摂取した場合の胃液による分解作用に対する有用微生物の安定性、すなわち、耐胃液分解安定性を付与、保持した有用微生物を含有する組成物を提供することに関する。更に、本発明は、ｐＨ以外に、温度、湿度、塩濃度等の該有用微生物の生存にとって厳しい環境下での該有用微生物の保護方法に関する。
　“プロバイオティクスProbiotics”は、１９８９年、英国の微生物学者Fullerによって「腸内フローラのバランスを改善することにより人に有益な作用をもたらす生きた微生物」として定義され、プロバイオティクスの製品コンセプトとしては、「生体内、特に腸管内の正常細菌叢に作用し、そのバランスを改善することにより生体に利益をもたらす生きた微生物及び微生物代謝物を含む製品」と定義され、提供されている。「プロバイオティクス」の人に有益な作用としては、整腸作用、腸内菌叢の維持、改善、有害菌やウイルスなどの増殖抑制、免疫賦活作用、発がん性物質の生成抑制など多くの作用が報告され、広く医薬品、食品などに利用されている。
　プロバイオティクスを食品のような形態で、摂取し、プロバイオティクスの有用な機能をもたらすには、プロバイオティクス製品の製造、流通保存時の安定性と同時に、摂取されたプロバイオティクスが腸内に達する前の胃液による分解作用等に対する安定性、すなわち、耐胃液分解安定性の問題があり、プロバイオティクスの有効な機能を発揮するためには、該分解作用に対するハードルをクリアーすることが重要となる。
　プロバイオティクスに利用される微生物（細菌、酵母、及び真菌）としては、Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcusなどのような乳酸産生菌、Bifidobacterium, 酵母（Saccharomyces）、真菌（Aspergillus oryzae）、芽胞酸性菌（Bacillus, Clostridium）等、多種の微生物が利用されるが、飲食品等においては、Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcusなどのような乳酸産生菌の利用が主力となっている。
　乳酸菌の生菌を利用した製品においては、該製品中の生菌（乳酸菌）の保存安定性や、胃酸耐性を付与する方法として、従来、各種の方法が開示されている。例えば、引用文献１には、乳酸菌の生菌粉末と、添加剤とを混合し、製造した錠剤に、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、又は、メタクリル酸コポリマーのような脂溶性物質を用いてコーティングすることにより、生菌の保存安定性と、胃酸耐性を有する乳酸菌錠剤を提供する方法が、引用文献２には、乳酸菌や、ビフィズス菌のような菌体粉末のような被造粒物を、（Ａ）小麦、大豆、米、コラーゲンや、ゼラチン由来の含水アルコール可溶性蛋白質、若しくは、ツェインの少なくとも一つと、油脂及び賦形剤を含有する層と、（Ｂ）小麦、大豆、米、コラーゲンや、ゼラチン由来の含水アルコール可溶性蛋白質、若しくは、ツェインの少なくとも一つを含有してなる層との２層よりなる造粒物とすることにより、該造粒物を摂取した場合に、胃では溶解せず、腸管において初めて溶解する構造とすることによって、胃液中の分解を防止する方法が、開示されている。
　また、引用文献３には、乳酸菌菌体を、ソフトカプセルのようなカプセルに、ゼラチンと脂溶加剤を配合した皮膜により形成した脂溶性カプセルの中に封入することにより、乳酸菌の効果を高める方法が、引用文献４には、乳酸菌を、（ａ）アルギン酸ナトリウムでコーティングして、１次コーティングを形成し、（ｂ）該１次コーティングを、トウモロコシ蛋白抽出物、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びシェラックの中から選ばれる１種以上の放出制御型コーティング基剤でコーティングして、２次コーティングを形成する構造とすることにより、摂取に際しての胃酸からの乳酸菌の保護を行う方法が、引用文献５、引用文献６には、生きた状態の乳酸菌を、チョコレートのような油脂組成物と混合し、摂取時の胃酸による乳酸菌の死滅を防止する方法が、開示されている。
　更に、引用文献７には、プロバイオティクス製剤において、乾燥安定化した微生物（プロバイオティクス）と、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びその誘導体、メタアクリル酸誘導体及びガラクトマンナン、及びその混合物からなる胃液分解抵抗物質とを、該微生物（プロバイオティクス）と胃液分解抵抗物質とのマトリクス構成成分として含有することにより、胃液の分解作用に対して安定化したプロバイオティクス製剤を提供することが開示されている。
　一方で、嚥下困難者用食品のような食品分野で、プロバイオティクスを栄養成分等の一つとして添加し、利用する試みもなされている。例えば、引用文献８には、嚥下困難者用栄養製品を、キサンタンガム、ゲランガム、カードランのような微生物親水コロイド等の食品用バイオポリマー水溶液を含む栄養製品として調製して、嚥下困難者のための安全な嚥下を促進するように改善した嚥下困難者用栄養製品において、該栄養製品の栄養成分の一つとして、プロバイオティクスを含有させたものが、引用文献９、引用文献１０には、カラギーナン、澱粉、及び、栄養剤を配合し、該栄養配合物の粘度を調整した増粘剤配合物を嚥下困難者用の増粘剤配合物として調製して、該食品の冷蔵貯蔵温度での栄養組成物の粘度の増加を最小限にし、長期の貯蔵期間中及び異なる温度で、栄養組成物の一貫した粘度を提供するように改善した嚥下困難者用の増粘剤配合物について開示されており、該増粘剤配合物の調製に際しては、栄養成分として配合される炭水化物、蛋白質、脂肪、植物栄養素、ビタミン、ミネラル等の成分の一つとして、プロバイオティクスを配合したものが開示されている。しかし、これらの嚥下困難者用栄養製品や、嚥下困難者用の増粘剤配合物は、その配合物の一つとして、プロバイオティクスを配合することは示されているが、特に、プロバイオティクスの安定性、すなわち、プロバイオティクスを含有する製品中のプロバイオティクスの安定性や、該栄養製品や配合物を摂取後に問題となる、プロバイオティクスの胃液分解作用に対する安定性等の配慮がなされている訳ではない。
　以上のとおり、プロバイオティクス製品において、プロバイオティクスの有用な機能を利用するためには、プロバイオティクスの流通、保存時の安定性とともに、プロバイオティクス組成物を摂取した場合の胃液等による分解作用に対するプロバイオティクスの安定性の保持が重要な課題となり、該課題に対する各種の方法が開示されている。これら従来のプロバイオティクスの胃酸からの保護技術は、プロバイオティクスの菌体と胃酸との接触をコーティング等で回避することで成立しているものが多い。しかし、係る課題の解決に、微生物の増殖を抑制する物質が貢献し得ることを示唆する報告は従来なされていない。
特開平４－４１４３４号公報 特開平５－１８６３３５号公報 特開平１１－１９９４９４号公報 特表２００２－５０５２５１号公報：ＷＯ１９９９／０２０７４５） ＷＯ２０１６／１９４３６６ 特許第６１８１２５４号公報 ＷＯ１９９７／１６１９８ 特表２０１５－５０５８５１号公報 特表２０１３－５０８４１６号公報 特開２０１５－０９１８０８号公報
　本発明の課題は、胃液分解安定性を付与したプロバイオティクス等の有用微生物を含有する組成物を提供すること、特に、飲食品や、飲食品調製用組成物のような形態で提供される有用微生物を含有する組成物において、該組成物を摂取した場合の胃液による分解作用に対する有用微生物の安定性、すなわち、耐胃液分解安定性を付与、保持した有用微生物を含有する組成物を提供することにある。また、本発明の課題は、温度、湿度、塩濃度等の該有用微生物の生存にとって厳しい環境下での該有用微生物の保護方法に関する。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、各種プロバイオティクス組成物に適用することが可能な、耐胃液分解安定性を付与したプロバイオティクス組成物の提供について、鋭意検討する中で、（Ａ）プロバイオティクスの乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを配合することにより、耐胃液分解安定性を付与したプロバイオティクス組成物を提供することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを配合したことを特徴とする、胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物からなる。本発明の有用微生物を含有する組成物は、該有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、該ポリカチオン性ポリマーの粉末との粉体混合物として調製し、該粉体混合物を配合することにより、製造することができるから、各種組成物に適用することが可能であり、保存安定性と、耐胃液分解安定性を保持した有用微生物調製品を提供することができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物は、各種有用微生物を含有する組成物に適用することが可能であるが、特に、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーとが接触状態で共存するように混合処理して調製された粉体混合物を配合して調製された飲食品や、飲食品調製用組成物として、保存安定性と、耐胃液分解安定性を保持した有用微生物を含有する組成物を提供することができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤に（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーとして配合されるキトサンは、分子量５～１０万のキトサン低分子ポリマー、分子量１０～１００万のキトサン中分子ポリマー、或いは、分子量１００万以上のキトサン高分子ポリマーのような、キトサンポリマーとして、配合することができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤に対する、（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーの混合割合としては、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体重量１重量部に対して、（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーとを、０．２重量部～２５００重量部の範囲で混合することができ、特に、飲食品や、飲食品調製用組成物の調製に際して、好ましくは、０．２重量部～２５００重量部の範囲で混合し、該混合物を飲食品や、飲食品調製用組成物の原料に配合して、有用微生物を含有する組成物を製造することができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物においては、有用微生物とポリカチオン性ポリマーとが接触状態で共存するように混合処理して調製した粉体混合物を、更に造粒して調製し、該粉体混合物の造粒物のような形態で用いることができる。
　本発明は、有用微生物を含有する組成物の製造工程において、（１）（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤における乾燥菌体重量１重量部に対して、（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーの粉末を、０．２重量部～２５００重量部の範囲で混合処理することにより、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーとを、接触状態で共存する粉体混合物として調製する工程、及び、（２）該粉体混合物を有用微生物を含有する組成物原料に配合する工程を有することを特徴とする、耐胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物の製造方法を包含する。
　本発明の有用微生物を含有する組成物の製造方法においては、（１）の工程で得られた粉体混合物を、更に、造粒工程に付すことにより、粉体混合物の造粒物のような形態で調製し、実施することができる。
　本発明は、本発明の有用微生物を含有する組成物の製造方法において、該有用微生物を含有する組成物の製造方法が、有用微生物とポリカチオン性ポリマーとを混合処理することによって調製された粉体混合物或いはその造粒物を、飲食品製造用原材料に配合することからなる飲食品の製造方法、或いは、該粉体混合物或いはその造粒物を、飲食品調製用組成物の原材料に配合することからなる飲食品調製用組成物の製造方法である有用微生物を含有する組成物の製造方法を包含する。
　また、本発明は有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）ポリカチオン性ポリマーとを、有用微生物とポリカチオン性ポリマーとが接触状態で共存するように混合処理して粉体混合物として調製することにより、有用微生物を含有する中の有用微生物に保存安定性と、耐胃液分解安定性を付与する方法の発明を包含する。
　更に、本発明は、有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーの粉末とが接触状態で共存するように混合処理して粉体混合物として調製するか、又は、該粉体混合物を更に造粒することにより、有用微生物を含有する組成物中の有用微生物に、耐胃液分解安定性を付与する方法を包含する。
　すなわち、具体的には、本発明は、以下の発明よりなる。
［１］（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを配合したことを特徴とする、胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物。
［２］有用微生物を含有する組成物が、飲食品、或いは、飲食品調製用組成物であることを特徴とする上記［１］に記載の有用微生物を含有する組成物。
［３］有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤における有用微生物の乾燥菌体重量１重量部に対して、（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーとを、０．２重量部～２５００重量部の範囲で配合したことを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の有用微生物を含有する組成物。
［４］（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーとして配合されるキトサンが、分子量５～１０万のキトサン低分子ポリマー、分子量１０～１００万のキトサン中分子ポリマー、或いは、分子量１００万以上のキトサン高分子ポリマーであることを特徴とする、上記［１］～［３］のいずれかに記載の有用微生物を含有する組成物。
［５］有用微生物乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤とポリカチオン性ポリマーの粉末を混合処理して調製した粉体混合物を、更に造粒して調製したことを特徴とする上記［１］～［４］のいずれかに記載の有用微生物を含有する組成物。
［６］有用微生物を含有する組成物の製造工程において、（１）（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤における乾燥菌体重量１重量部に対して、（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーの粉末を、０．２重量部～２５００重量部の範囲で混合処理することにより、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーとを、接触状態で共存する粉体混合物として調製する工程、及び、（２）該粉体混合物を有用微生物を含有する組成物原料に配合する工程を有することを特徴とする、耐胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物の製造方法。
［７］上記［６］の有用微生物を含有する組成物の製造方法において、（１）の工程で得られた粉体混合物を、更に、造粒工程に付すことを特徴とする有用微生物を含有する組成物の製造方法。
［８］有用微生物を含有する組成物の製造方法が、有用微生物とポリカチオン性ポリマーとを混合処理することによって調製された粉体混合物或いはその造粒物を、飲食品製造用原材料に配合することからなる飲食品の製造方法、或いは、該粉体混合物或いはその造粒物を、飲食品調製用組成物の原材料に配合することからなる飲食品調製用組成物の製造方法であることを特徴とする上記［６］又は［７］に記載の有用微生物を含有する組成物の製造方法。
［９］有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーの粉末とが接触状態で共存するように混合処理して粉体混合物として調製するか、又は、該粉体混合物を更に造粒することにより、有用微生物を含有する組成物中の有用微生物に、耐胃液分解安定性を付与する方法。
　本発明は、各種有用微生物を含有する組成物に適用して、その口腔からの摂取に際して、耐胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物を提供する、特に、飲食品や、飲食品調製用組成物のような形態で提供される有用微生物を含有する組成物において、流通、保存時での保存安定性と、該有用微生物を含有する組成物を摂取した場合の胃液による分解作用に対する安定性、すなわち、保存安定性と、耐胃液分解安定性を付与、保持した有用微生物を含有する組成物を提供する。本発明において、有用微生物を含有する組成物に、保存安定性と、耐胃液分解安定性を付与するために用いる、粉体混合物或いはその造粒物は、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）ポリカチオン性ポリマーの混合物として調製できるため、飲食品等の各種有用微生物製品への適用に際して、用いる材料、製品形態上の制約もなく、広い範囲の有用微生物製品の調製に適用して、有効な保存安定性、耐胃液分解安定性等の該有用微生物が奏する機能を有する有用微生物製品を提供することができる。また、本発明の有用微生物への耐胃液分解安定性を付与する方法は、胃液のような低ｐＨ環境だけでなく、一般に、有用微生物の生存にとって厳しい環境、例えば、高ｐＨ環境、高温環境、低温環境、高塩濃度環境、乾燥環境といった環境における安定性を付与する方法としての活用も期待できる。
　本発明は、有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーとが接触状態で共存するように混合処理して、粉体混合物を調製し、有用微生物を含有する組成物に該粉体混合物を配合することによって、耐胃液分解安定性を保持した有用微生物を含有する組成物を提供することからなる。
　本発明において、有用微生物を含有する組成物に含有させる有用微生物は、「腸内フローラのバランスを改善することにより人に有益な作用をもたらす生きた微生物」として定義されるプロバイオティクスに加え、アミノ酸、核酸、タンパク質をはじめとする有用な化合物の発酵生産に用いられる、エシェリヒア (Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、キャンディダ(Candida)属等に属する微生物があげられる。また、プロバイオティクスとしては、具体的には、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属等の属に属する微生物が挙げられるが、これ以外にも、ヒトに限らず家畜や家禽に有用な微生物も本発明におけるプロバイオティクスとして用いることができる。
　これらの属に属する微生物としては、次のような微生物を挙げることができる：ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する微生物としては、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム インファンチス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム カテヌラツム（Bifidobacterium catenulatum）等があげられ、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物としては、ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス ラクティス(Lactobacillus lactis)、ラクトバチルス デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)等があげられ、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する微生物としては、エンテロコッカス フェーカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス フェシウム(Enterococcus faecium)等に属する微生物があげられ、ラクトコッカス（Lactococcus）属に属する微生物としては、ラクトコッカス プランタラム(Lactococcus plantarum)、ラクトコッカス ラフィノラクティス(Lactococcus raffinolactis)等に属する微生物を挙げることができる。本発明における有用微生物は、上記微生物のいずれであってもよいが、プロバイオティクスであるラクトバチルス属、エンテロコッカス属及びラクトコッカス属に分類される微生物がより好ましく用いられ、ラクトバチルス属及びエンテロコッカス属に属する微生物が更に好ましく用いられる。
　本発明に用いられる有用微生物は、特にプロバイオティクスにおいては、その元来の定義にかかわらず死菌であってもよいが、増殖可能な状態にある菌体又は増殖可能な状態に遷移可能な菌体、すなわち生菌であることが好ましい。有用微生物は、野生のものを分離し、公知の方法に準じて培養して得られた培養液をそのまま、若しくは該培養液から調製したものを用いてもよいし、市販のものを用いてもよい。本発明の有用微生物を含有する組成物においては、プロバイオティクスは、乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤として混合されるが、乾燥菌体としては、有用微生物菌体を凍結乾燥等の乾燥処理に供して得られる乾燥菌体が好ましく用いられる。該乾燥菌体を澱粉等の賦形剤等を含む乾燥菌体製剤として用いることもできる。
　本発明に用いられるポリカチオン性ポリマーとしては、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、アグマチン、キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーがあげられ、好ましくは、キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン及びプロタミンがあげられる。これらのポリカチオン性ポリマーは、静菌効果を奏することが多い物質であるといえる。本発明においてポリカチオン性ポリマーとして用いられるキトサンは、ポリ－β１→４－グルコサミンからなる直鎖型の多糖類で、工業的には、主として、カニやエビなどの甲殻類の外骨格から得られるキチンを、濃アルカリ中での煮沸処理等により脱アセチル化することにより得ることができる。キトサンは、濃アルカリ中での煮沸処理などの過酷な条件で処理されることから、その処理の条件により、ポリ－β１→４－グルコサミン構造も、鎖が切断されたりして、分子量が、数十万のものから、１００万以上のものがある。例えば、分子量５～１０万の低分子量キトサン、分子量１０～１００万の中分子量キトサン、及び、分子量１００万以上の高分子量キトサンがあるが、いずれのものも、市販のものから、入手することができる。
　キトサンオリゴ糖は、オリゴＮ－アセチルグルコサミンの別名で、Ｎ－アセチルグルコサミンが、１～６個程度つながった構造を持ち、脱アセチル化したキトサンを塩酸処理し、溶解したものを、キトサナーゼで酵素分解して、製造することができる。キトサンオリゴ糖自体は、市販のものから、入手することができる。また、キチン自体は、ポリ－β１－４－Ｎアセチルグルコサミンの別名であり、節足動物や、甲殻類の外骨格等を構成する直鎖型の含窒素ムコ多糖高分子であり、キトサンや、キトサンオリゴ糖の原料化合物となるものである。キチン自体は、市販のものから、入手することができる。
　ポリリジンは、ε－ポリ－Ｌ－リジンの別名で、Ｌ－リジン残基の側鎖に存在するε－アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合を有する、カチオン性ポリマーである。ポリリジンは、ストレプトマイセス属の細菌（Streptmyces albulus）による発酵法により生産されるが、ポリリジン自体は、市販のものから、入手することができる。プロタミンは、魚類の精巣（サケ科、ニシン科の魚の白子）から抽出されるたんぱく質の主成分であり、食品添加物として用いられているものである。プロタミン製品は、市販のものから、入手することができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物は、飲食品組成物及び医薬品組成物における有用微生物を含有する組成物に適用することができるが、特に、飲食品分野における有用微生物を含有する組成物として、有利に適用することができる。本発明において、有用微生物を含有する組成物に配合されるキトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーは、単独又は組み合わせて用いることができ、該ポリカチオン性ポリマーは、その対象とする有用微生物を含有する組成物により、その種類、組み合わせ、用量等を選択することができる。例えば、有用微生物を含有する組成物を飲食品用の組成物として適用する場合には、対象とする飲食品の種類や、目的とする組成物の組成に応じて、適宜、調整することができる。例えば、飲食品用増粘組成物である場合には、増粘多糖類の増粘性（粘度）をそのまま利用することができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物は、飲食品分野における有用微生物を含有する組成物として、有利に適用することができる。該飲食品有用微生物を含有する組成物における飲食品としては、例えば、飲料水、牛乳、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、菜汁飲料、茶飲料、スポーツ飲料、機能性飲料、ビタミン補給飲料、栄養補給バランス飲料、コンソメスープ、ポタージュスープ、クリームスープ、中華スープ等の各種スープ、味噌汁、清汁、胃瘻に使用可能な液状栄養剤等の他、パン、菓子、麺類等の固形の食品も挙げることができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物の調製に際しては、該有用微生物を含有する組成物を製造する際の組成物の溶解・混合等を促進する意味で、本発明の効果を阻害しない範囲、例えば、人工胃液又は胃液中での有用微生物の生残に悪影響のない範囲で、公知の溶解・混合の促進方法を併用することができる。
　本有用微生物を含有する組成物の製造方法としては、有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、本発明に用いられるキトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーを混合し、有用微生物と、該ポリカチオン性ポリマーとを接触状態で共存させることができれば、通常の有用微生物を含有する組成物の製造方法に用いられる方法により製造することができる。有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、本発明に用いられるポリカチオン性ポリマーとを接触状態で共存させる方法は、特に限定されないが、有用微生物の粉体と該ポリカチオン性ポリマーを混合する方法が採用され、有用微生物とポリカチオン性ポリマーとを混合し、該混合物を、更に造粒する方法等を採用することができる。前記のとおり有用微生物とポリカチオン性ポリマーとを造粒する方法においては、有用微生物と、該ポリカチオン性ポリマーとをあらかじめ混合した後に造粒することが好ましい。また、有用微生物の粉体と該ポリカチオン性ポリマーの粉体とを混合する手段は、有用微生物の粉体とポリカチオン性ポリマーの粉体とが、均一となるように十分に混合できる手段であれば、公知のいずれの方法、装置を用いてもよい。
　本発明の有用微生物を含有する組成物を造粒する方法としては、公知の方法を用いることができるが、噴霧造粒、真空凍結造粒、流動層造粒、転動式造粒、攪拌造粒等が好ましく用いられる。これらの方法を用いるにあたっては、上記の原料以外に水やポリカチオン性ポリマーを含有する水等をバインダーとして用いることができる。造粒条件は、それぞれの造粒方法により適宜選択、設定すればよいが、有用微生物の生残に悪影響を及ぼさないように過剰な加熱や発熱を伴わない条件が好ましく、熱による有用微生物の失活を避けるために、常温以下で造粒する方法を用いることが好ましい。該造粒に際しては、ダマ形成を抑制するために、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の食品に添加可能な金属塩を含有する澱粉分解物を含有させて造粒する方法を採用することができる（特開２０１６－２６５０７号公報）。
　本発明の有用微生物を含有する組成物において、該組成物に含有させる有用微生物の量は、有用微生物の種類や期待する活性によって適宜設定すればよいが、本発明の組成物１ｇ中、生菌数として、通常１×１０６ＣＦＵ以上含有され、好ましくは１×１０７ＣＦＵ以上含有され、更に、好ましくは１×１０８ＣＦＵ以上含有されることが好ましい。
　本発明の有用微生物を含有する組成物において、有用微生物と共存させる、本発明に用いられるポリカチオン性ポリマーの量は、使用目的により適宜設定すればよいが、通常、有用微生物の乾燥菌体重量１重量部に対して、通常、０．２重量部以上、特に好ましくは１重量部以上、最も好ましくは１０重量部以上である。該に上限はないが、上限はプロバイオティクスの乾燥菌体重量１重量部に対して、２５００重量部以下、より好ましくは２０００重量部以下である。
　本発明の有用微生物を含有する組成物においては、本発明に用いられるポリカチオン性ポリマー以外に、有用微生物の生残に悪影響のない限り、必要に応じて、有用微生物を含有する組成物に一般的に使用される賦形剤、糖類、タンパク質、ビタミン類、ミネラル、着色料、香料等を用いることができる。
　本発明の有用微生物を含有する組成物は、目的とする対象によって、適宜の製品形態で、提供することができるが、例えば、飲食品を対象とする場合は、有用微生物を含有する飲食品自体、又は、飲食品調製用組成物として提供することができる。該飲食品調製用組成物は、通常の飲食品と同様に飲食できるが、例えば、特種の場合として、嚥下困難者用飲食品のような場合には、胃瘻による経管投与のような投与方法も挙げることができる。
　摂取された飲食品は、有用微生物の生残には過酷な胃内環境を経た後、腸に送達されるが、胃内ｐＨは、通常１～２であるが、食後すぐに４～５となり、２～３時間後には再び低下することが知られている。食物での胃内での滞留時間は、食物の種類にもよるが、飲食品の滞留時間は２時間程度であるとすれば、実施例に示されるように、胃内環境を模した人工胃液中で、本発明の有用微生物を含有する組成物中の有用微生物の生残率を少なくとも１時間程度、向上させることにより、有効な有用微生物の効果の発揮を達成できることとなる。
　以上の態様のとおり、本発明の有用微生物を含有する組成物においては、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーとを、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーとが接触状態で共存するように混合処理して、粉体混合物を調製し、有用微生物を含有する組成物に該粉体混合物を配合することによって、有用微生物の保存安定性と、耐胃液分解安定性を保持した有用微生物組成物を提供することを可能とした。また、有用微生物とポリカチオン性ポリマーとを接触状態で共存させる工程を含むことに特徴を有する本発明の方法は、胃液中のような低ｐＨ環境下のみならず、高ｐＨ環境、高温環境、低温環境、高塩濃度環境、乾燥環境といった該微生物の生存にとって厳しい環境における保存安定性等の安定性を付与する方法としても活用することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　＜実験条件１：人工胃液の調製、試験＞
本発明における人工胃液としては、酵母エキス０．０３重量％、ペプトン０．０６重量％、ラクトース０．０１重量％、ポリソルベート８０（Tween80ともいう）０．０１重量％、システイン塩酸塩０．００１重量％、塩化ナトリウム０．０３重量％を含有する水溶液であって、ｐＨ２．７～４．０、好ましくはｐＨ２．８～３．５、より好ましくはｐＨ２．９～３．２の溶液を用いた。また、人工胃液中での保持時間は１～３時間とした。
　＜実験条件２：プロバイオティクスの生菌数の定量＞
本発明において、プロバイオティクスの生菌数の定量は、プロバイオティクスを含む組成物を希釈液に溶解又は懸濁させた液を、希釈液、及び人工胃液にそれぞれ添加し、混合し、所定の時間経過後、希釈液にて適宜希釈した後、該プロバイオティクスを検出可能な培地（例えばＭＲＳ培地）に混釈し、該プロバイオティクスが生育可能な温度（例えば、３７℃）及び条件（必要に応じて嫌気条件等）で２～３日間培養する方法により求めた。
　＜実験条件３：プロバイオティクス組成物の使用量＞
本発明のプロバイオティクス組成物の使用量は、飲食品の種類や飲食品に付与する粘度の度合い等にもよるが、摂取するプロバイオティクスの量を指標とする場合は、通常、１回の投与につき少なくとも１×１０７ＣＦＵ、好ましくは１×１０８ＣＦＵ、より好ましくは３×１０８ＣＦＵのプロバイオティクスを摂取できる量を用いる。
　［試験例］
　（１）E. フェーカリス菌＋各種ポリカチオン性ポリマー配合による試験
　＜試験方法＞
　［試料］
フェーカリス菌製剤：フェーカリス粉末１２０・乾燥菌体５％＋馬鈴薯澱粉９５％（ビオフェルミン製薬社製）
キトサン（低分子）：「コーヨーキトサンFL-80」分子量５～１０万・キトサン１００％（甲陽ケミカル社製）
キトサン（中分子）：「コーヨーキトサンFM-80」分子量１０～１００万・キトサン１００％（甲陽ケミカル社製）
キトサン（高分子）：「コーヨーキトサンFH-80」分子量１００万以上・キトサン１００％（甲陽ケミカル社製）
キチン：「TG-L」甲陽ケミカル社製
キトサンオリゴ糖：「コーヨーオリゴグルコサミンWG」甲陽ケミカル社製
ポリリジン：ポリリジン５０％粉末・ポリリジン５０％＋キャッサバ由来デキストリン５０％（JNC(株)社製）
プロタミン：「しらこ蛋白製剤 MC-70」しらこ蛋白１６．４％（プロタミン１３．２～１４．６％含有）＋キャッサバ由来デキストリン８３．６％（(株)ウエノフードテクノ社製）
　［培地］
４％加塩MRS寒天培地(フェーカリス菌選択培地) 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［試料溶液の調製と人工胃液試験条件］
各試料から０．１ｇのサンプルを量り取り、遠沈管に移した。希釈液４０ｍｌを加えてボルテックスで１分間混合し、試料原液とした。試料原液は溶解後、３７℃・３０分間静置した。試料原液を希釈液で１２０，０００個／ｍｌまで希釈後、人工胃液で１２，０００個／ｍｌに希釈、０．１Ｎ又は１．０Ｎ塩酸でｐＨ３．２に調整後、更に、適宜、希釈液で希釈し、すぐに植菌したものを人工胃液処理０分とした。人工胃液で１２、０００個／ｍｌに希釈、０．１Ｎ又は１．０Ｎ塩酸でｐＨ３．２に調整した試料を３７℃の恒温槽で６０分、１２０分、１８０分静置したものを人工胃液処理６０分、１２０分、１８０分とした。
　［人工胃液・ｐＨ条件］
事前検証により人工胃液のｐＨを３．２とした。
　［植菌・培養条件］
試料溶液各１ｍｌに培地２０ｍｌを加え、シャーレ内で固めた(ｎ＝６)。３７℃、好気条件で４８時間培養を行った。
　＜試験結果＞
　各条件にて検出された生菌数（個／ｍｌ）を、表２に示す。表２に示されるように、ポリカチオン性ポリマーにおいて、人工胃液中での生菌数を有意に向上させる効果が確認された。中でも、プロタミンは人工胃液処理時間１８０分後も６０％以上の生菌残存率を保持しており、その効果は非常に高かった。また、キトサンは分子量が大きい程、その効果が高い傾向にあることも確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（２）Ｌ．アシドフィルス菌＋各種ポリカチオン性ポリマー配合による試験
対象菌を、Ｌ．アシドフィルス菌に変更し、上記（１）の場合と同様の人口胃液による耐酸性試験を実施した。
　＜試験方法＞
　［試料］
アシドフィルス菌製剤：アシドフィルス粉末１２０・乾燥菌体５％＋馬鈴薯澱粉９５％（ビオフェルミン製薬社製）
キトサン（低分子）：「コーヨーキトサンFL-80」分子量５～１０万・キトサン１００％（甲陽ケミカル社製）
キトサン（中分子）：「コーヨーキトサンFM-80」分子量１０～１００万・キトサン１００％（甲陽ケミカル社製）
キトサン（高分子）：「コーヨーキトサンFH-80」分子量１００万以上・キトサン１００％（甲陽ケミカル社製）
ポリリジン：ポリリジン５０％粉末・ポリリジン５０％＋キャッサバ由来デキストリン５０％（JNC(株)社製）
プロタミン：「しらこ蛋白製剤 MC-70」しらこ蛋白（プロタミン１３．２～１４．６％含有）１６．４％＋キャッサバ由来デキストリン８３．６％（(株)ウエノフードテクノ社製）
　［培地］
４％加塩MRS寒天培地(フェーカリス菌選択培地)
無塩MRS寒天培地（アシドフィルス菌及びフェーカリス菌選択培地）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　［試料溶液の調製と人工胃液試験条件］
各試料から０．１ｇのサンプルを量り取り、遠沈管に移した。希釈液４０ｍｌを加えてボルテックスで１分間混合し、試料原液とした。試料原液は溶解後、３７℃・３０分間静置した。試料原液を希釈液で１２０，０００個／ｍｌまで希釈後、人工胃液で１２，０００個／ｍｌに希釈、０．１Ｎ又は１．０Ｎ塩酸でｐＨ２．９に調整後、更に適宜、希釈液で希釈し、すぐに植菌したものを人工胃液処理０分とした。人工胃液で１２，０００個／ｍｌに希釈、０．１Ｎ又は１．０Ｎ塩酸でｐＨ２．９に調整した試料を３７℃の恒温槽で６０分、１２０分、１８０分静置したものを人工胃液処理６０分、１２０分、１８０分とした。
　［人工胃液・ｐＨ条件］
事前検証により、人工胃液のｐＨを２．９とした。
　［植菌・培養条件］
試料溶液各１ｍｌに培地２０ｍｌを加え、シャーレ内で固めた（ｎ＝６)。培地はフェーカリス菌選択培地およびアシドフィルス菌・フェーカリス菌選択培地両者を用いた。２７℃、好気条件で４８時間培養を行った後、各々のコロニー数をカウントし、無塩MRS培地でのコロニー数（アシドフィルス菌数＋フェーカリス菌数）から加塩MRS培地でのコロニー数（フェーカリス菌数）を差し引いたコロニー数をアシドフィルス菌数として算出した。
　＜試験結果＞
結果を、表４に示す。表４に示されるように、対象菌をL.アシドフィルス菌とした場合でも、フェーカリス菌を対象とした場合と同様の効果が確認された。中でも、プロタミンは人工胃液処理時間１８０分後も、３０％以上の生菌数が確認でき、その効果は非常に高かった。また、キトサンは分子量が小さい程、その効果が高い傾向であり、フェーカリス菌を対象とした同様の試験結果とは異なる傾向となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（４）E．フェーカリス菌＋キトサン配合比率変更試験
　＜試験方法＞
　［試料］
フェーカリス菌製剤：フェーカリス粉末１２０・乾燥菌体５％＋馬鈴薯澱粉９５％（ビオフェルミン製薬社製）
キトサン（高分子）：コーヨーキトサンFH-80分子量１００万以上・キトサン１００％（甲陽ケミカル社製）
　［培地］
４％加塩MRS寒天培地(フェーカリス菌選択培地)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　［試料溶液の調製と人工胃液試験条件］
各試料から０．１ｇのサンプルを量り取り、遠沈管に移した。希釈液４０ｍｌを加えてボルテックスで１分間混合し、試料原液とした。試料原液は溶解後、３７℃・３０分間静置した。試料原液を希釈液で１２０，０００個／ｍｌまで希釈後、人工胃液で１２，０００個／ｍｌに希釈、０．１Ｎ又は１．０Ｎ塩酸でｐＨ３．２に調整後、更に、適宜、希釈液で希釈し、すぐに植菌したものを人工胃液処理０分とした。人工胃液で１２，０００個／ｍｌに希釈、０．１Ｎ又は１．０Ｎ塩酸でｐＨ３．２に調整した試料を３７℃の恒温槽で６０分、１２０分、１８０分静置したものを人工胃液処理６０分、１２０分、１８０分とした。
　［人工胃液・ｐＨ条件］
事前検証により人工胃液のｐＨを３．２とした。
　［植菌・培養条件］
試料溶液各１ｍｌに培地２０ｍｌを加え、シャーレ内で固めた(ｎ＝６)。３７℃、好気条件で４８時間培養を行った。
　　＜試験結果＞
結果を、表６に示す。表６に示されるように、従来の配合比率である試験区１よりも、キトサンの配合率が低い試験区においても効果が確認された。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明は、各種有用微生物を含有する組成物に適用して、その口腔からの摂取に際して、耐胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物を提供する、特に、飲食品や、飲食品調製用組成物のような形態で提供される有用微生物を含有する組成物において、流通、保存時での保存安定性と、該有用微生物を含有する組成物を摂取した場合の胃液による分解作用に対する安定性、すなわち、保存安定性と、耐胃液分解安定性を付与、保持した有用微生物を含有する組成物を提供する。本発明において、有用微生物を含有する組成物に、保存安定性と、耐胃液分解安定性を付与するために用いる、粉体混合物或いはその造粒物は、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）ポリカチオン性ポリマーの混合物として調製できるため、飲食品等の各種有用微生物を含有する製品への適用に際して、用いる材料、製品形態上の制約もなく、広い範囲の有用微生物を含有する製品の調製に適用して、有効な保存安定性、耐胃液分解安定性等の有用微生物の機能を有する有用微生物を含有する製品を提供することができる。本発明は、上記のような酸性条件下での有用微生物の保護への活用だけでなく、有用微生物の生存にとって厳しい、高ｐＨ環境、高温環境、低温環境、高塩濃度環境、乾燥環境といった環境における有用微生物への安定性の付与への活用も期待できる。

Claims (9)

  1. 　（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを配合したことを特徴とする、胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物。
  2. 　有用微生物を含有する組成物が、飲食品、或いは、飲食品調製用組成物であることを特徴とする請求項１に記載の有用微生物を含有する組成物。
  3. 　有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤における有用微生物の乾燥菌体重量１重量部に対して、（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーとを、０．２重量部～２５００重量部の範囲で配合したことを特徴とする請求項１又は２に記載の有用微生物を含有する組成物。
  4. 　（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーとして配合されるキトサンが、分子量５～１０万のキトサン低分子ポリマー、分子量１０～１００万のキトサン中分子ポリマー、或いは、分子量１００万以上のキトサン高分子ポリマーであることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の有用微生物を含有する組成物。
  5. 　有用微生物乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤とポリカチオン性ポリマーの粉末を混合処理して調製した粉体混合物を、更に造粒して調製したことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の有用微生物を含有する組成物。
  6. 　有用微生物を含有する組成物の製造工程において、（１）（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、（Ａ）の有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤における乾燥菌体重量１重量部に対して、（Ｂ）のポリカチオン性ポリマーの粉末を、０．２重量部～２５００重量部の範囲で混合処理することにより、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーとを、接触状態で共存する粉体混合物として調製する工程、及び、（２）該粉体混合物を有用微生物を含有する組成物原料に配合する工程を有することを特徴とする、耐胃液分解安定性を付与した有用微生物を含有する組成物の製造方法。
  7. 　請求項６の有用微生物を含有する組成物の製造方法において、（１）の工程で得られた粉体混合物を、更に、造粒工程に付すことを特徴とする有用微生物を含有する組成物の製造方法。
  8. 　有用微生物を含有する組成物の製造方法が、有用微生物とポリカチオン性ポリマーとを混合処理することによって調製された粉体混合物或いはその造粒物を、飲食品製造用原材料に配合することからなる飲食品の製造方法、或いは、該粉体混合物或いはその造粒物を、飲食品調製用組成物の原材料に配合することからなる飲食品調製用組成物の製造方法であることを特徴とする請求項６又は７に記載の有用微生物を含有する組成物の製造方法。
  9. 　有用微生物を含有する組成物において、（Ａ）有用微生物の乾燥菌体或いは乾燥菌体製剤と、（Ｂ）キトサン、キトサンオリゴ糖、キチン、ポリリジン、及びプロタミンから選択されるポリカチオン性ポリマーの粉末とを、該有用微生物と該ポリカチオン性ポリマーの粉末とが接触状態で共存するように混合処理して粉体混合物として調製するか、又は、該粉体混合物を更に造粒することにより、有用微生物を含有する組成物中の有用微生物に、耐胃液分解安定性を付与する方法。 
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