KR102589163B1 - 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법 및 이에 따라 제조된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균 - Google Patents

알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법 및 이에 따라 제조된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법 및 상기 제조방법에 따라 제조된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균에 관한 것으로, 본 발명의 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법에 따라 제조된 조성물을 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균은 1차적으로 단백질, 2차적으로 셀룰로오스, 3차적으로 알로에 다당체를 샌드위치 방식으로 코팅함으로써, 코팅 안정성, 동결 안정성, 저장 안정성, 내열성, 내산성, 내담즙성, 인공위액, 인공이자액에 대한 환경 안정성이 증진될 수 있다.

Description

알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법 및 이에 따라 제조된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균{Manufacturing method of sandwich-coated lactic acid bacteria containing aloe polysaccharide and sandwich-coated lactic acid bacteria containing aloe polysaccharide prepared thereby}
본 발명은 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법 및 상기 제조방법에 따라 제조된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균에 관한 것이다.
유산균(Lactic acid bacteria)은 우유에서 잘 자라며 유산을 비롯한 단쇄 지방산을 생산하여 유해균의 성장을 억제하고 부패를 방지함으로써 체내의 독소생성 억제 및 배출에 중요한 역할을 한다. 또한 생균으로서 적절한 양을 섭취했을 때 인체의 건강에 이로운 작용을 하는 프로바이오틱스(probiotics)로 정의되면서 락토바실러스(Lactobacillus)나 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등으로 크게 나누어 정장작용을 하는 대표적인 건강기능식품으로 인식되고 있다. 이러한 프로바이오틱스는 사람의 장에 정착하여 장관운동 활성화, 유해균 억제, 변비개선 등 장 건강에의 유효성 외에도 면역에 관련한 알러지와 아토피 질병, 각종 염증성 장질환 및 암발생, 과민성장증후군 및 장누수증후군 등의 대사증후군, 호흡기 감염, 비만, 기억력 저하, 치매 등의 다양한 질환에 있어서 인체에 유익한 생리활성 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.
특히, 최근에는 장내 미생물 연구가 활발해지면서 ‘장-뇌 축(gut-brain axis)’, ‘장-간 축(gut-liver axis)’등 장과 신체 기관을 연결시켜 병태 생리를 파악하는 이론이 제시되며 장내 미생물로서 장내 환경에 영향을 미치는 프로바이오틱스(probiotics; 생균), 포스트바이틱스(postbiotics; 사균), 프리바이오틱스(prebiotics; 유산균 영양성분), 신바이오틱스(synbiotics; 프로바이오틱스와 프리바이오틱스가 서로 시너지 효과를 내도록 조합한 영양 강화 성분) 그리고 인체에 생존하는 세균, 바이러스 등 각종 미생물을 총칭하는 마이크로바이옴(microbiome)에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
지금까지 유산균 연구의 결과를 보면, 장 면역을 조절하여 변비를 개선하고 암 관련 효소를 억제하며, 스트레스 유전자(c-fos)를 감소시켜 감정의 호르몬 세로토닌과 도파민 생성을 증진하고, 갑상선을 자극하는 타이로트로핀 호르몬을 자극하여 우울증을 개선하며, 부교감 신경을 자극하는 코르티코트로핀 호르몬 생성을 억제하여 장-뇌 상관조정기능의 증진으로 초기 면역물질 TNF-a, IgA 등의 조절, 세포의 자연사멸 기전 세포사멸 및 오토파지(autophage; 자가포식)의 활성증진에도 관여하며, 유산균 세포막 다당류가 오토파지 생성조절에 중요한 기능을 하는 단백질과 포도당 조절단백질의 생성을 촉진함으로써 대장암 세포의 사멸을 촉진하고, 뿐만 아니라 Th1 오토파지 사이토카인과 산화질소의 생성촉진 및 Th2 오토파지 억제 사이토카인의 생성억제에 의한 단핵구의 오토파지 생성촉진 등 다양한 기능성이 보고되었다.
한편, 대부분의 유산균은 다양한 환경조건에 민감하며 인체의 위산과 담즙산으로 인해 사멸하여 장까지 도달 후 생리활성 기능을 기대하기 어렵다. 따라서 생균 상태로 장까지 도달한 후 정착하도록 하는 기술이 매우 중요하다. 이를 위해 유산균을 코팅하는 방법이 개발되었는데, 기존의 코팅기술로는 캡슐제를 이용한 마이크로캡슐화(microencapsulation) 공정이 대표적이다. 코팅에 사용되는 마이크로캡슐은 사이즈가 육안으로 볼 수 없는 마이크로메터(micrometer) 단위의 작은 직경(diameter)을 가진 고체 및 액체 core를 둘러싸는 반투성(semipermeable) 또는 비투과성(nonpermeable)의 구모양의 얇고 강한 막으로 구성되며, 캡슐화에 사용되는 물질들은 알긴산염(alginate), 키토산(chitosan), 잔탄검(xanthan gum), 카르복시에틸셀룰로오스(carboxyethyl cellulose), 녹말(starch), 대두단백(soybean protein), 카라기난(carrageenan), 젤라틴(gelatin), 펙틴(pectin) 등이 있고 일반적으로 식품에 적용할 수 있는 안전한 성분이다. 유산균을 캡슐화하기 위한 연구는 최근까지도 그 효율의 한계를 극복하기 위한 연구가 꾸준히 이어지고 있으나 생산성이 낮고 대량생산의 한계점이 있어 원가상승 등의 요인으로 인해 상용화되기가 어렵다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 기존의 연구에서는 대부분 동결건조와 코팅으로 구분되는 2단계 이상의 멀티코팅(multi-coating) 공정이 제안되고 있다. 그러나 이러한 다단계 공정은 실제 생산 적용 시 공정이 조잡스럽고 복잡하여 높은 생존율을 유지하기 위해 매우 엄격한 공정기술이 확립되지 않으면 안 된다.
한편, 알로에는 백합과의 다년생 다육 초본식물로 전 세계적으로 약 500종 이상이 보고되었으나 식용이나 약용으로 이용할 수 있는 종은 알로에 베라(Aloe vera L.)와 알로에 아보레센스(Aloe arborescens M.) 등의 3∼4종에 불과하다. 알로에의 함유성분으로는 알로인(aloin), 알로에신(aloesin), 에모딘(emodine) 등의 페놀계 화합물과 다당체(polysaccharide), 유기산(organic acid), 사포닌(saponin), 테르페노이드(terpenoid) 등의 물질들이 밝혀졌고, 알로에 베라는 인간과 동물의 장건강 및 면역활성에 대한 항염증 및 항종양효과가 의학적으로 입증되어 최근의 코로나-19 펜데믹 시대에 식품의약품안전처가 공식적으로 광고문구로 허용한 면역 소재로 고시되어 사용되고 있다.
한국등록특허 제10-1924048호
본 발명은 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법 및 상기 제조방법에 따라 제조된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 일실시예에서, (a) 알로에베라에서 알로에 다당체를 취득하는 단계; (b) MRS 배지 100 중량부에 대하여, 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산칼륨 0.15 내지 0.35 중량%, 황산마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량%, 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하여 살균한 후, 유산균을 접종하여 배양하는 단계; (c) 상기 배양하여 얻은 유산균 발효 배양액으로부터 유산균의 균체를 회수하는 단계; (d) 상기 균체와 단백질 코팅제를 혼합하여 상기 균체에 제1 코팅하는 단계; (e) 상기 제1 코팅된 균체와 셀룰로오스 코팅제를 혼합하여 제2 코팅하는 단계; (f) 상기 제2 코팅된 균체와 알로에 다당체 코팅제를 혼합하여 제3 코팅하는 단계; 및, (g) 상기 제3 코팅된 균체를 회수하여 동결 건조시키는 단계를 포함하는 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법을 제공한다.
상기 단백질 함유 용액은 분리대두단백(soy protein), 젤라틴(gelatin), 카세인(casein), 및 콜라겐(collagen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 셀룰로오스는 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 하이드록시카르복시에틸셀룰로오스(hydroxypropyl ethylcellulose, HPEC), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 및 하이드록시카르복시메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리룸(Bifidobacterium)속, 락토코커스(Lactococcus)속, 및 스트렙토코커스(Streptococcus)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것일 수 있다.
상기 (a)단계에서 알로에 다당체를 취득하는 단계는, 알로에베라를 수확 및 전처리하는 단계; 및 상기 전처리 알로에베라에서 점액질의 알로에 다당체를 취득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (b)단계에서 상기 MRS 배지 100 중량부에 대하여, 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산 나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산 암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산 칼륨 0.15 내지 0.35 중량%, 황산 마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산 망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량%, 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (g)단계에서 동결 건조시키는 단계는, 상기 제3 코팅된 균체에 동결보호제 수용액을 첨가하여 동결 건조시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 일실시예에서, 상기 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법에 따라 제조되고, 유산균 균체 표면에 단백질, 셀룰로오스 및 알로에 다당체가 순차적으로 코팅된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균을 제공한다.
상기 단백질, 셀룰로오스 및 알로에 다당체 코팅은 자기조립법에 의해 코팅되는 것일 수 있다.
본 발명의 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법에 따라 제조된 조성물을 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균은 1차적으로 단백질, 2차적으로 셀룰로오스, 3차적으로 알로에 다당체를 샌드위치 방식으로 코팅함으로써, 코팅 안정성, 동결 안정성, 저장 안정성, 내열성, 내산성, 내담즙성, 인공위액, 인공이자액에 대한 환경 안정성이 증진될 수 있다.
또한, 상기 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균은 위장관 안정성 및 생존성 확보와 장내 기능 활성 및 면역 활성을 가짐으로써, 이를 이용한 건강기능성식품, 일반식품, 발효식품, 발효유, 화장품 및 의약품 등의 관련 산업에서 유용하게 활용할 수 있으며 장내 기능 활성 및 면역활성을 가진다.
도 1은 본 발명에 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 대조군에 따른 유산균 분말의 상태(코팅 전)를 촬영한 전자현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균 분말의 코팅 상태(코팅 후)를 촬영한 전자현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 in vivo 실험을 통한 장내 점착성 및 안정성을 보여주는 장내부착 전자현미경 사진이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
알로에베라의 겔성분은 저온 및 고온 처리조건을 견딜 수 있는 고분자 헤테로 다당류를 함유하고 있어서 유망한 하이드로 콜로이드 공급원으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 유산균의 캡슐화를 위한 물리화학적 내부 구조 및 기능적 특성 유지와 높은 중합도를 가진 보호제로의 기능을 가지고 있어서 본 발명의 단백질과 셀룰로오스 코팅제와 함께 유산균 코팅을 완벽하게 코팅할 수 있는 재료로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명은 1차적으로 단백질, 2차적으로 셀룰로오스, 3차적으로 알로에 다당체를 샌드위치 방식으로 코팅함으로써 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균을 제조하여, 코팅 안정성, 동결 안정성, 저장 안정성, 내열성, 내산성, 내담즙성, 인공위액, 인공이자액에 대한 환경 안정성이 증진된 유산균을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명은 (a) 알로에베라에서 알로에 다당체를 취득하는 단계; (b) MRS 배지 100 중량부에 대하여, 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산칼륨 0.15 내지 0.35 중량%, 황산마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량%, 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하여 살균한 후, 유산균을 접종하여 배양하는 단계; (c) 상기 배양하여 얻은 유산균 발효 배양액으로부터 유산균의 균체를 회수하는 단계; (d) 상기 균체와 단백질 코팅제를 혼합하여 상기 균체에 제1 코팅하는 단계; (e) 상기 제1 코팅된 균체와 셀룰로오스 코팅제를 혼합하여 제2 코팅하는 단계; (f) 상기 제2 코팅된 균체와 알로에 다당체 코팅제를 혼합하여 제3 코팅하는 단계; 및, (g) 상기 제3 코팅된 균체를 회수하여 동결 건조시키는 단계를 포함하는 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법에 따라 제조된 조성물을 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균은 1차적으로 단백질, 2차적으로 셀룰로오스, 3차적으로 알로에 다당체를 샌드위치 방식으로 코팅함으로써, 코팅 안정성, 동결 안정성, 저장 안정성, 내열성, 내산성, 내담즙성, 인공위액, 인공이자액에 대한 환경 안정성이 증진될 수 있다.
본 발명에 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법을 도 1을 참조하여 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법은 (a) 알로에베라에서 알로에 다당체를 취득하는 단계; (b) MRS 배지 100 중량부에 대하여, 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산칼륨 0.15 내지 0.35 중량%, 황산마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량%, 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하여 살균한 후, 유산균을 접종하여 배양하는 단계; (c) 상기 배양하여 얻은 유산균 발효 배양액으로부터 유산균의 균체를 회수하는 단계; (d) 상기 균체와 단백질 코팅제를 혼합하여 상기 균체에 제1 코팅하는 단계; (e) 상기 제1 코팅된 균체와 셀룰로오스 코팅제를 혼합하여 제2 코팅하는 단계; (f) 상기 제2 코팅된 균체와 알로에 다당체 코팅제를 혼합하여 제3 코팅하는 단계; 및, (g) 상기 제3 코팅된 균체를 회수하여 동결 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a)단계에서 알로에 다당체를 취득하는 단계는, 알로에베라를 수확 및 전처리하는 단계; 및 상기 전처리 알로에베라에서 점액질의 알로에 다당체를 취득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (b)단계에서 유산균 배양은 유가배양(fed-batch culture) 방법으로 배양될 수 있고, 30 내지 37℃ 조건에서 18 내지 24 시간 배양하는 것일 수 있다.
이때 배양되는 유산균 수는 평균적으로 2.0×109/mL 내지 3.0×109/mL일 수 있다.
상기 (b)단계에서 상기 MRS 배지 100 중량부에 대하여, 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산 나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산 암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산 칼륨 0.15 내지 0.35 중량%, 황산 마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산 망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량%, 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하는 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리룸(Bifidobacterium)속, 락토코커스(Lactococcus)속, 및 스트렙토코커스(Streptococcus)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것일 수 있다.
상기 (c)단계에서는 유산균 발효 배양액을 원심분리하여 유산균의 균체를 회수한다. 예를 들어, 상기 원심분리는 5,000 내지 8,000 rpm으로 20 내지 30 분 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 유산균의 균체가 분리되고 남은 유산균 발효 배양액은 상기 (d), (e), (f)단계에서 코팅제의 제조 시 재사용될 수 있다.
상기 (d)단계에서 상기 단백질 코팅제는 전체 단백질 코팅제 100 중량부를 기준으로, 단백질은 1 내지 30 중량부를 포함하며, 나머지 중량부는 상기 균체가 회수된 유산균 발효 배양액으로 채우는 것일 수 있다.
상기 단백질 함유 용액은 분리대두단백(soy protein), 젤라틴(gelatin), 카세인(casein), 및 콜라겐(collagen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 균체와 단백질 코팅제를 혼합하여 30분 이상 교반하여 균질화한 후 원심분리를 거쳐, 상기 균체의 표면에 단백질이 제1 코팅된 균체를 회수한다.
상기 (e)단계에서 상기 셀룰로오스 코팅제는 전체 셀룰로오스 코팅제 100 중량부를 기준으로, 셀룰로오스는 1 내지 30 중량부를 포함하며, 나머지 중량부는 상기 균체가 회수된 유산균 발효 배양액으로 채우는 것일 수 있다.
상기 셀룰로오스는 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 하이드록시카르복시에틸셀룰로오스(hydroxypropyl ethylcellulose, HPEC), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 및 하이드록시카르복시메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 제1 코팅된 균체와 셀룰로오스 코팅제를 혼합하여 30분 이상 교반하여 균질화한 후 원심분리를 거쳐, 상기 제1 코팅된 균체의 표면에 셀룰로오스로 제2 코팅된 균체를 회수한다.
상기 (f)단계에서 상기 알로에 다당체 코팅제는 전체 알로에 다당체 코팅제 100 중량부를 기준으로, 알로에 다당체는 1 내지 30 중량부를 포함하며, 나머지 중량부는 상기 균체가 회수된 유산균 발효 배양액으로 채우는 것일 수 있다.
상기 제2 코팅된 균체와 알로에 다당체 코팅제를 혼합하여 30분 이상 교반하여 균질화한 후 원심분리를 거쳐, 상기 제2 코팅된 균체의 표면에 알로에 다당체로 제3 코팅된 균체를 회수한다.
상기 제3 코팅된 균체는 유산균의 균체 표면에 단백질, 셀룰로오스, 알로에 다당체가 순차적으로 층을 이루어 샌드위치 코팅된 것일 수 있다.
상기 (g)단계에서 동결 건조시키는 단계는, 상기 제3 코팅된 균체에 동결보호제 수용액을 첨가하여 동결 건조시키는 것일 수 있다.
상기 동결보호제 수용액은 전체 동결보호제 수용액 100 중량부를 기준으로, 동결보호제를 1 내지 10 중량부 포함할 수 있으며, 나머지 중량부는 상기 균체가 회수된 유산균 발효 배양액으로 채우는 것일 수 있다.
상기 동결보호제는 야자유 및 팜유를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (g)단계에서 동결 건조는 -100 내지 -50℃ 온도에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 동결 건조된 균체는 분쇄하여 유산균 분말로 제조할 수 있다.
상기 유산균 균체의 동결 건조 단계에 의해 유발되는 화학적 물리적 스트레스로부터 유산균을 효과적으로 보호하여 동결 건조된 유산균을 장기간 보존할 수 있다. 특히, 상기 동결 건조된 유산균은 실온(25℃)에서 12개월 내지 24개월 동안 유산균의 생존율을 높게 유지하면서 보존이 가능할 수 있고, 가혹한 환경인 30 내지 50℃에서 보존을 수행하여도, 그 유산균의 생존율을 높게 유지시키며 7일 내지 30일 동안 보존시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법에 따라 제조되고, 유산균 균체 표면에 단백질, 셀룰로오스 및 알로에 다당체가 순차적으로 코팅된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균을 제공한다.
도 2는 본 발명에 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 모식도이다.
도 2를 참조하면, 상기 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균은 단백질, 셀룰로오스, 알로에 다당체가 순차적으로 샌드위치 코팅된 샌드위치 코팅 유산균 형태를 갖는다.
상기 단백질, 셀룰로오스 및 알로에 다당체 코팅은 자기조립법에 의해 코팅되는 것일 수 있다. 상기 자가조립법(Layer-by-Layer(LbL) assembly method)은 유산균이 체내에서 기능을 충분히 발휘하도록 저장안정성, 내열성, 내산성, 내담즙성 등을 현저히 증진시킬 수 있으며, 유산균의 표면을 층상구조로 구분하여 코팅함으로써 유산균에 다층 박막을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균은 위장관 안정성 및 생존성 확보와 장내 기능 활성 및 면역 활성을 가짐으로써, 이를 이용한 건강기능성식품, 일반식품, 발효식품, 발효유, 화장품 및 의약품 등의 관련 산업에서 유용하게 활용할 수 있으며 장내 기능 활성 및 면역활성을 가진다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1: 알로에 다당체 취득
3~5년 생육한 알로에 베라 생잎을 (주)김정문알로에 제주 농공장으로부터 채취하여 KGMP 시설에서 정제수로 3회 세척 후 제피하여 마쇄단계를 거쳐서 U-tech 특허 공법을 적용하여 점질상의 다당체를 취득하였다(품목신고 및 제조번호: 1992063113512, 기타가공품).
제조예 2: 유산균 배양 및 균체회수
고농도 배양을 위하여 유산균주인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus planatrum KCCM11322, ATCC8014)을 MRS 배지(Difco, USA)에 접종 후 유가배양(fed-batch culture) 방법으로 30~37℃ 조건으로 18~24시간 동안 배양하였다. 이때, 유산균수는 평균적으로 2.58×109/mL를 나타내었다.
유산균 배양액으로부터 균체의 회수는 3~5℃에서 고속 원심분리기를 사용하여 5,000~8,000 rpm으로 20~30 분 정도 원심분리한 후 균체를 회수하였다.
제조예 3: 동결보호제의 혼합비 설정 및 균질화
단백질, 셀룰로오스, 알로에 다당체를 각각의 혼합비로 혼합하여 단백질 코팅제, 셀룰로오스 코팅제, 알로에 다당체 코팅제를 제조하여 유산균에 코팅한 후, 동결보호제로 야자유를 혼합하여 각각 실시예 1 내지 5를 제조하였다. 실시예 1 내지 5의 혼합비는 하기 표 1에 나타내었다. 단백질(분리대두단백질 100%, Harbin Hi-Tech Sobean Food Ltd, China), 셀룰로오스(hydroxyethylcellulose 100%, Hebei Crovell Biotech Ltd), 알로에 다당체(Aleo vera gel 100%, (주)김정문알로에, 한국), 야자유(정제 야자유 100%, Sun Bio Naturals Private Ltd, India)를 사용하였으며, 단백질, 셀룰로오스, 알로에 다당체, 야자유를 제외한 나머지 중량은 유산균 배양액으로 채워 총 100 중량부가 되도록 제조하였다.
균질화는 각각의 실시예 1 내지 5의 혼합비에 따라 혼합물을 30 분 이상 교반하여 유산균 배양액과 균질화시켰다.
제조예 4: 다층박막의 샌드위치 코팅 절차
샌드위치 코팅은 하기 표 1에 나타낸 각각의 실시예 1 내지 5의 혼합량에 따라 혼합물을 30 분 이상 교반하여 유산균 배양액과 균질화 후, 1차적으로 배양액으로부터 회수한 유산균체에 단백질 코팅제를 혼합하여 원심분리한 후 제1 코팅된 균체를 회수하는 단계, 2차적으로 상기 회수된 제1 코팅된 균체와 셀룰로오스 코팅제를 혼합하여 원심분리한 후 제2 코팅된 균체를 회수하는 단계, 3차적으로 상기 회수된 제2 코팅된 균체에 알로에 다당체 코팅제를 혼합하여 원심분리 한 후 회수하여 자기조립법(Layer-by-Layer(LbL) assembly method)을 이용한 샌드위치 코팅을 완료하였다.
제조예 5: 동결 건조 유산균 분말 제조
동결건조는 샌드위치 코팅된 유산균체를 -80℃ 초저온 냉동고에서 12 시간 동안 동결 후 동결건조기(일신바이오, FD-8508, 한국)를 이용하여 응축온도 -80℃에서 압력 5 mmTorr 이하의 조건에서 120 시간 동결 건조하고 동결 건조된 균체는 분쇄하여 분말화한 다음 4℃ 냉장 보관하여 실험에 사용하였다.
실험예 1: 유산균수 측정
총 균수는 대조군의 유산균 배양액과 실시예 1 내지 5의 샌드위치 코팅 유산균 분말을 멸균수를 이용하여 10 배 희석한 후 MRS 배지(Difco, USA)에 도말하고, 37℃에서 48 시간 동안 배양 후 나타나는 콜로니를 측정하여 CFU/g으로 표시하였으며, 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
구분 유산균수 (CFU/g) 단백질
(중량%) 		셀룰로오스
(중량%) 		알로에 다당체
(중량%) 		야자유
(중량%) 		생존율
(%)
대조군 2.58*109 0 0 0 0 1.5
실시예 1 5 15 5 5 20
실시예 2 5 10 5 10 30
실시예 3 10 10 5 5 57
실시예 4 10 5 5 10 30
실시예 5 15 5 5 5 40
실험 결과, 실시예 3의 단백질 10 중량%, 셀룰로오스 10 중량%, 알로에 다당체 5 중량%, 야자유 5 중량%로 샌드위치 코팅을 하였을 때가 동결건조 생존율이 최대였고, 유산균의 동결 안정성을 최대한 확보할 수 있는 것으로 사료되었다.
실험예 2: 저장 안정성 평가
샌드위치 코팅 유산균에 대한 저장 안정성 측정은 실시예 3의 조건으로 제조된 저장 안정성 평가용 샌드위치 코팅 유산균 분말(실시예 6으로 명명)을 100 g씩 4℃, 25℃, 37℃ 항온기에 보관한 다음 6 개월간 저장하며 총 균수를 측정하였다.
총 균수는 샌드위치 코팅 유산균 분말을 멸균수를 이용하여 10 배 희석한 후 MRS 배지(Difco, USA)에 도말하고, 37℃에서 48 시간 동안 배양 후 나타나는 콜로니를 측정하여 CFU/g으로 나타내었다. 평가 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
샌드위치 코팅 유산균 분말의 저장 안정성은 4℃에서 6 개월간 80% 이상의 유산균 생존율을 나타내었고, 회귀분석을 적용하였을 경우 12 개월간 75% 이상, 18 개월간 70% 이상, 24 개월간 65% 이상의 유산균 생존율을 확보할 수 있었으며, 실시예 6의 샌드위치 코팅 유산균 분말의 저온(4℃) 저장성과 실온 및 체온 조건에서 우수한 장기보존 효과를 나타내는 것으로 사료되었다.
구분 0개월 1개월 2개월 3개월 4개월 5개월 6개월
4℃ 3.0*1010 2.8*1010 2.7*1010 2.7*1010 2.6*1010 2.5*1010 2.4*1010
25℃ 2.4*1010 2.2*1010 2.0*1010 1.9*1010 1.7*1010 1.5*1010
37℃ 2.0*1010 1.8*1010 1.6*1010 1.4*1010 1.2*1010 1.0*1010
실험예 3: 소화효소 복합 안정성 평가
샌드위치 코팅 유산균 분말의 내산성 및 인공 위액에 대한 내성 측정은 1000 U/mL 펩신에 1N-HCl을 이용하여 pH를 2.0, 2.5로 조정하여 인공 위액을 준비하였다. 여기에 실시예 3의 샌드위치 코팅 유산균 분말을 1 g 접종하고, 37℃에서 0.5 시간, 1 시간, 2 시간 간격으로 각각 처리 후 총 균수를 측정하였다.
총균수는 샌드위치 코팅 유산균 분말을 멸균수를 이용하여 10 배 희석한 후 MRS 배지(Difco, USA)에 도말하고, 37℃에서 48 시간 동안 배양 후 나타나는 콜로니를 측정하여 CFU/g으로 나타내었다. 평가 결과는 하기 표 3에 나타냈었다.
샌드위치 코팅 유산균 분말의 내산성 및 인공 위액 내성은 pH2.0에서 2 시간 처리 시 45.7%의 유산균 생존율을 나타내었고, pH2.5에서 0.5 시간 처리 시 100% 이상의 유산균 생존율을 유지하였으며, pH2.5에서 2 시간 처리 시 73.6%의 유산균 생존율을 확보할 수 있으므로, 샌드위치 코팅 유산균 분말의 내산성 및 인공 위액 내성에 매우 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
유산균수 (CFU/g) pH 시간(h) 생존율(%)
7.2*109 2.0 0.5 58.9±0.5
2.0 1.0 50.2±1.1
2.0 2.0 45.7±0.8
5.3*1010 2.5 0.5 100.0±0.0
2.5 1.0 88.7±1.3
2.5 2.0 73.6±0.7
한편, 샌드위치 코팅 유산균 분말의 내담즙성 및 인공 이자액에 대한 내성 측정은 1000 U/mL 리파아제, 담즙염(Bile salt) 0.3%, 2.0%에 1 N-NaOH를 이용하여 pH8.0 로 조정하여 인공 이자액을 준비하였다. 실시예 3의 샌드위치 코팅 유산균 분말을 1 g 접종하고 37℃에서 0.5 시간, 1 시간, 2 시간 동안 각각 처리 후 총 균수를 측정하였다.
총 균수는 샌드위치 코팅 유산균 분말을 멸균수를 이용하여 10 배 희석한 후 MRS agar(Difco, USA)에 도말하고, 37℃에서 48 시간 동안 배양 후 나타나는 콜로니를 계수하여 CFU/g으로 나타내었다. 평가 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
샌드위치 코팅 유산균 분말의 내담즙성 및 인공 이자액 내성은 담즙염 0.3%에서 0.5 시간 처리 시 100% 이상의 유산균 생존율을 유지하였고, 담즙염(Bile salt 0.3%)에서 2 시간 처리 시 89.7%의 유산균 생존율을 나타내었다. 그러나 담즙염 2.0%에서 0.5 시간 처리 시 51.5%의 유산균 생존율을 나타내어 담즙염 2.0%에서는 유산균의 안정성이 다소 낮아지는 것을 볼 수 있었다. 하지만 담즙염 0.3%에서는 유산균 생존율을 확보할 수 있으므로, 샌드위치 코팅 유산균 분말의 내담즙성 및 인공 이자액 내성은 담즙염 0.3% 범위에서 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
유산균수(CFU/g) Bile salt(%) 시간(h) 생존율(%)
3.2*1010 0.3 0.5 100.0±0.0
1.0 95.2±1.2
2.0 89.7±0.8
4.3*109 2.0 0.5 51.5±2.1
1.0 31.2±0.5
2.0 25.6±0.7
실험예 4: 장내 점착성 및 안정성 평가
샌드위치 코팅 유산균 분말의 장내 점착성 및 안정성 평가를 위해서 인체의 결장 선암종에서 유래되는 장관내피세포(Caco-2 cell, 한국생명공학연구원, 한국)를 분양 받아 in vitro 실험을 실시하였다. 20% 불활성 우태아 혈청(inactivated fetal calf serum)과 0.2% 페니실린 및 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 사용하여 37℃에서 배양하였다. 샌드위치 코팅 유산균 분말의 장내 점착성 실험을 위해 T75 flask에 세포를 분주하고 2 일 간격으로 배지를 교환하였다. 배양한 세포를 37℃에서 10 분 동안 트립신을 처리한 후, 세포계수기(hemocytometer)로 세포의 수를 세어 Caco-2 세포의 농도를 계산하였다. 세포의 농도가 1.0×105 세포/mL이 되도록 분주하고 완전한 단층(mono layer)이 형성될 때까지 배양하였다. 그런 다음, DMEM 0.5 mL와 실시예 3의 혼합한 샌드위치 코팅 유산균 분말(0.5 mg; 2.58×109 CFU/mL in PBS)을 Caco-2 세포에 접종한 후 37℃에서 3 시간 배양하였다. 배양 후 PBS로 5 회 세척하고, 메탄올(methanol)로 5 분간 고정하였다. 그람 염색(Gram stain)을 거친 세포를 광학현미경(×1,000)으로 관찰하여 50 개의 Caco-2 세포에 부착한 유산균의 수를 10 개의 시야에서 계 측 후, 5 개의 Caco-2 세포 당 부착한 유산균 수의 평균값을 계산하였다.
그 결과, 표 5와 같이 실시예 6의 샌드위치 코팅 유산균 분말이 대조군에 비해 월등히 Caco-2 세포에 대한 안정적인 점착특성을 가지고 있는 것으로 확인할 수 있었다.
또한, in vivo 실험을 통해서 샌드위치 코팅 유산균 분말의 장내 점착성 및 안정성을 평가하기 위하여, 1 주간 경구 투여 후 8주령의 흰쥐의 소장을 적출하여 4% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 넣어 2 시간 조직을 고정하여, PBS로 세척하였다. 조직 고정 후, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 알코올에 각 30 분씩 탈수하고, 알코올(alcohol):초산아이소아밀(isoamyl acetate)을 2:1, 1:1, 1:2, 초산아이소아밀(isoamyl acetate)을 100% 비율로 각각 30 분씩 처리한 후, CPD(critical point dryer, HCP-2, Hitachi, japan)로 45℃에서 20 분, 20℃에서 5 분 건조하여, ion supper(H-1010, Hitachi, japan)을 이용하여 30 초 동안 코팅한 다음, analytical high resolution scanning electron microscope(Supra55VP, Carl Zeiss, germany)를 이용하여 관찰하였다.
그 결과는 도 5와 같이 장내에 실시예 6의 샌드위치 코팅 유산균이 안착되어 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 장내 유해균 억제 기능성 평가
장내 유해균으로 알려진 대장균(Escherichia coli; E. coli), 살모넬라균(Salmonella enteritidis), 포도상구균(Staphylococcus aureus)과 같은 병원성 세균을 사용하여 본 발명의 샌드위치 코팅 유산균의 병원균 억제능을 검사하였다.
샌드위치 코팅 유산균을 배지에 2 ㎕ 점적하고 spot이 형성되도록 30℃에서 24 시간 혐기배양 하였다. 그 후, 샌드위치 코팅 유산균이 배양된 배지에 7 mL의 뇌심장즙우무배지(Brain heart infusion agar)와 0.7%와 혼합된 상기의 병원균들을 넣고 30℃에서 24 시간 동안 혐기배양한 후 억제환의 크기를 측정하였다. Spot 주위로 형성된 억제환의 직경을 mm 단위로 측정함으로써 병원균 억제정도를 평가하였다.
그 결과, 표 5와 같이 대조군에서는 모든 세균에서 억제 활성이 없는 반면에 실시예 6의 샌드위치 코팅 유산균은 모든 세균에서 우수한 억제활성이 있음을 확인하였다.
구분 유산균수 (CFU/g) Caco-2 세포
점착성 		유해균 억제 기능성
대장균 살모넬라균 포도상구균
대조군 2.58*109 + - - -
실시예 6 +++ ++ +++ +++
실험예 6: 장내 면역기능 활성화 평가
샌드위치 코팅 유산균의 장내 면역기능 활성화 평가를 위해서 Nitric oxide(NO), IL-1β, TNF-α와 같은 사이토카인(cytokine) 활성을 측정하였다. 우선, 시험균주로 대조군과 상기 제조된 실시예 3의 샌드위치 코팅 유산균을 MRS 배지(Difco, USA)를 사용하여 배양하였고(실시예 7로 명명), 대식세포 RAW 264.7 Cell(한국세포주은행, 한국)은 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco Laboratories)와 100 unit/mL의 streptomycin과 penicillin(Gibco Laboratories)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; PAA, Austria) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 염증 반응 모델은 각 well 당 1 ㎍/mL LPS(lipo poly saccharide; Sigma, USA)를 처리하였으며, 대조군은 PBS(pH7.2) 처리하였다.
Nitric oxide(NO) 측정을 위해서 RAW 264.7 세포를 5.0×105 세포/mL로 접종하여 유산균과 양성대조군으로 처리한 LPS, 음성대조군으로 처리한 PBS 배양액을 각각 회수하여 Griess reagent system(Promega, 미국)으로 NO를 측정하였고, 산화질소(NO) 농도는 아질산나트륨 표준곡선 (0~100 μM)을 이용하여 계산하였다.
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 대조군와 비교하여 실시예 7의 샌드위치 코팅 유산균이 NO 활성이 우수함을 확인하였다.
또한, IL-1β 및 TNF-α 활성의 측정을 위한 RAW 264.7 세포를 5.0×105 cell/mL로 접종한 후 세포가 안정되면 유산균과 LPS 처리하고, 48 시간 후에 배양액을 회수한 후 IL-1β, TNF-α ELISA kit(eBioscience, San Diego, USA)를 이용하여 3 회 반복 측정하였다.
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 실시예 7의 샌드위치 코팅 유산균이 IL-1β 및 TNF-α의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 샌드위치 코팅 유산균의 NF-κB 활성측정을 측정하기 위해 RAW BLUE 세포는 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco Laboratories, USA)와 100 unit/mL의 streptomycin과 penicillin(Gibco Laboratories, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; PAA, Austria) 배지를 사용하여 배양하였고, 양성 대조군은 well 당 100 ng/mL의 lipopolysaccharide(LPS; Sigma, USA)를 처리하였다. 그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 면역반응에서 중요한 역할을 하는 전사조절인자 NF-κB의 활성조절능이 대조군과 비교하여 실시예 7의 샌드위치 코팅 유산균이 NF-κB 활성이 우수함을 확인하였다.
구분 유산균수
(CFU/g) 		NO 생성
(㎍/mL) 		IL-1β
(pg/mL) 		TNF-α
(pg/mL) 		NF-κB
(pg/mL)
음성대조군 (PBS) - 1.2±0.2 62.1±0.8 375.8±2.8 4.3±0.6
양성대조군 (LPS) - 12.5±0.7 170.7±0.3 1163.2±3.3 47.5±0.6
실시예 7 2.58*109 21.8±1.1 528.8±0.9 1472.3±1.2 62.7±1.7

Claims (8)

  1. (a) 알로에베라에서 알로에 다당체를 취득하는 단계;
    (b) MRS 배지 100 중량부에 대하여, 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산칼륨 0.15 내지 0.35 중량%, 황산마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량%, 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하여 살균한 후, 유산균을 접종하여 배양하는 단계;
    (c) 상기 배양하여 얻은 유산균 발효 배양액으로부터 유산균의 균체를 회수하는 단계;
    (d) 상기 균체와 단백질 코팅제를 혼합하여 상기 균체에 제1 코팅하는 단계;
    (e) 상기 제1 코팅된 균체와 셀룰로오스 코팅제를 혼합하여 제2 코팅하는 단계;
    (f) 상기 제2 코팅된 균체와 알로에 다당체 코팅제를 혼합하여 제3 코팅하는 단계; 및,
    (g) 상기 제3 코팅된 균체를 회수하여 동결 건조시키는 단계를 포함하고,
    상기 (d)단계에서 상기 단백질 코팅제는 전체 단백질 코팅제 100 중량부를 기준으로, 단백질은 1 내지 30 중량부를 포함하며, 나머지 중량부는 상기 균체가 회수된 유산균 발효 배양액으로 채우는 것이며,
    상기 (e)단계에서 상기 셀룰로오스 코팅제는 전체 셀룰로오스 코팅제 100 중량부를 기준으로, 셀룰로오스는 1 내지 30 중량부를 포함하며, 나머지 중량부는 상기 균체가 회수된 유산균 발효 배양액으로 채우는 것이고,
    상기 (f)단계에서 상기 알로에 다당체 코팅제는 전체 알로에 다당체 코팅제 100 중량부를 기준으로, 알로에 다당체는 1 내지 30 중량부를 포함하며, 나머지 중량부는 상기 균체가 회수된 유산균 발효 배양액으로 채우는 것이며,
    상기 (g)단계에서 동결 건조시키는 단계는, 상기 제3 코팅된 균체에 동결보호제 수용액을 첨가하여 동결 건조시키는 것이고,
    상기 동결보호제는 야자유 및 팜유를 포함하며,
    상기 단백질 함유 용액은 분리대두단백(soy protein), 젤라틴(gelatin), 카세인(casein), 및 콜라겐(collagen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀룰로오스는 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 하이드록시카르복시에틸셀룰로오스(hydroxypropyl ethylcellulose, HPEC), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 및 하이드록시카르복시메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리룸(Bifidobacterium)속, 락토코커스(Lactococcus)속, 및 스트렙토코커스(Streptococcus)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 알로에 다당체를 취득하는 단계는,
    알로에베라를 수확 및 전처리하는 단계; 및
    상기 전처리 알로에베라에서 점액질의 알로에 다당체를 취득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조되고,
    유산균 균체 표면에 단백질, 셀룰로오스 및 알로에 다당체가 순차적으로 코팅된 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 단백질, 셀룰로오스 및 알로에 다당체 코팅은 자기조립법에 의해 코팅되는 것을 특징으로 하는 알로에 다당체 함유 샌드위치 코팅 유산균.
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