KR101722584B1 - 부추의 유산균발효 추출물 및 이를 함유하는 항당뇨 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 부추의 유산균발효 추출물 및 이를 함유하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로 부추의 수추출물을 제조하고 유산균주를 접종하여 부추의 유산균발효 추출물을 제조한 다음 상기 부추의 유산균발효 추출물의 pH, 산도, 항산화 활성을 측정하고 항산화 활성이 높은 L. plantarum과 L. casei균주를 혼합접종한 추출물 제조한 후 상기 부추의 혼합접종한 유산균발효 추출물의 pH, 산도, 항산화 활성, 항당뇨 활성 평가한 결과 높은 항산화 활성 및 항당뇨 효과가 나타났으므로 본 발명은 부추의 유산균발효 추출물을 제공하는 효과가 있으며 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 항산화 활성 및 항당뇨 효능이 있는 항당뇨 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 부추의 유산균발효 추출물 및 그 제조방법과 이를 유효성분으로 함유하는 항당뇨 조성물에 관한 것이다.
부추(Allium tuberosum Rottler)는 백합과에 속하는 Allium속 식물로 국내뿐만 아니라 동북아시아 전역에 분포하고 있는 백합과의 다년초로써 독특한 맛과 향기가 있어 식생활에 많이 사용되며 보혈, 청혈, 구충, 이뇨, 건위, 건뇌, 강심, 진통, 해독 등의 약재로 이용되고 있다(Ahn et al., Food Industry and Nutrition 2001; Park et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 2009). 한방에서 부추는 성질이 약간 따뜻하고 맛은 시고 맵고 떫으며 독이 없으며, 날 것으로 먹으면 아픔을 멎게 하고 독을 풀어주며 익혀 먹으면 위장을 튼튼하게 해주기 때문에 설정(泄精)을 막아준다고 한다.
부추의 주요 영양성분은 카로틴, 비타민 B2, 비타민 C, 칼슘, 철 등을 함유 하고 있으며 주요 성분으로는 allyl sulfide, pentose 및 allylthiamine, 여러 가지 sulfide 유도체와 adenosine, alanine, glutamic acid, aspartic acid, valine 등 아미노산, dimethyl disulfide와 dimethyl trisulfide 같은 8가지 지방족 함황화합물 등이 함유되어 자양강장효과가 있는 것으로 확인되었다.(Choi et al., J Korean Soc Food Nutr. 1992; Richard and Bernhard, Phytochemistry. 1970).
발효식품은 항산화 시스템 강화, 그리고 인체의 방어력을 높이는 면역 시스템 강화 효과를 가져다주며, 다양한 기능성 소재의 가능성이 보고되고 있다(Magwamba et al., J. Food Port. 2010). 이러한 발효식품은 젖산균이나 효모 등 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품으로 미생물의 종류, 식품의 재료에 따라 발효식품의 종류는 다양하며, 각기 독특한 특징과 풍미를 지닌다. 특히 발효에 많이 이용되는 유산균은 인간이 이용할 수 있는 유익한 미생물로써 발효 식품에서 의약품에 이르기까지 광범위하게 활용되고 있다. 유산균의 주요 대사산물은 latic acid인데 이것은 pH를 급격히 강하시킴으로써 부패균의 생장을 억제하고 불용성 무기성분을 가용화하는 작용을 한다.
오늘날 현대사회는 경제적 풍요와 함께 식생활이 서구화되고 과다한 영양 섭취 및 신체활동량의 감소로 인해 비만, 고지혈증, 대장암, 당뇨병과 같은 만성질환의 발병율이 증가되어지고 있다. 그 중에서 당뇨병은 세계 3대 위험 질환 중 하나로써 ‘2012년 사망원인통계’에 의하면 당뇨병은 암, 심장질환, 뇌혈관 질환, 고의적 자해에 이어 우리나라 국민의 사망요인 중 5위를 차지하고 있다.
당뇨병은 췌장에 있는 Langerhans 섬의 베타세포가 파괴되면서 인슐린 분비가 저하되어 발생하는 제1형 당뇨병(Insulin dependant diabetes mellitus, IDDM)과 인슐린 저항성과 인슐린 결핍이 복합적으로 작용하며 주로 비만자에게 많이 발생하는 제2형 당뇨병(Non-insulin dependant diabetic mellitus, NIDDM)으로 나뉜다. 당뇨병은 인슐린 결핍 또는 인슐린 저항성으로 인해 탄수화물, 단백질, 지질 대사가 비정상적으로 진행되고 심혈관계 질환 및 신경계 장애 등의 심각한 합병증을 발생시킨다. 인체는 free radical의 생산과 항산화 체계의 활성이 균형을 이루어 정상적인 생리학적 상태를 유지하고 있는데, 체내에서 free radical이 과도하게 생성되거나 항산화 체계가 손상되면 이들의 균형이 파괴되어 산화 스트레스가 발생하게 된다. 당뇨병에서의 과도한 당화반응은 항산화 체계의 손상으로 인해 산화적 스트레스가 증가되는 것으로 보고된 바 있다(Nah, E. H. et al., Relationship between hemoglobin A1c levels and metabolic syndrome using data collected during a medical check-ups program. Lab. Med. Online, 1, 3-9, 2011). 현재 당뇨병 치료 및 개선제로 많이 사용되는 제제는 인슐린분비 촉진제, 인슐린저항성 개선제, 인슐린 주사제 등이 대표적이다. 이러한 제제들은 혈당 저하 효과가 뛰어난 장점이 있으나, 장기간 사용 시 저혈당 유발, 체지방 증가, 간 독성, 인슐린 저항성 증가 등과 같이 다양한 부작용을 유발한다. 이에 따라 당뇨병의 치료 및 개선에 부작용이 적은 천연물에 대하여 관심이 높아지고 있다(Braunwald, E. et al., Harison's Principles of Internal Medicine. 15th ed, McGraw-Hill, New York, NY, USA. 2109-2137, 2011).
부추와 관련된 기술현황을 살펴보면 부추의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물이 대한민국 등록특허 제10-0535322호에 개시된 바 있고 부추의 착즙추출물을 함유하는 국수 및 그 제조방법이 대한민국 등록특허 제10-1373178호에 개시된 바 있으나 현재까지 부추의 유산균발효 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항당뇨 조성물에 대하여는 암시되거나 교시된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 부추의 유산균발효 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 부추의 유산균발효 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항당뇨 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 부추의 수추출물을 제조하는 단계와; 상기에서 얻은 부추의 수추출물에 유산균주를 접종하여 유산균발효 추출물을 제조하는 단계와; 상기에서 얻은 유산균발효 추출물의 pH 및 산도와 항산화 활성을 측정하는 단계와; L. plantarum과 L. casei 유산균주를 혼합접종한 발효 추출물 제조하는 단계와; 상기에서 얻은 혼합접종한 유산균발효 추출물의 pH 및 산도와 항산화 활성을 측정하는 단계와; 상기 부추의 유산균발효 추출물의 항당뇨 활성을 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 부추의 수추출물을 제조하고 이에 유산균을 접종하여 발효시킨 부추의 유산균발효 추출물을 제공하는 효과가 있으며 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 항산화활성 및 항당뇨 효능이 있는 항당뇨 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 pH을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 산도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 총 폴리페놀함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 SOD 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명 부추의 혼합 유산균발효 추출물의 pH을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명 부추의 혼합 유산균발효 추출물의 산도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명 실험동물의 체중증가량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명 실험동물의 식이섭취량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명 실험동물의 혈당변화량 및 혈당증가량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명 실험동물의 경구 당 부하를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명 실험동물의 혈청 내 Insulin 농도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명 실험동물의 혈청 내 GLP-1 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 산도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 총 폴리페놀함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 SOD 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명 부추의 혼합 유산균발효 추출물의 pH을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명 부추의 혼합 유산균발효 추출물의 산도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명 실험동물의 체중증가량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명 실험동물의 식이섭취량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명 실험동물의 혈당변화량 및 혈당증가량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명 실험동물의 경구 당 부하를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명 실험동물의 혈청 내 Insulin 농도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명 실험동물의 혈청 내 GLP-1 농도를 나타낸 그래프이다.
본 실험에 사용된 부추는 대구광역시 달성군 박곡 지역 농가에서 생산된 부추를 사용하였으며 유산균은 한국미생물보존센터에서 분양받은 Lactobacillus acidophilus(KCCM 3151), Lactobacillus casei(KCCM 13086), Lactobacillus plantarum(KCCM 3104) 균주를 사용하였다.
실험 결과의 분석은 Statistical Package for Social Science(SPSS, win 12.0 version) program을 이용하여 기술적인 통계치를 산출하였다. 결과는 각 실험군별 평균±표준편차로 표시하였으며, 평균 간의 유의성은 Student's t-test와 One way ANOVA 검증을 통한 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.
본 발명에 따라 수득되는 부추의 유산균발효 추출물은 그 희석액 또는 농축액, 건조하여 수득되는 분말 또는 조정제물이나 정제물일 수 있다.
본 발명의 상기 산물은 약학적 조성물로 제조될 수 있으며, 하나 또는 둘 이상의 무독성, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 희석액 또는 생리활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 산물은 식품학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 응고제, 희석액 또는 생리활성 성분을 포함시킬 수 있고 환제, 분말제, 정제, 캡슐, 겔제 등 다양하게 제형화 할 수 있다.
본 발명에 따르면 부추 수추출액의 유산균발효 추출물에 접종할 수 있는 유산균주는 L. acidophilus, L. casei 및 L. plantarum 균주 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 균주를 사용하여 24 ~ 72시간동안 발효하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, L. casei와 L. plantarum 균주를 중량비 1:1로 혼합하여 부추 수추출액에 접종하고 24시간동안 발효하는 것이 항산화 활성 및 항당뇨 활성이 우수하였다.
또, 본 발명자들의 실험결과에 따르면 상기 유산균주의 발효적성에 있어서 ,C1 내지 C4의 저급 알콜의 추출물보다 수(H2O) 추출물이 인체의 체온범위(37℃)에서 발효진행 경과상 가장 바람직하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 목적일 뿐이므로, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 제조
(1) 부추의 수추출물 제조
부추에 시료 중량 대비 10배의 물을 가하고 압력식 추출기(KSNP B1130, KyungSeo Machines, Incheon, Korea)에서 65℃, 3시간 1회 추출한 다음 여과지로 여과하여 공시 출발물질로서 부추의 수추출물을 제조하였다. 상기 부추의 수추출물은 감압 농축한 다음 동결건조한 건조분말을 동물실험에 사용하였다.
(2) 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 제조
MRS 배지 5 mL에 Lactobacillus acidophilus(KCCM 3151), Lactobacillus casei(KCCM 13086), Lactobacillus plantarum(KCCM 3104) 3 종의 유산균주를 각각 또는 2종씩 혼합하여 접종하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하여 전배양 한 다음 상기에서 수득한 부추위 수추출물에 전배양액을 1%(v/v) 접종하고 24, 48, 72시간동안 발효하여 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 제조하였다. 이하, 실험에서는 상기 부추의 유산균발효 추출물은 발효적성이 가장 우수한 L. casei와 L. plantarum 균주를 사용하여 37℃에서 48시간동안 혼합발효한 것을 6,000 rpm으로 원심분리하고 회수한 상층액을 동결건조한 건조분말을 본 발명 부추의 유산균 발효추출물로 정의하고 동물실험에 사용하였다.
<실험예 1> 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 pH 및 산도 측정
(1) 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 pH 측정
pH 측정은 본 발명 부추의 유산균발효 추출물을 교반시키면서 pH meter (InLab413, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.
실험결과, 도 1에서 보는 바와 같이 부추의 수추출물 보다 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 pH가 감소가 더 많은것을 확인하였으며, pH는 L. acidophilus를 접종한 군에 비해 L. plantarum과 L. casei를 접종한 군에서 더 많이 감소하는 것을 확인하였다.
(2) 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 산도 측정
산도 측정은 본 발명 부추의 유산균발효 추출물을 3,500 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 중화적정법을 이용하여 측정하였다. 시료 10 mL에 1% phenolphthalein 지시약을 가한 다음 0.1 N NaOH 용액을 엷은 분홍색이 사라지지 않을 때까지(pH 8.2±0.1) 적정하였다. 사용된 0.1 N NaOH 용액의 양을 총 산도로 나타내었다.
산도를 측정한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 부추의 수추출물보다 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 산도가 더 증가되었으며 L. acidophilus를 접종한 군에 비해 L. plantarum과 L. casei를 각각 접종한 군에서 더 많이 증가하는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 항산화 활성 측정
(1) 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 총 폴리페놀함량 측정
총 폴리페놀 함량은 부추의 수추출물 및 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 0.1 mL에 10배 희석한 Folin 시약 0.5 mL 첨가하고, 용액을 잘 혼합한 다음 5분 동안 실온에 반응시켰다. 상기 반응액에 7.5% Sodium carbonate 0.4 mL를 첨가하고 이 혼합액을 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 Tannic acid(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용한 후 표준물질의 검량선과 비교하여 총 폴리페놀함량 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복수행하여 평균값으로 나타내었다.
실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 발효하지 않은 부추의 수추출물(100 mg/mL)의 총 폴리페놀 함량은 24시간, 48시간, 72시간 후에 각각 97.19±0.97 μg/mL, 93.13±0.56 μg/mL, 98.96±0.86 μg/mL을 나타내었다. 동일한 시간에 L. plantarum을 접종한 발효 추출물의 총 폴리페놀 함량은 99.32±3.75 μg/mL, 101.18±1.22 μg/mL, 94.85±2.79 μg/mL이며 L. casei를 접종한 발효 추출물은 102.50±0.91 μg/mL, 100.39±0.73 μg/mL, 97.50±1.36 μg/mL를 나타내었고 L. acidophilus를 접종한 발효 추출물은 95.08±1.05 μg/mL, 88.33±2.32 μg/mL, 87.25±1.81 μg/mL로 나타내었다.
(2) 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량의 부추의 수추출물 및 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 0.5 mL에 5% Sodium nitrite 75 μL를 혼합하여 5분 동안 실온에 반응시켰다. 상기 반응액에 10% Aluminum chloride 150 μL를 가하여 실온에서 5분 반응시킨 후, 1 M NaOH 0.5 mL와 혼합하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 Catechin (Sigma-Aldrich)을 사용한 후 표준물질의 검량선과 비교하여 총 플라보노이드 함량을 구하였다. 모든 실험은 3회 반복수행하여 평균값으로 나타내었다.
실험결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 발효하지 않은 부추의 수추출물(100 mg/mL)의 총 플라보노이드 함량은 24시간, 48시간, 72시간 후에 각각 5.19±0.03 μg/mL, 5.67±0.12 μg/mL, 4.99±0.29 μg/mL을 나타내었다. L. plantarum을 접종한 유산균발효 추출물의 총 플라보노이드 함량은 2.99±0.17 μg/mL, 3.37±0.18 μg/mL, 3.23±0.18 μg/mL이며 L. casei를 접종한 유산균발효 추출물은 3.43±0.10 μg/mL, 3.26±0.19 μg/mL, 3.16±0.13 μg/mL이고 L. acidophilus를 접종한 군의 총 플라보노이드 함량은 3.21±0.19 μg/mL, 2.15±0.18 μg/mL, 1.94±0.25 μg/mL를 나타내었다.
(3) 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정
1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH, Wako, Tokyo, Japan) 6 mg을 Ethanol 50 mL에 녹인 후 동량의 증류수를 혼합하여 DPPH 반응액을 제조하였다. 부추의 수추출물 및 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 0.5 mL에 상기 DPPH 반응액 5 mL를 넣어 잘 혼합한 후 암실에서 15분 간 방치한 다음, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 [수학식 1] 공식에 따라 산출하였다.
실험결과, 도 5에서 보는 바와 같이 균을 접종하지 않은 부추의 수추출물은 23.99±1.11%, 24.74±1.42%, 18.86±2.14%, L. acidophilus를 접종한 군은 20.99±1.51%, 15.32±2.12%, 22.86±1.72%, L. plantarum을 접종한 군은 48.26±0.86%, 64.71±0.64%, 47.38±0.88%, L. casei를 접종한 군은 45.50±1.23%, 44.72±0.67%, 42.81±1.62%로 각각 나타났다. 부추의 수추출물보다 L. plantarum과 L. casei를 접종한 유산균발효 추출물은 2배 이상 항산화 활성이 증가되는 것을 확인하였다.
(4) 본 발명 부추의 유산균발효 추출물의 SOD 소거능 측정
부추의 수추출물 및 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 0.1 mL에 0.1 M Potassium phosphate buffer(pH 7.4) 0.6 mL를 넣어 잘 혼합하였다. 상기 혼합액에 0.4 mM Xanthine(Sigma-Aldrich)용액과 0.24 mM NBT(Sigma-Aldrich)용액을 1:1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하고 Xanthine oxidase(0.049 U/mL) 1 mL를 가하여 혼합한 다음 37℃에서 20분 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지시킨 다음 560 nm에서 흡광도 측정하였다. 결과 값은 [수학식 2] 공식에 따라 산출하였다.
실험결과, 도 6에서 보는 바와 같이 균을 접종하지 않은 부추의 수추출물은 65.71±13.47%, 51.16±8.32%, 13.38±4.80%, L. acidophilus를 접종한 군은 -1.78±23.62%, 4.10±7.96%, 17.32±5.19%, L. plantarum을 접종한 군은 37.63±4.23%, 33.71±26.43%, 19.37±11.97%, L. casei를 접종한 군은 54.25±12.37%, 63.07±12.71%, 23.00±4.65%로 각각 나타났다.
<실시예 2> 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물 제조
실시예 1에 (2)와 동일하게 실시하여 전배양한 L. plantarum과 L. casei 균주를 부추의 수추출물에 혼합접종하고 48시간동안 발효하여 부추의 혼합 유산균발효 추출물을 제조하였다.
<실험예 3> 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물의 pH 및 산도 측정
본 발명 실시예 2의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물의 pH 및 산도 측정은 본 발명 실험예 1과 동일하게 실시하였다.
실험결과, 도 7에서 보는 바와 같이 발효하지 않은 부추의 수추출물에 비해(6.29±0.00) 유산균을 혼합접종한 발효 추출물의 pH가 3.59±0.01로 약 43% 감소되는 것으로 나타났다. 또한 도 8에서 보는 바와 같이 산도는 발효하지 않은 부추의 수추출물에 비해(0.25±0.01) 유산균을 혼합접종한 발효 추출물의 산도가 1.66±0.05로 크게 증가하였다.
<실험예 4> 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물의 항산화 활성 측정
본 발명 실시예 2의 유산균을 혼합접종한 추출물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능과 SOD 소거능 측정을 통해 확인하였으며 본 발명 실험예 2에 (3) 및 (4)와 동일하게 실시하였다.
실험결과, [표 1]에서 나타낸 바와 같이 DPPH 라디칼 소거능은 부추의 수추출물과 유산균을 혼합접종한 발효 추출물(10 mg/mL) 각각 25.03±1.50%, 58.24±1.18%로 나타났으며, SOD 소거능에서는 부추의 수추출물 23.59±2.65%, 유산균을 혼합접종한 발효 추출물 61.27±0.96%로 나타났다. L. plantarum와 L. casei 균주를 사용하여 유산균을 혼합접종한 발효 추출물의 항산화 활성이 증가됨을 확인하였다.
| 시료 | 농도(mg/mL) | DPPH 라디칼 소거능(%) | SOD 소거능(%) |
| 부추의 수추출물 | 10 | 25.03±1.50a | 23.59±2.65a |
| 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물 | 10 | 58.24±1.18b | 61.27±0.96b |
<실험예 5> 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물의 항당뇨 활성 평가
(1) 본 발명 실험동물 순화 및 적응기간
본 실험에서는 제2형 당뇨의 대표적인 동물모델인 5주령 수컷의 C57BLKS/J Iar-+Leprdb/+Leprdb(db/db) mice와 비당뇨 C57BLKS/J Iar-m+/m+ mice를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물사에서 1주일간 순화 및 적응시킨 후 체중과 혈당을 측정하여 병리적인 특이 소견이 없고 실험 사용에 적합한 mice를 선별하여 사용하였다. 실험기간 중 사료와 물은 자유로이 섭취시켰으며 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 55±15% 그리고 명암은 12시간 주기를 유지하였다. 실험군은 정상군(Normal), 당뇨군(db/db), 200 mg/kg 부추의 수추출물을 투여한 Allium tuberosum Rottler extracts(ATE) 200군, 400 mg/kg 부추의 수추출물 투여군(ATE400), 200 mg/kg 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 투여군(FATE200), 400 mg/kg 본 발명 부추의 유산균발효 추출물 투여군(FATE400)으로 나누었으며 각 군에 5마리씩 배정하여 실험하였다. 이 동물실험은 (재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: BHCC-IACUC-2013-12)을 받아 수행되었다.
(2) 실험동물에 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물 투여
본 발명 실시예1에 따라 제조된 부추의 수추출물 동결건조분말 및 부추의 유산균발효 추출물 동결건조분말을 생리식염수에 희석하여 사용하였다.
순화 및 적응기간이 지난 실험동물에 Normal군과 db/db군에는 생리식염수를 경구투여하고 ATE200군과 ATE400군에는 부추의 수추출물을 각각 200 mg/kg, 400 mg/kg 농도로 경구투여 하였으며, FATE200군과 FATE400군에는 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물을 각각 200 mg/kg, 400 mg/kg 농도로 7주 동안 매일 1회 동일한 시간에 투여하였다.
(3) 본 발명 실험동물의 체중증가량 측정
각 실험군 mice의 체중은 전자저울(CP423S, Sartorius AG, Goettingen, Germany)을 이용하여 주 1회 측정하였으며 실험개시일의 체중을 7주 후의 최종 체중에 감하여 체중변화를 산출하였다.
실험결과, 도 9에서 보는 바와 같이 Normal군은 4.72±0.7 g, db/db군은 10.67±1.3 g, 부추의 수추출물 및 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물을 투여한 ATE200, ATE400, FATE200, FATE400군은 각각 8.68±1.5 g, 7.99±2.1 g, 5.44±0.7 g, 6.22±1.9 g으로 나타났다. db/db군에 비해 부추의 수추출물 및 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물을 투여한 실험군에서 체중증가 억제효과가 높은 것을 확인하였다.
(4) 본 발명 실험동물의 식이섭취량 측정
식이섭취량은 총 7주의 실험기간동안 1주일 단위로 제공된 사료량에서 잔량을 감하여 주 평균 섭취량을 계산하였다.
실험결과, 도 10에서 보는 바와 같이 Normal군 101.23±27.87 g, db/db군 178.33±12.26 g, ATE200군 169.86±27.43 g, ATE400군 160.43±14.24 g, FATE200군 157.53±35.97 g, FATE400군 163.98±2.47 g으로 나타났다. 상기 체중증가량 측정 결과를 고려할 때, 부추의 수추출물 및 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물은 식이섭취량과 상관없이 체중증가를 억제시키는 것을 확인하였다.
(5) 본 발명 실험동물의 혈당변화량 및 혈당증가량 측정
각 실험군 mice의 혈당 변화를 분석하기 위해 매주 1회 12시간 실험동물을 절식시킨 후 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 혈당측정기(Accu-Check Active, Roche Diagnostics, Mannhein, Germany)로 혈당을 측정하였다. 혈당 증가량은 실험개시일의 혈당을 7주 후의 최종 혈당에 감하여 혈당변화를 산출하였다.
실험결과, [표 2]에서 나타낸 바와 같이 Normal군은 24.8±8.9 mg/dL, db/db군은 149.6±11.9 mg/dL, 부추 추출물 및 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물을 투여한 ATE200, ATE400, FATE200, FATE400군은 각각 105.8±8.8 mg/dL, 57.2±28.8 mg/dL, 136.2±20.5 mg/dL, 96.8±30.7 mg/dL로 나타났다. 또, [도 11]에서 보는 바와 같이 고농도의 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물을 투여한 FATE400군에서 억제효과가 높은 것을 확인하였다.
| Week | 정상군 | 당뇨군 | ATE200 | ATE400 | FATE200 | FATE400 |
| 0 | 103.6±3.5 | 430.4±11.4 | 465.6±16.1 | 468.2±23.3 | 437.4±20.2 | 452.0±21.7 |
| 1 | 108.6±4.0 | 515.4±15.3 | 498.4±16.5 | 496.6±29.4 | 499.0±29.4 | 444.4±14.5 |
| 2 | 101.8±5.2 | 524.6±13.5 | 530.0±16.2 | 512.0±28.8 | 536.2±15.6 | 520.6±10.6 |
| 3 | 115.0±4.7 | 536.2±11.9 | 543.6±12.1 | 540.0±19.6 | 545.0±14.9 | 545.0±13.0 |
| 4 | 112.6±4.1 | 561.4±16.2 | 540.8±14.0 | 533.8±16.8 | 569.0±14.3 | 553.2±16.9 |
| 5 | 117.4±6.6 | 567.2±12.4 | 558.0±12.5 | 519.4±25.5 | 574.4±14.1 | 556.6±10.9 |
| 6 | 119.8±3.9 | 580.2±5.0 | 574.0±6.8 | 511.2±14.1 | 584.0±7.3 | 556.6±11.1 |
(6) 본 발명 실험동물의 경구 당 부하 검사
12시간 절식시킨 mice에 glucose를 2 g/kg의 용량으로 경구투여하고 혈액을 0, 30, 60, 120분 간격으로 꼬리정맥에서 채취하여 혈당 농도를 측정하였다. 당 부하 검사에 따른 혈당곡선 면적은 [수학식 3] 공식에 따라 산출하였다.
실험결과, 도 12에서 보는 바와 같이 정상군은 614.0±30.4 AUCOGTT, db/db군은 1854.3±11.7 AUCOGTT, 부추 추출물 및 본 발명 부추의 유산균을 혼합접종한 발효 추출물을 투여한 ATE200, ATE400, FATE200, FATE400군은 각각 1827.3±12.5 AUCOGTT, 1708.8±32.9 AUCOGTT, 1826.9±14.3 AUCOGTT, 1766.7±9.7 AUCOGTT로 나타남을 확인하였다.
(7) 본 발명 실험동물의 혈청 내 Insulin 농도 측정
실험 종료일에 각 실험군 mice의 심장으로부터 채취한 혈액을 원심분리한 후 혈청을 획득하고 Mouse Insulin ELISA Kit(Shibayagi, Gunma, Japan)를 이용하여 혈청 내 insulin 농도를 측정하였다. Anti-insulin coated 96 well plate에 본 발명 실험동물의 혈청 10 μL를 넣고 20~25℃에서 2시간 동안 방치한 후 Washing buffer로 4회 세척하였다. 상기 세척물에 HRP conjugated streptavidin 100 μL를 넣고 20~25℃에서 30분간 배양한 후 4회 세척한 다음 Substrate chromogen reagent 100 μL를 넣고 20~25℃에서 20분간 배양한 후, 50 μL의 Reaction stopper를 첨가하고 Multi Microplate Reader(infinite M200PRO, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm(reference wavelength, 620 nm)에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 도 13에서 보는 바와 같이 db/db군의 혈청 내 insulin 농도는 1331.90±302.16 pg/mL이었고 ATE200, ATE400, FATE200, FATE400군은 각각 793.55±163.31 pg/mL, 157.95±83.63 pg/mL, 1364.65±403.53 pg/mL, 479.44±221.71 pg/mL으로 나타났다.
(8) 본 발명 실험동물의 혈청 내 GLP-1 농도 측정
Anti-GLP-1 coated 96 well plate에 혈청 10 μL와 Buffer solution 40 μL를 혼합하여 각각의 well에 50 μL씩 분주하고 20~25℃에서 2시간 동안 방치한 후 Washing buffer로 3회 세척하였다. 상기 세척물에 Biotin-labeled anti-GLP-1 solution 50 μL를 넣고 20~25℃에서 2시간 동안 배양한 후 3회 세척한 다음 HRP-conjugated avidin solution 50 μL를 넣고 20~25℃에서 30분간 배양한 후 세척하였다. 상기 세척물에 Chromogenic substrate reagent 50 μL를 넣고 20~25℃에서 30분간 배양한 다음 50 μL의 Reaction stopper를 첨가하고 Multi Microplate Reader(infinite M200PRO, Tecan)를 이용하여 450 nm(reference wavelength, 620 nm)에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 도 14에서 보는 바와 같이 db/db군의 혈청 내 GLP-1 농도는 7.40±0.65 pg/mL이었고 ATE200, ATE400, FATE200, FATE400군은 각각 9.65±0.98 pg/mL, 15.52±2.26 pg/mL, 7.99±0.49 pg/mL, 11.80±1.60 pg/mL으로 나타났다.
본 발명은 유산균주를 이용하여 부추의 유산균발효 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항당뇨 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 기능성 식품 및 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (6)
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- 부추에 부추중량대비 10배의 물을 가하고 65℃에서 압력 추출한 다음 여과한 부추의 수추출물에 유산균주 L. casei와 L. plantarum를 중량비 1:1로 접종하여 혼합발효하는 것을 특징으로 하는 부추의 유산균 발효 추출물의 제조방법.
- 제 3항의 방법에 따라 제조된 부추의 유산균발효 추출물.
- 제 4항의 부추 유산균발효 추출물이 함유된 조성물.
- 제 4항의 부추 유산균발효 추출물이 함유된 당뇨병 예방 및 개선기능성 식품 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020140067242A KR101722584B1 (ko) | 2014-06-02 | 2014-06-02 | 부추의 유산균발효 추출물 및 이를 함유하는 항당뇨 조성물 |
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2014
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