CN111450122B - 一种复合菌剂及其在皮肤修复上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合菌剂，其特征在于，包括：费氏丙酸杆菌，青春双歧杆菌，黄花倒水莲皂苷A。本发明使用的菌株易得，成本低，工艺可控，能显著加快创面的愈合速度，并且显著提高创面的愈合率，同时还能促进创面组织血管的形成，加速创面愈合，为临床治疗慢性创面的修复提供新的方法。

Description

一种复合菌剂及其在皮肤修复上的应用
技术领域
本发明涉及一种复合菌剂及其在皮肤修复上的应用，属于微生物菌株菌剂技术领域。
背景技术
皮肤被覆于动物机体的体表，由复层扁平上皮和结蹄组织构成，富含丰富的血管、神经、毛囊、淋巴管、汗腺等组织，直接与外界环境之间接触的第一道天然屏障，可以使动物机体免于遭受包括理化损伤、微生物入侵、紫外线等外部刺激影响和很好的保护机体循环、代谢稳定的作用，对动物体有着非常重要的生理意义，皮肤同时也是机体最大的器官之一。
创伤、大面积烧伤、糖尿病或其他慢性疾病等均会造成严重的皮肤组织缺失，目前临床上常用自体、异体皮肤移植或通过组织工程人工替代物等方法进行修复，但这些方法存在供区新的创伤、供体来源有限和免疫排斥等问题。因此，皮肤损伤修复一直是亟需解决的问题。
截止目前发现，人体内栖息约500多种有益菌。常见的有益菌如下：①乳杆菌类：如鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌等；②双歧杆菌类：如婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、青春双歧杆菌等；③革兰氏阳性球菌：如粪链球菌、乳球菌、肠系膜明串球菌、嗜热链球菌等。微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。在分解代谢中，有机物在微生物作用下，发生氧化、放热和酶降解过程，使结构复杂的大分子降解；合成代谢中，微生物利用营养物及分解代谢中释放的能量，发生还原吸热及酶的合成过程，使微生物生长增殖。内源呼吸是细胞质进行自身氧化并放出能量的过程，当有机物充足时，细胞质得到大量合成，而内源呼吸则并不显著；当缺乏营养时，则只能通过内源呼吸吸收氧化自身的细胞物质而获得微生物生命活动所需的能量。
王君等在“远志皂苷碱水解产物的化学成分研究”(中南药学2010年11月第8卷第11期)中公开了一系列水解产物，黄花倒水莲皂苷A是其水解得到的一种新的化合物，其结构式如下：
Figure BDA0002442303890000021
本发明旨在提供一种复合菌剂及其在皮肤修复上的应用，其应用了益生菌以及黄花倒水莲皂苷A，对皮肤修复具有非常好的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合菌剂及其在皮肤修复上的应用。
黄花倒水莲皂苷A是其水解得到的一种新的化合物，其结构式如下：
Figure BDA0002442303890000031
费氏丙酸杆菌(拉丁名称：Acetobacterpasteurianus)，本发明所用购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.10019，革兰氏阳性杆菌，可用于具体用途：产维生素B12。
青春双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种益生菌，可治疗慢性腹泻、便秘，还有抗衰老作用。尚未检索到用于皮肤用。本发明所用青春双歧杆菌为青春双歧杆菌CICC6178。
本发明所用的菌株均为市场购买得到。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种复合菌剂，其包括：
费氏丙酸杆菌，青春双歧杆菌，黄花倒水莲皂苷A。
本发明还提供一种用上述复合菌剂发酵而成的发酵产物，所述发酵产物均为微生物发酵后过滤获得的无菌发酵液。
经过小鼠皮肤损伤模型的制备研究发现，本发明的复合菌剂可以发酵产生无菌发酵液，该无菌发酵液对皮肤损伤具有显著的效果。
进一步经过测试，我们发现单独发酵费氏丙酸杆菌，青春双歧杆菌均不具备上述明显的修复损伤的效果，推测黄花倒水莲皂苷A激发了菌类的某些次级代谢，产生了一系列活性代谢物。
其制备方法如下：
所述复合菌剂制备发酵液的方法如下：
(1)费氏丙酸杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.8*107(CFU/ml)费氏丙酸杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基1中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基1配方，按照质量百分比：黄花倒水莲皂苷A0.5％，葡萄糖1％，果糖1％，海藻糖1％，玉米浸汁(玉米浆)6％，K2HPO40.8％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8～7.0，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2-0.3μm的滤膜进行无菌过滤，得到费氏丙酸杆菌发酵提取液。
(2)青春双歧杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.3*107(CFU/ml)青春双歧杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基2中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基2配方：黄花倒水莲皂苷A0.5％，葡萄糖5％、低聚果糖8％、玉米浸汁(玉米浆)6％、牛奶10％、胰蛋白胨5％、酵母粉10％、柠檬酸铵2％、K2HPO41％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2-0.3μm的滤膜进行无菌过滤，得到青春双歧杆菌发酵提取液。
(3)将费氏丙酸杆菌发酵提取液和青春双歧杆菌发酵提取液按照体积比1:(1-2)的比例混匀。
本发明的优点：
(1)本发明使用的菌株易得，成本低，工艺可控；
(2)本发明效果显著：能显著加快创面的愈合速度，并且显著提高创面的愈合率，同时还能促进创面组织血管的形成，加速创面愈合，为临床治疗慢性创面的修复提供新的方法。
附图说明
图1为本发明实施例1的提取液治疗造模小鼠7天后，用生理盐水清理创口部位的图片，用记号标框住受损造模部位，可见7天后皮肤已经完全修复。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
本实施例所用费氏丙酸杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.10019，购买获得。
本实施例所用青春双歧杆菌(Bifidobacterium)为青春双歧杆菌CICC6178，购买获得。
实施例1
一种复合菌剂，其包括：
费氏丙酸杆菌，青春双歧杆菌，黄花倒水莲皂苷A。
所述复合菌剂制备发酵液的方法如下：
(1)费氏丙酸杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.8*107(CFU/ml)费氏丙酸杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基1中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基1配方，按照质量百分比：黄花倒水莲皂苷A0.5％，葡萄糖1％，果糖1％，海藻糖1％，玉米浸汁(玉米浆)6％，K2HPO40.8％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到费氏丙酸杆菌发酵提取液。
(2)青春双歧杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.3*107(CFU/ml)青春双歧杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基2中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基2配方：黄花倒水莲皂苷A0.5％，葡萄糖5％、低聚果糖8％、玉米浸汁(玉米浆)6％、牛奶10％、胰蛋白胨5％、酵母粉10％、柠檬酸铵2％、K2HPO41％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到青春双歧杆菌发酵提取液。
(3)将费氏丙酸杆菌发酵提取液和青春双歧杆菌发酵提取液按照体积比1:1的比例混匀。
实施例2
对比：仅用费氏丙酸杆菌和黄花倒水莲皂苷A。
费氏丙酸杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.8*107(CFU/ml)费氏丙酸杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基1中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基1配方，按照质量百分比：黄花倒水莲皂苷A5，葡萄糖1％，果糖1％，海藻糖1％，玉米浸汁(玉米浆)6％，K2HPO40.8％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH7.0，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到费氏丙酸杆菌发酵提取液。
实施例3
对比：仅用青春双歧杆菌发酵提取液和黄花倒水莲皂苷A。
青春双歧杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.3*107(CFU/ml)青春双歧杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基2中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基2配方：黄花倒水莲皂苷A0.5％，葡萄糖5％、低聚果糖8％、玉米浸汁(玉米浆)6％、牛奶10％、胰蛋白胨5％、酵母粉10％、柠檬酸铵2％、K2HPO41％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到青春双歧杆菌发酵提取液。
(3)将费氏丙酸杆菌发酵提取液和青春双歧杆菌发酵提取液按照体积比1:1的比例混匀。
实施例4
对比：不加黄花倒水莲皂苷A。
一种复合菌剂，其包括：
费氏丙酸杆菌，青春双歧杆菌。
所述复合菌剂制备发酵液的方法如下：
(1)费氏丙酸杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.8*107(CFU/ml)费氏丙酸杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基1中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基1配方，按照质量百分比：葡萄糖1％，果糖1％，海藻糖1％，玉米浸汁(玉米浆)6％，K2HPO40.8％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到费氏丙酸杆菌发酵提取液。
(2)青春双歧杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.3*107(CFU/ml)青春双歧杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基2中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基2配方：葡萄糖5％、低聚果糖8％、玉米浸汁(玉米浆)6％、牛奶10％、胰蛋白胨5％、酵母粉10％、柠檬酸铵2％、K2HPO41％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到青春双歧杆菌发酵提取液。
(3)将费氏丙酸杆菌发酵提取液和青春双歧杆菌发酵提取液按照体积比1:1的比例混匀。
实施例5
对比：仅用费氏丙酸杆菌。
费氏丙酸杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.8*107(CFU/ml)费氏丙酸杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基1中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基1配方，按照质量百分比：葡萄糖1％，果糖1％，海藻糖1％，玉米浸汁(玉米浆)6％，K2HPO40.8％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到费氏丙酸杆菌发酵提取液。
实施例6
对比：仅用青春双歧杆菌发酵。
青春双歧杆菌发酵提取液的制备：
将保藏菌种用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.3*107(CFU/ml)青春双歧杆菌种子液；
取10％种子液接种至液体发酵培养基2中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基2配方：黄花倒水莲皂苷A0.5％，葡萄糖5％、低聚果糖8％、玉米浸汁(玉米浆)6％、牛奶10％、胰蛋白胨5％、酵母粉10％、柠檬酸铵2％、K2HPO41％，(NH4)2SO40.2％，吐温0.1％，其余为蒸馏水，pH6.8，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2μm的滤膜进行无菌过滤，得到青春双歧杆菌发酵提取液。
实施例7
实验动物：健康雌性BALB/c小鼠70只，8周龄左右，体质量32-43g，分为7组，每组10只，每组之间无统计学差异，直到实验结束没有小鼠死亡。
小鼠皮肤损伤模型的制备：
用1％戊巴比妥钠按50mg/kg的剂量腹腔注射麻醉小鼠，剪短小鼠背部脊椎两侧被毛，用8％硫化钠脱毛，脱毛位置用碘酒进行消毒，用沾有印泥的直径为8mm的圆筒在脱毛位置印上圆环，用镊子夹起圆环中心皮肤，沿圆环剪除全层皮肤，形成机械损伤创面，模型制备当天记为第0天。造模完成后，进行单笼饲养。
效果测试：全层皮肤切除当天即进行治疗，用无菌棉签分别蘸取生理盐水、实施例1-4的发酵提取液各1mL，分两次均匀涂抹于小鼠的皮肤创面上，直至被创面全部吸收，每天早、中、晚各涂抹治疗1次，连续涂抹治疗7d。
创面愈合率测定：每隔1d用游标卡尺测量小鼠创面的大小，计算创面面积和创面的愈合率，创面的愈合率＝(治疗前创面大小-治疗后创面大小)/治疗前创面大小×100％。
统计学分析组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，统计所用软件为SPSS17.0，P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。
结果：涂抹第7天，与生理盐水对照组相比，各治疗组创面面积均有不同程度的缩小，其中实施例1治疗组的创面几乎完全愈合，见附图。
分别计算治疗第3天和第7天的创面愈合率，结果如下表所示：
Figure BDA0002442303890000111
Figure BDA0002442303890000121
可见，相对于生理盐水组，实施例1-4均具有促进创面愈合的效果。实施例5-6只有请问不显著的促进创面愈合的效果。其中，单独发酵费氏丙酸杆菌，青春双歧杆菌均不具备如此明显的修复损伤的效果，不加黄花倒水莲皂苷A同样效果差距较大。推测黄花倒水莲皂苷A激发了菌类的某些次级代谢，产生了一系列活性代谢物，并且两个菌株发酵提取液的成分之间产生了协同作用。
图1为本发明实施例1的提取液治疗造模小鼠7天后，用生理盐水清理创口部位的图片，用记号标框住受损造模部位，可见7天后皮肤已经完全修复。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，
若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种复合菌剂发酵提取液的制备方法，其特征在于，包括：
费氏丙酸杆菌，青春双歧杆菌，黄花倒水莲皂苷A；
所述复合菌剂制备发酵液的方法，步骤如下：
（1）费氏丙酸杆菌发酵提取液的制备：
将费氏丙酸杆菌CICC10019用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.8*107（CFU/ml）费氏丙酸杆菌种子液；
取10%种子液接种至液体发酵培养基1中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基1配方，按照质量百分比：黄花倒水莲皂苷A0.5%，葡萄糖1%，果糖1%，海藻糖1%，玉米浸汁(玉米浆)6%，K2HPO40.8%，(NH4)2SO40.2%，吐温0.1%，其余为蒸馏水，pH6.8～7.0，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2-0.3μm的滤膜进行无菌过滤，得到费氏丙酸杆菌发酵提取液；
（2）青春双歧杆菌发酵提取液的制备：
将青春双歧杆菌CICC6178用接种环取菌接种到MRS液体培养基中活化，然后将单个克隆接种到种子培养基中，制备种子液：培养温度为30℃，培养时间为24小时后即可作为5.3*107（CFU/ml）青春双歧杆菌种子液；
取10%种子液接种至液体发酵培养基2中，培养条件为：温度37℃，培养时间20小时，液体培养基2配方：黄花倒水莲皂苷A0.5%，葡萄糖5%、低聚果糖8%、玉米浸汁(玉米浆)6%、牛奶10%、胰蛋白胨5%、酵母粉10%、柠檬酸铵2%、K2HPO41%，(NH4)2SO40.2%，吐温0.1%，其余为蒸馏水，发酵后得到发酵产物；
发酵产物进一步过滤；
将发酵产物于2000rpm离心15分钟，转移得到的上清液，通过孔径0.2-0.3μm的滤膜进行无菌过滤，得到青春双歧杆菌发酵提取液；
（3）将费氏丙酸杆菌发酵提取液和青春双歧杆菌发酵提取液混匀。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：
将费氏丙酸杆菌发酵提取液和青春双歧杆菌发酵提取液按照体积比1:（1-2）的比例混匀。
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