KR20100017731A - 선택된 비병원성 미생물에 의한 천연 폴리사카라이드의 프로세싱 및 이의 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물반응기 시스템에서 프로바이오틱 세균과 함께 미리 배양된 하나 이상의 천연 폴리사카라이드로부터 제조된 식이 보충물을 제조하고 사용하는 방법 및 조성물을 포함하고, 이때 상기 세균이 폴리사카라이드를 프로세싱하여 생성된 프로세싱된 폴리사카라이드가 영양 보충물로 제공된다.
식이 보충물, 프로바이오틱 세균, 생물반응기 시스템, 프로세싱된 폴리사카라이드

Description

선택된 비병원성 미생물에 의한 천연 폴리사카라이드의 프로세싱 및 이의 제조 방법 및 사용 방법{Processing of natural polysaccharides by selected non-pathogenic microorganisms and methods of making and using the same}
본 발명은 일반적으로 프로바이오틱(probiotic) 유기체 분야 및 보다 특히 프로바이오틱 유기체에 의해 처리되고 프로세싱된 식이 보충물을 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 범위를 제한하는 것 없이, 이의 기술적 배경은 프로바이오틱 유기체와 관련하여 기재된다.
프로바이오틱 유기체는 건강에 다수의 양성적 효과를 가질 수 있다. 흔히, 프로바이오틱 유기체는 이들이 소화관에 진입하여 이의 일부에 군집하도록(colonize) 제공된다. 프로바이오틱 유기체는 이미 소화관에 군집한 국부 유기체에 대항한다. 이들 국부 유기체는 다른 유기체에 의한 군집화(colonization)를 억제하고 몇몇 경우에는 건강한 소화관 플로라(flora)의 발육에 해로울 수 있다. 목적하는 양성적 장내 플로라를 설정하기 위한 시도로 섭취되는 많은 프로바이오틱 유기체가 현재 사용가능하다. 그러나, 국부 유기체에 대항하도록 섭취된 프로바이오틱 배양물의 효과는 흔히 유기체가 표적 부위에 도달하여 국부 유기체를 제압하고 안정한 군집화를 형성하여 기존의 유기체에 대항하여 영양물에 대해 경쟁하는 능력에 의해 제한된다. 목적하지 않은 소화관 유기체를 사용하는 문제점은 이들이 흔히 점점 항생제에 내성이 되고 장내 점막에 양호하게 정착하게 됨으로써 국부 환경에 적응할 기회를 가져 영양물에 대해 효과적으로 경쟁하고 소화관으로부터 배출되지 않는다는 것이다.
프로바이오틱 군집화의 문제점을 해결하고자 하는 한가지 발명은 프로바이오틱 요구르트 식품 제조용 분말에 대한 미국 특허 제7,172,777호(슈미트 등(Schmitt, et al.)에게 허여됨)에 교시되어 있다. 간략하게, 슈니트는 미리 특정된 비율의 생존 프로바이오틱 락트산 세균을 갖는 프로바이오틱 배양물 및 장내 흡착 과정을 강화시키기 위한 열발생 지질 분해 흡착 증진제, 특히 고추 추출물 뿐만 아니라 장관내 모세관을 팽창시키기 위한 모세관 팽창제, 특히 니코틴산을 함유하는 프로바이오틱 요구르트 식품 제조용 분말을 교시하고 있다.
또 다른 발명은 식품 보충물로서 유용한 프로바이오틱 제형, 및 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 및 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)을 포함하는 이로운 프로바이오틱 미생물 플로라의 혼합물을 함유하는 체내 장관에 이로운 세균을 재설정하기 위한 요소, 프럭토 올리고사카라이드, L-글루타민 및 N-아세틸 글루코사민에 관하여 미국 특허 제6,468,525호(와트슨 등(Watson, et al.)에게 허여됨)에 교시되어 있다.
또 다른 발명은 과민성 대장 증후군과 연관된 증상을 완화시키기 위한 프로바이오틱으로서 사용하기 위한 식이 보충물 및 방법에 대해 미국 특허 제6,203,797호(페리(Perry)에게 허여됨)에 교시되어 있다. 교시된 식이 보충물은 프로바이오틱이고 과민성 대장 증후군의 증상을 완화시키기 위한 것이며 동결 건조된 알로에, 프럭토-올리고사카라이드 및 다흘리아 이눌린 주스 혼합물 및 임의로 비타민 B6(피리독신)망간 및 L-글루타민을 포함한다. 과민성 대장 증후군의 증상을 특이적으로 경감시키기 위한 추가의 또 다른 양태는 기본 규정식에 브로멜라인 및 파파인을 포함하는 것이다. 또한 특이적 프로바이오틱 기능을 위해 하기의 우호적인 세균: 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 및 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)이 기본 규정식에 첨가될 수 있다.
미국 특허 제6,060,050호(브라운 등(Brown et al.)에게 허여됨)는 식품에 포함시켜 영양적 가치를 증진시키기 위한 프로바이오틱 조성물을 교시하고 있다. 당해 조성물은 비피도박테리움과 같은 하나 이상의 프로바이오틱 미생물 및 미생물을 대장 또는 위장관의 다른 영역으로 수송하기 위한 담체를 포함한다. 당해 담체는 변형되거나 변형되지 않은 내성 전분, 특히 대장 또는 위장관의 다른 영역에서 미생물을 위한 증식 또는 보존 배지로서 작용하는 아밀로스 고함량 전분이다.
미국 특허원 제20070059296호는 15 내지 20중량%의 분유, 25 내지 30중량%의 옥수수 전분, 8 내지 15중량%의 변형된 전분(캅셀제), 10 내지 15중량%의 에틸셀룰로스, 5 내지 15중량%의 세균 브로쓰 및 10 내지 15중량%의 탈크를 포함하는 산 내성 장용피를 갖는 프로바이오틱 조성물을 교시하고 있다. 프로바이오틱 조성물은 미세캅셀화되어 장내 산 내성, 프로바이오틱 생존율, 항미생물성 성질, 안정성, 방습(moisture-proof) 성질 및 습윤 환경에서 응고되는 것을 차단하는 프로바이오틱 조성물의 이동성을 개선시키고 가축 사료에 적용되는 첨가제로서 사용하기 위한, 산 내성 장용피로 피복된 다수의 미세캅셀제를 형성한다.
발명의 개요
다양한 전달 방법을 통해서 및 다양한 양으로 다양한 형태의 프로바이오틱 유기체 전달에 의한 소화관 플로라를 재구성하기 위한 많은 시도가 있었지만 여전히 생체이용가능한 영양물을 갖는, 유기체의 식이 보충물이 필요하다. 본 발명자는 소화관내 및/또는 유리한 소화관 플로라의 재구성 동안에 변화가 부재인 경우 이들 공생 미생물이 숙주에 의해 소비된 음식물로부터 생성하는 영양물에 대한 필요성이 여전히 존재함을 인지하였다. 공생 소화관 미생물은 사용되지 않은 에너지 기질을 발효시키는 것; 면역계를 활성화시키는 것; 비공생 또는 해로운 종의 성장을 방지하는 것; 숙주를 위해 비타민 및 영양물 전구체(비오틴 및 비타민 K를 포함함)를 생성하는 것 및 특정 호르몬 또는 호르몬 전구체를 생성하는 것을 포함하는 다수의 유리한 기능을 숙주에게 제공한다.
본 발명은 일반적으로 생물학적 공정에 대한 미생물 종을 사용하여 천연 폴리사카라이드를 식이 보충물 또는 음식물로서의 용도를 갖는 유용한 생성물로 전환시키기 위한 신규 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 생물반응기 시스템에서 천연 폴리사카라이드와 선택된 프로바이오틱 세균을 배합하는 단계 및 세균이 체외부에서 폴리사카라이드를 프로세싱하도록 하는 단계를 포함한다. 이어서 생물반응기의 생성물을 사용하여 음식물 또는 식이 보충물을 제조한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 특정 투여 형태의 선택된 천연 폴리사카라이드 및 선택된 비병원성(프로바이오틱) 미생물 종을 필요한 프로-프로바이오틱 영양물 및 공생 유기체를 동시에 전달하면서 영양 보충물을 제공하기 위해 배합한다. 이들 물질을 사람 GI 관으로 동시에 투여함으로써 비병원성 미생물 종에 의한 폴리사카라이드의 다른 유리한 생성물로의 프로세싱은 사람 위장관의 영역내에서 달성될 수 있다.
선택된 폴리사카라이드 성분에 대한 미생물 프로세싱으로부터 생성된 신규 생성물은 (1) 점막 연합 림프망상 조직(MALT)과의 상호작용에 의해 GI 관 및 전신 면역 기능을 개선시키는 것; (2) (a) GI 관 소화 및 영양물 흡수 효율을 개선시키고; (b) 사람 GI 관내에 목적하지 않은 미생물 종을 감소시키고; (c) 도입된 프로바이오틱 미생물 및 폴리사카라이드 생성물을 사람 GI 관내에 다양한 조절 인자(즉, 호르몬 수용체)와 상호작용시킴에 의해 체중을 관리하고 비만을 감소시키는 것; 및/또는 (3) 콜레스테롤 감소와 같은 혈액 지질 파라미터를 개선시키고 트리글리세라이드 수준을 감소시키는 것을 포함하는, 사람 건강에 대해 유용한 효과를 가질 것으로 예상된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 생물반응기 시스템에서 프로바이오틱 세균과 함께 미리 배양된 하나 이상의 천연 폴리사카라이드로부터 제조된 보충물을 포함하는 식이 보충물이고, 이때, 당해 세균이 폴리사카라이드를 프로세싱하여 생성된 프로세싱된 폴리사카라이드가 영양 보충물에 제공된다. 하나의 양태에서, 생물반응기로부터 수득된 프로세싱된 폴리사카라이드는 음식물 또는 식이 보충물에 적용되고, 예를 들어, 단일 투여 형태로 적용된다. 본 발명에 사용하기 위한 폴리사카라이드는 하나 이상의 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무를 포함한다. 하나의 양태에서, 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포는 단일 투여 형태로 별도로 제공된다. 또 다른 양태에서, 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포는 생물반응기에서 배양한다. 또한 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포는 지연 방출 형태로 제공될 수 있다. 폴리사카라이드의 예는 헤테로폴리사카라이드, 호모폴리사카라이드 또는 이 둘다를 포함한다. 식이 보충물의 한 예에서 폴리사카라이드는 미생물 세포로부터 분리되고, 당해 분리된 폴리사카라이드는 산제, 캅셀제, 겔캡, 정제, 비등성 정제, 액제 또는 고무질로부터 선택된 투여 형태에 로딩된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 천연 폴리사카라이드 및 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 아세토박터(Acetobacter), 캔디다(Candida), 클루베로마이세스(Kluveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 토룰라(Torula), 토룰라스포라(Torulaspora), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 박테리오이데스(Bacterioides), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 루미노코커스(Ruminococcus) 및 페디오코커스(Pediococcus) 중 하나 이상을 포함하는 프로바이오틱 음식물 또는 식이 보충물이다. 당해 폴리사카라이드는 하나 이상의 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무일 수 있다. 하나의 양태에서, 당해 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포는 단일 투여 형태로 별도로 제공된다. 또 다른 양태에서 당해 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포는 생물반응기에서 배양된다. 또 다른 양태에서, 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포는 지연 방출 형태로 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물반응기에서 비병원성 프로바이오틱 미생물 종에 의한 선택된 천연 폴리사카라이드의 프로세싱 기원의 추출물을 포함하는 식이 보충물이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 천연 폴리사카라이드의 세균에 의한 프로세싱을 자극하는 조건하에서 하나 이상의 천연 폴리사카라이드를 생물반응기 시스템에서 프로바이오틱 세균과 혼합하여 프로세싱된 폴리사카라이드를 제조하는 단계; 및 천연 폴리사카라이드의 적어도 일부를 세균으로 프로세싱한 후 식이 보충물 을 제조하는 단계에 의해 식이 보충물을 제조하는 방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 당해 세균이 폴리사카라이드를 프로세싱하여 생성된 프로세싱된 폴리사카라이드가 단일 투여 영양 보충물로 제조된다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 추가로 천연 폴리사카라이드 및 세균으로부터 프로세싱된 폴리사카라이드를 분리하는 단계 및 프로세싱된 폴리사카라이드를 포함하는 투여 형태를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 방법은 프로세싱된 폴리사카라이드, 천연 폴리사카라이드 및 세균을 포함하는 투여 형태를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 방법은 프로세싱된 폴리사카라이드가 산제, 캅셀제, 겔갭, 정제, 비등성 정제, 액제 또는 고무질로부터 선택된 투여 형태에 로딩됨을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 프로세싱된 폴리사카라이드는 세균으로부터 분리되고 프로세싱된 폴리사카라이드는 산제, 캅셀제, 겔캡, 정제, 비등성 정제, 액제 또는 고무질로부터 선택된 투여 형태에 로딩한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 생물반응기 또는 발효기 시스템에서 프로바이오틱 세균과 함께 배양된 프로세싱된 알로에 베라 내엽 겔을 포함하는 식이 보충물 또는 식품이고 이때 당해 세균은 알로에 베라 내엽 겔을 생체이용가능한 생성물로 프로세싱한다. 하나의 양태에서, 프로바이오틱 세균은 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로마이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 자이고사카라마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 세 균을 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 보다 완전하게 이해하기 위하여 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명을 참조하고 여기서:
도 1은 5,000, 10,000 및 800,000의 폴리말토트리오스 MW 표준물의 HPLC 체류 시간의 다이아그램이고 y-축은 MW이고 x-축은 체류 시간(분)이다.
도 2는 4명의 대상체 사람 결장 세균을 사용한 72시간 배양 후 낙엽송 아라비노갈락탄(LAC) 최종 생성물을 보여주는 다이아그램이다.
도 3은 4명의 환자의 결장 세균을 사용한 72시간 배양 후 알로에 베라 겔 폴리사카라이드(AVP) 최종 생성물을 보여주는 다이아그램이다.
도 4는 4명의 환자의 세균을 사용한 72시간 배양 후 혼합된 사카라이드 보충물(MSS) 최종 생성물을 보여주는 다이아그램이다.
하기에 상세히 논의된 본 발명의 다양한 양태를 제조하고 사용하면서, 본 발명이 다양한 종류의 특정 배경에서 구체화될 수 있는 많은 적용가능한 발명의 개념을 제공한다고 이해되어야 한다. 본원에 논의된 특정 양태는 단지 본 발명을 제조하고 사용하는 특정 방법을 설명한 것이고 발명의 범주를 제한하지 않는다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 다양한 용어가 하기에 정의된다. 본원에 정의된 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 용어 "부정관사(a, an)" 및 "정관사(the)"는 단수를 나타내려고 하는 것이 아니고, 특정 예시가 설명을 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함한다. 본원의 용어는 본 발명의 특정 양태를 기재하기 위해 사용되지만, 이의 용도는 청구항에 약술된 바를 제외하고는 본원을 제한하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "영양학적 유효량"은 포유동물에서 이로운 영양학적 효과 또는 반응을 제공하는 양을 정의하는데 사용된다. 예를 들어, 식이 보충물에 대한 영양학적 반응은 포유동물 마다 다양하기 때문에, 선택된 프로바이오틱 세균과 천연 폴리사카라이드의 영양학적 유효량은 각각 다양할 것으로 이해되어야만 한다. 본 발명은 불활성화된 프로바이오틱 세균 및 천연 폴리사카라이드와 배합된, 프로바이오틱 세균으로부터 분리된(프로바이오틱 세균으로부터 적어도 부분적으로 분리된) 프로바이오틱 세균에 의해 가공된 천연 폴리사카라이드 및 프로바이오틱 세균 둘다를 포함한다.
당업자는 특정 개체가, 프로바이오틱 세균에 의해 전처리된 천연 폴리사카라이드인 하나 이상의 배합 제제로부터 이로움을 받을 수 있을 것임을 인지할 것이고, 예를 들어, 정상적인 소화관 플로라를 갖는 개체들, 추가의 프로바이오틱 보충을 필요로 하지 않는 개체들 및 심지어 프로바이오틱 세균을 피하는 개체들이 있다. 또한, 선택된 프로바이오틱 세균과 함께 천연 폴리사카라이드의 결핍은 생리학적 및 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다.
본원에 기재된 선택된 프로바이오틱 세균과 함께 영양학적 유효량의 천연 폴리사카라이드는 예를 들어, 영양 보충물에 대한 식이를 유지하거나 증강시키고자 하는 사람의 식이에서 당해 중요한 영양물의 수준을 보존하고/하거나 상승시키는 작용을 한다. 따라서, 하나의 포유동물은 규정된 양으로 존재하는 선택된 프로바이오틱 세균과 함께 천연 폴리사카라이드의 특정 프로필을 필요로 할 수 있고 또 다른 포유동물은 상이한 규정된 양으로 존재하는 비타민 및 무기물의 동일한 특정 프로필을 필요로 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "사카라이드", "폴리사카라이드", "천연 폴리사카라이드", "당영양학적" 또는 "당영양물"은 탄수화물, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 또는 모노사카라이드를 의미하고 이들은 측쇄이거나 직쇄이거나 유도체화되거나 유도체화되지 않거나 복합 형태이거나 단순 형태일 수 있고 이는 천연 공급원으로부터 수득될 수 있고 다양한 부류의 신호전달 분자 및 시그날 분자의 생화학적 합성을 위해 필요하고 당해 분자는 간질 세포 체액에서 유리되어 있거나 세포간 신호전달 분자(즉, 사이토카인, 성장 인자 등)로서 세포에서 활성이거나 고도로 특이적인 세포막의 분자 활성의 부위를 포함하는 분자 형태(즉, 수용체 부위, 이온-수송 채널, 항원 확인 등)를 구성한다.
본 발명의 천연 사카라이드는 모노-, 올리고- 및/또는 폴리사카라이드로서 천연에서 발견될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 이들 단량체 형태, 올리고머 형태 및 중합체 형태의 사카라이드를 포함할 수 있다. 천연 폴리사카라이드 및 이의 용도에 대한 공지된 천연 공급원의 목록에 대해 미국 특허원 제US2003072770호를 참조하고 관련 사카라이드 및 사카라이드 공급원은 본원에 참조로서 인용된다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 활성제는 변형되거나 지연된 방출 형태로의 전달을 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 당해 제제가 산 민감성인 경우, 당해 제제는 장용피와 함께 전달되어 방출 전에 장관에 도달할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "변형된 방출", "연장된 방출" 및 "조절된 방출"은 연장된 시간 동안 영양학적 유효량의 영양물을 전달시키기 위한 하나 이상의 방출 프로필을 기술하는 것이고 당해 연장 시간은 본 발명의 제형을 사용하여 약 60분 내지 약 2, 4, 6 또는 8시간 이상인 것으로서 정의된다. 변형된 방출은 또한 기능적으로 약 60분 및 약 2, 4, 6 또는 8시간 후 영양물의 80 내지 90% 이상의 방출로서 정의될 수 있다. 당해 방출은 또한 몇몇 활성제가 동물에 의해 결코 흡수될 수 없기 때문에 흡수와는 상관없이 사용자에게 유용한 천연 비타민 또는 천연 무기물을 제조함에 의해 평가될 수 있다. 다양한 변형된 방출 투여 형태는 본원에 기재된 바와 같이 당업자에 의해 용이하게 디자인되어 피복물 및/또는 피복 두께의 선택에 따라 소장 및 대장 모두에게 전달되거나 단지 소장에게 전달되거나 단지 대장으로 전달될 수 있다.
장쇄 폴리사카라이드에게 적용될 수 있는 변형의 예는 예를 들어, 장쇄 폴리사카라이드내 사카라이드의 유형 또는 조성을 변화시키거나 사카라이드의 측쇄를 화학적으로 변형(유기적으로 또는 화학적으로)시키거나(예를 들어, 아세틸화), 장쇄 폴리사카라이드를 가수분해시키거나, 장쇄 폴리사카라이드를 크기별로 분류하거나 보다 긴 장쇄 폴리사카라이드를 중합화하거나 보다 짧고 보다 긴 장쇄 폴리사카라이드의 조합을 선별하거나 예를 들어, 전기천공, FPLC, HPLC, 크기-배제, 크기-배제 크로마토그래피 및 침전 등에 의해 장쇄 폴리사카라이드를 분리시키는 것을 포함한다. 연장된 방출 제형은 어떠한 변형된 방출 변화가 없는 경우에 달성될 위치와 보다 떨어진 하부 장관에서의 일반적으로 예상가능한 몇몇 위치에서 방출되도록 제조되고 전달될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "탄수화물"은 탄수화물 화학 분야에서 당업자에게 정의가 널리 공지된 용어 "사카라이드", "폴리사카라이드", "올리고사카라이드" 및 "당"과 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 조성물이 2개 이상의 필수 사카라이드를 포함하지만 당해 사카라이드는 모노-, 올리고- 및/또는 폴리사카라이드 형태일 수 있는 것으로 주지되어야만 하고 예를 들어, 트라가칸트 고무 및 구아 고무를 함유하는 조성물은 갈락투론산, 시알산, 만노스 및 갈락토스를 포함하는 것으로 간주된다. 따라서, 소정의 식이 보충물에서 특정 고무의 양을 조절함으로써 식이 보충물에서 각각의 사카라이드의 양을 조절할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "분리된"은 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분획화되고 실질적으로 이의 발현된 생물학적 활성을 보유하는 유기 분자 또는 유사 분자 그룹을 의미한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우 이러한 지정은 조성물의 영양물 형태가 조성물내 총 분자의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상을 차지하는 조성물을 의미한다. 몇몇 경우에, 활성 형태의 영양물은 이의 활성에 영향을 주지 않으면서 정상적인 세포 환경에서 성공적으로 제거될 수 없다. 사실, 본 발명은 최고 품질 및 최고 양의 영양학적 활성 화합물을 전달하기 위해 생물반응기에서 프로바이오틱 미생물에 의한 폴리사카라이드의 천연 프로세싱을 이용한다. 그러나, 몇몇 경우에 프로세싱 또는 "분리"의 수준, 화합물의 효과 및 환경에 대한 총 비용 및 영향간에 균형이 달성된다. 당업자는 환경의 보존에 관여함과 동시에 화합물의 효과를 최대화할 수 있음을 인지할 것이다. 식물의 경우, 예를 들어, 천연 식물의 경우, 본 발명에 사용하기 위해 분리된 영양약적 화합물을 포함하는 식물 생산의 영향을 최소화하기 위해 지역 문화 및 사회와 균형을 유지해야만 한다.
본 발명에서 사용되는 천연 폴리사카라이드와 프로바이오틱 세균의 유용한 투여 형태를 제조하기 위한 기술 및 조성은 하기의 문헌 중 하나 이상에 기재되어 있고 당해 문헌은 본원에 참조로서 인용된다: Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Edition (1976); Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985); Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992); Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7. (David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995); Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989); Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 61 (Alain Rolland, Ed., 1993); Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.); Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.) 등.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 정제에 함유될 수 있다. 정제는 예를 들어, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 향제, 유동화제, 고무 제제, 츄잉제 및/또는 용융제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여는 정제, 겔캡, 정제 또는 캅셀제의 투여 단위 형태일 수 있고 활성 약물 성분은 비독성의 약제학적으로 허용되는 불활성 담체, 예를 들어, 락토스, 젤라틴, 한천, 전분, 슈크로스, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘, 황산칼슘, 만니톨, 소르비톨 및 이의 혼합물 등과 배합된다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 결합제는 다음을 포함한다: 전분, 젤라틴, 천연당(예를 들어, 글루코스 또는 베타-락토스), 옥수수 감미제, 천연 및 합성 고무(예를 들어, 아카시아, 트라가칸트 또는 나트륨 알기네이트), 카복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 왁스 등. 본 발명에 사용하기 위한 윤활제는 다음을 포함할 수 있다: 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 인산이칼슘, 및 이의 혼합물 등. 붕해제는 다음을 포함할 수 있다: 전분, 메틸 셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 크산탄 고무 및 이의 혼합물 등.
본 발명의 식이 보충물에 포함되는 폴리-, 올리고-, 디- 또는 모노-사카라이드는 광범위한 천연 및 합성 공급원, 예를 들어, 관목, 나무, 식물, 효모, 진균류, 곰팡이, 고무, 수지, 전분 및 셀룰로스 유도체 및 천연 뮤신(mucin) 공급원으로부터 수득할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 폴리사카라이드의 몇몇 천연 공급원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: (a) 아카시아, 카라야, 트라가칸트 또는 가티를 포함하는 관목 또는 나무 삼출물; (b) 한천, 알긴 또는 카라기난을 포함하는 해양 고무; (c) 구아, 로커스트 빈 또는 실리움을 포함하는 종자 고무; (d) 펙틴 또는 아세틸화된 폴리만노스를 포함하는 식물 추출물; (e) 전분 및 셀룰로스 유도체, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 산화된 셀룰로스; 및 덱스트란 및 크산탄을 함유하는 미생물 고무. 그러나, 본 발명의 조성물은 각각의 사카라이드가 수득되는 공급원에 의해 제한되지 않는 것으로 인지되어야만 한다.
본원에 사용된 용어 "식물-유래된", "식물 분말", "식물 추출물" 및 "약초 추출물"은 식물 조직에서 생성되고 본 발명의 프로바이오틱 미생물에 의해 프로세싱될 수 있는 폴리-, 올리고-, 디- 또는 모노-사카라이드의 천연 공급원을 의미하는데 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 일부를 형성하는 천연 공급원의 폴리-, 올리고-, 디- 또는 모노-사카라이드에 대한 천연 공급원은 전형적으로 예를 들어, 물을 제거(예를 들어, 주스 및/또는 펄프를 추출)하거나 화학적으로 기계적으로, 열적으로 하나 이상의 성분을 추출하거나, 크기 또는 다른 것을 토대로 극성, 비극성, 무기물, 석유 또는 기타 용매를 사용하여 어느 정도 건강에 이롭거나 치료학적 활성을 갖는 성분을 분리함에 의해 이의 천연 상태로부터 식물의 적어도 일부를 분리하는 것이다. 식물로부터 활성제의 분리는 활성제의 특성, 예를 들어, 수용성, 비가용성 및 혼화성 등, 분해에 대한 민감성(예를 들어, 열, pH, 산소, 광 등에 의한 변성)에 의존한다. 식물 추출물은 또한 벌크 액체가 제거되어 식물 또는 약초에서 생체이용가능한 고체가 농축된 탈수된 식물 물질을 포함한다. 대부분의 약초 제제는 특히 농축된 경우 독성일 수 있지만 질환의 치료 및 양호한 건강 촉진을 위한 전통 약물로서 차 및 찜질약에서 보다 통상적인 방식으로 사용되는 경우 일반적으로 안전하다.
프로바이오틱은 생 비병원성 및 비독성 미생물 종이고 락토바실러스 종, 비피도박테리아 종 및 효모를 포함하고 이들은 위장(GI)관 마이크로플로라의 천연 구성물일 수 있거나 특정 음식물 또는 식이 보충물 사용한 보충을 통해 GI 관 마이크로플로라의 집단으로 도입될 수 있다. 프로바이오틱은 섭취시 장 마이크로플로라의 균형을 개선시킴에 의해 숙주 유기체에 이로운 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 최근 연구는 특정 생 미생물이 기타 건강 이득 뿐만 아니라 면역 조절 및 항암 효과를 가질 수 있음을 시사한다. GI 관의 몇몇 마이크로플로라는 또한 발효와 같은 과정에 의해 특정 음식물의 소화를 수행한다. 장 마이크로플로라는 면역계의 성숙화, 정상적인 장 형태의 발달에 중요하고 만성 및 면역학적으로 균형된 염증 반응을 유지하기 위해 중요하다. 마이크로플로라는 장 점막의 장벽 기능을 강화하여 병원체의 접착 및 알레르기성 물질의 진입을 차단한다. 현재 특정한 건강 증진 효과를 위해 선택된 특성이 널리 밝혀진 세균을 사용하는 표적화된 프로바이오틱에 대한 과학적 연구가 보다 활발하게 진행되고 있다. 현재, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) 및 사카로마이세스 불라르디(Saccharomyces boulardii) 뿐만 아니라 다양한 종의 비피도박테리움 및 락토바실러스가 프로바이오틱으로서 문헌[Physician's Desk Reference (PDR)]에서 인정되고 있다.
산제. 프로바이오틱-프로세싱된 폴리사카라이드는 산제 형태로 제공될 수 있다. 산제 형태는 또한 본원에 기재된 바와 같은 프로바이오틱 세균 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 흔히 산제 형태는 또한 하나 이상의 담체, 부형제, 습윤화제, 유동화제, 향제 및 착색제등을 포함할 수 있고 이들은 외관 및 감촉을 증가시키고 산제의 보존을 도와준다.
캅셀제. 캅셀제는 2-조각 경질 젤라틴 캅셀에 각각 1 내지 1000mg의 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드를 충전시킴에 의해 제조될 수 있다. 당해 캅셀제에는 부형제 및 담체 등, 예를 들어 0.5 내지 150mg의 락토스, 0.1 내지 500mg의 셀룰로스 및 0.1 내지 60 mg의 마그네슘 스테아레이트를 충전시킬 수 있다. 당해 캅셀제는 또한 본원에 기재된 바와 같은 프로바이오틱 세균을 포함할 수 있다.
연질 젤라틴 캅셀제. 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드의 혼합물은 대두 오일, 면실유 또는 올리브 오일 등과 같은 소화가능한 오일 중에 용해된다. 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드는 양성 대체 펌프를 사용하여 젤라틴으로 주입되어 예를 들어, 100 내지 500mg의 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드를 함유하는 연질 젤라틴 캅셀제를 형성한다. 연질 겔 캅셀제는 세척하고 건조시킨다. 연질 겔 캅셀제는 또한 본원에 기재된 바와 같은 프로바이오틱 세균을 포함할 수 있다.
정제. 정제는 투여 단위가 100 내지 500mg의 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드, 0.2mg의 콜로이드성 이산화규소, 5mg의 마그네슘 스테아레이트, 50 내지 275mg의 미세결정 셀룰로스, 11mg의 전분 및 98.8mg의 락토스를 갖도록 통상적인 과정에 의해 제조된다. 적당한 피복물을 적용하여 기호성을 증가시키거나 흡수를 지연시킬 수 있다. 당해 정제는 또한 본원에 기재된 바와 같은 프로바이오틱 세균을 포함할 수 있다.
비등성 정제를 제공하기 위해, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트 및 중탄산나트륨을 적당한 양으로 함께 혼합함에 이어서 물의 부재하에 롤러 압착시켜 플레이크를 형성하고 이어서 분쇄하여 과립물을 수득한다. 이어서 당해 과립물은 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드, 약물 및/또는 이의 염, 통상적인 발포제 또는 충전재 및 임의로, 감미제, 향제 및 윤활제와 배합한다. 비등성 정제는 또한 본원에 기재된 바와 같이 프로바이오틱 세균을 포함할 수 있다.
현탁제. 수성 현탁제는 경구 투여용으로 제조되어 각 5ml은 100mg의 미세 분할된 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드, 200mg의 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 5mg의 나트륨 벤조에이트, 1.0g의 소르비톨 용액, U.S.P., 및 0.025ml의 바닐린을 함유한다. 당해 현탁제는 또한 본원에 기재된 바와 같은 프로바이오틱 세균을 포함할 수 있다.
소형 정제를 위해, 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드는 6 내지 12 Kp 범위로 단단하게 타정된다. 최종 정제의 경도는 예를 들어, 탄산수소일나트륨 및 탄산수소나트륨의 입자 크기에 의해 영향받는 과립물을 제조하는데 사용되는 선형 롤러 압착 강도에 의해 영향을 받는다. 보다 작은 입자 크기를 위해 약 15 내지 20 KN/cm의 선형 롤러 압착 강도가 사용될 수 있다.
고무질의 소모품을 위해, 본 발명은 관련 부분이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제5,928,664호(양 등(Yang, et al.)에게 허여됨)의 교시와 조합될 수 있다. 간략하게, 본 발명에 교시된 소모성 고무질의 전달 시스템은 젤라틴 및 글리세린 수용액을 초기 수용액의 수분 함량을 제거하기에 충분한 시간 동안 특정 온도로 가열시킴에 의해 제조된 글리세릴화된 젤라틴 매트릭스와 혼합된 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드를 포함하는 고무질 전달 시스템으로 조합된다. 본원에 교시된 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드는 전단형태 매트릭스 담체로부터 전달될 수 있다. "고무질 밀도"를 제공하는 식물 기본 제형을 위해, 본 발명은 예를 들어, 관련 부분이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제6,586,036호(그라젤라 등(Grazela, et al.)에게 허여됨)에 교시된 조성물 및 방법을 사용할 수 있다. 간략하게, 젤라틴 부재 고무질 과자는 젤라틴 부재 고무질 과자에서 단단한 탄력성 있는 젤라틴형 구성을 제공하는 젤란 고무 및 카라기난을 사용한다. 당해 고무질 소모품은 또한 본원에 기재된 바와 같은 프로바이오틱 세균을 포함할 수 있다.
또한 박테리오이데스 테타이오타오마이크론(Bacterioides thetaiotaomicron)과 같은 특정 종의 GI 관 마이크로플로라는 사람에 의해 생성된 정상적인 소화 효소에 의해 분해될 수 없는 베타-결합된 식물 섬유와 같은 물질의 소화를 도와줄 수 있는 효소를 생성하는 것으로 공지되어 있다. 박테리오이데스 테타이오타오마이크론은 명백하게 베타-글루코실하이드롤라제 효소를 생성함에 의해 이를 달성한다. 이들 효소 및 기타 물질의 생성은 특이적 폴리사카라이드 기질에 노출시킴에 의해 유도되는 것으로 나타난다. 이들 효소들중 일부는 세포외로 분비되는 것으로 보고되어 있다. 몇몇 최근 연구는 또한 숙주 분자 푸코실화를 유도하고, 혈관형성을 자극하고 장에서 고유 면역 반응을 유도하는 것으로 박테리오이데스 테타이오타오마이크론에 대한 역할을 밝혔다. 박테로이데스(Bacteroides)의 또 다른 종인 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)는 최근에 마우스의 발육 면역계의 세포 및 물리적 성숙화를 지시하는 세균 폴리사카라이드(PSA)를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 박테리오이데스 종이 가장 초기에 군집화하고 수적으로 장 마이크로플로라에서 많은 부분을 차지하기 때문에 중요하다. 특히, 박테로이데스 프라길리스는 편재하고 중요한 그람-음성 혐기성 세균이고 포유동물 하부 위장관에 군집한다.
박테리오이데스 테타이오타오마이크론과 같은 세균 종에 의한 세포외 베타-글루코실하이드롤라제 효소의 방출은 베타 결합된 폴리사카라이드를 보다 작은 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 및 단순 모노사카라이드 및 디사카라이드 당으로 분해시킬 수 있다. 사실, 소형, 중형 및 장쇄 폴리사카라이드를 함유하는 낙엽송 아라비노갈락탄을 사용하여 연속 배양물에서 성장하는 박테리오이데스 테타이오타오마이크론의 능력은 입증되었다. 이어서 이들 효소적 분해 생성물은 다른 미생물에 의해 흡수되고 이용될 수 있거나 장을 통해 사람 신체에 의해 흡수될 수 있다. 엔테로박테리아 및 락트산 생산 세균과 같은 특정 미생물 종에 의한 세포내 발효가 집중적으로 연구되는 동안 사람 GI 관내 박테리오이데스 테타이오타오마이크론과 같은 세균에 의한 세포외 효소 분해의 실제 생물학적 중요성은 명백하게 집중적으로 조사되지 않았다.
락트산 세균인 엔테로코커스는 생태학적으로 다재다능하고 광범위한 온도 및 pH 조건에 내성일 수 있다. 이는 사람의 소장 및 대장에 군집한다. 본 연구에서 모든 3개의 IP에 대해 최상으로 경쟁할 수 있는 2개의 세균, 이.파에칼리스(E. faecalis)와 이.파에시움(E. faecium)은 보편적인 프로바이오틱이다. 사람 프로바이오틱 보충물 연구는 당해 두 종 모두 면역계를 자극할 수 있음을 입증하였다. 이.파에시움은 또한 혈청 콜레스테롤을 감소시키고 염증 반응에 관여하는 세포 수용체의 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
프리바이오틱(prebiotic)은 특정 GI 관 미생물의 성장 또는 활동을 자극하는 식품 성분이다. 시판되는 프리바이오틱은 일반적으로, 비피도박테리아 및 락토바실러스 종과 같은 특정한 이로운 락트산 세균에 의한 혐기적 발효 대사를 통해 선택적으로 사용되는 식물 기원의 소화불가능한 폴리사카라이드이다. 몇몇 공통적으로 사용되는 프로바이오틱은 이눌린, 프럭토올리고사카라이드(FOS) 및 예루살렘 아티초크(Jerusalem artichoke)를 포함한다.
실시예 1. 선택된 폴리사카라이드 기질에 대한 증진된 성장을 위한 프로바이오틱 배양물의 선택.
사람 GI 관내에 존재하는 세균의 상이한 종 및 균주는 상이한 폴리사카라이드 기질을 사용하는 능력을 갖는다. 예를 들어, 비피도박테리움, 펩토스트렙토코커스, 락토바실러스, 루미노코커스, 코프로코커스, 유박테리움 및 푸소박테리움의 22개 상이한 종 기원의 154개 균주 연구에서 이들의 21개 상이한 복합 탄수화물을 발효시키는 능력이 조사되었다. 일반적인 식품 폴리사카라이드 전분(아밀로스) 및 아밀로펙틴은 조사 대상인 대부분의 세균 균주에 의해 발효되었다. 조사된 22개 종 중 7개 종에서의 몇몇 균주가 아밀로스 및/또는 아밀로펙틴을 사용할 수 있었다. D-갈락토사민, 덱스트란, 카라야 고무, 푸코이단, 알기네이트, 카라기난, 콘드로이틴 설페이트, 하이알루로네이트, 헤파린, 오보뮤코이드 및 육우 하악골 뮤신은 시험된 어떠한 균주에 의해서도 발효되지 않았다. 조사에 포함된 기타 폴리사카라이드인 글루코사민, 푸코스, 크실란, 낙엽송 아라비노갈락탄, 구아 고무, 로커스트 빈 고무, 아라비아 고무, 가티 고무, 트라가칸트 고무, 펙틴, 폴리갈락투로네이트 및 라미나린은 특정 세균 균주에 의해 선택적으로 발효되었지만 기타 다른 것에 의해서는 발효되지 않았다. 당해 연구는 이것이 선택된 폴리사카라이드의 발효를 통해 선택적 프로세싱에 대한 사람 GI 관 기원의 세균 균주를 선택할 수 있음을 보여준다.
발효된 채소, 요구르트, 케피르, 이머, 버터밀크 및 라반과 같은 배양된 식품은 사람 소비용 식품을 제조하기 위해 다양한 미생물을 사용한다.
다양한 세균 및 효모 종은 당해 식품의 제조에서 안전하게 사용된다. 이들 미생물은 사람 식품에서 안전하게 사용되는 오랜 이력을 갖고 있고 정제된 장쇄 폴리사카라이드 화합물을 보다 작은 생물학적 활성 화합물, 예를 들어, 보다 짧은 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드로 프로세싱하는 이들의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 우수한 후보물이다. 당해 프로세싱은 당해 미생물 중 하나 이상과 천연 폴리사카라이드가 사람 또는 기타 동물로 동시에 투여되도록 하는 특정 형태로 배합함에 의해 생체내에 존재하도록 조작될 수 있다. 당해 첫번째 예시로서, 미생물에 의한 폴리사카라이드의 프로세싱은 GI 관을 통한 이동 동안에 일어난다. 또는, 당해 미생물 및 폴리사카라이드는 조절된 물리적 조건(즉, 영양물, 온도, 수소 이온 농도, 산화/환원 포텐셜, 산소 사용가능성, 수활성, 염 농도 등)하에 기계적 발효 장치에서 배합될 수 있고 목적하는 최종 생성물(즉, 허용되는 비율의 보다 짧은 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드)이 생성될 때까지 배양할 수 있다.
케피르 곡물에서 발견되는 전형적인 미생물은 다양한 세균과 효모의 안정하게 혼합된 배양물이고 다음을 포함한다:
● 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophillus)
● 엘비.브레비스(Lb . brevis)
● 엘비.카제이(Lb . casei)
● 엘비.락티스(Lb . lactis)
● 엘비.플란타룸(Lb . plantarum)
● 엘비.파라카제이(Lb . paracasei)
● 엘비.셀로비오서스(Lb . cellobiosus)
● 엘비.델브루엑키(Lb . delbrueckii)
● 엘비.프럭티보란스(Lb . fructivorans)
● 엘비.헬베티커스(Lb . helveticus)
● 엘비.힐가르디(Lb . hilgardii)
● 엘비.케피리(Lb . kefiri)
● 엘비.케피라노파시엔스(Lb . kefiranofaciens)
● 엘비.케피르그라눔(Lb . kefirgranum)
● 엘비.파라케피르(Lb . parakefir)
● 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)
● 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)
● 에스.써모필리스(S thermophilis)
● 에스.락티스(S. lactis)
● 엔테로코커스 듀란스(Enterococcus durans)
● 류코노스톡 크레모리스(Leuconostoc cremoris)
● 류크. 메센테로이데스(Leuc . mesenteroides)
● 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti)
● 에이.라센스(A. rasens)
● 캔디다 케피르(Candida kefir)
● 씨.슈도트로피칼리스(C. pseudotropicalis)
● 씨.란센스(C. rancens)
● 씨.테누이스(C. tenuis)
● 클루베로마이세스 락티스(Kluveromyces lactis)
● 케이.마르시아누스(K. marxianus)
● 케이.불가리쿠스(K. bulgaricus)
● 케이.프라길리스(K. fragilis)
● 사카로마이세스 케피르(Saccharomyces kefir)
● 에스.세르비지애(S. cervisiae)
● 에스.락티스(S. lactis)
● 에스.칼스버겐시스(S. carlsbergensis)
● 에스.유니스포루스(S. unisporus)
● 에스.로욱시(S. rouxii)
● 토룰라 케피르(Torula kefir)
● 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii)
● 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii)
● 자이고사카로마이세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii)
채소 및 유제품의 발효에 사용된 몇몇 전형적인 세균은 다음을 포함한다:
● 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus)
● 엘.불가리쿠스(L. bulgaricus)
● 엘.플란타룸(L. plantarum)
● 엘.락티스(L. lactis)
● 엘.델브루엑키(L. delbrueckii)
● 엘.레이크마니(L. leichmannii)
● 엘.살리바리우스(L. salivarius)
● 엘.카레트(L. caret)
● 엘.펜토아세티쿠스(L. pentoaceticus)
● 엘.브레비스(L. brevis)
● 엘.부크네리(L. buchneri)
● 엘.셀로비오서스(L. cellobiosus)
● 엘.콘푸서스(L. confusus)
● 엘.코프로필러스(L. coprophilus)
● 엘.퍼멘타툼(L. fermentatum)
● 엘.샌프란시스코(L. sanfrancisco)
● 엘.써모필러스(L. thermophilus)
● 엘.바바리쿠스(L. bavaricus)
● 엘.카제이(L. casei)
● 엘.코리니포미스(L. coryniformis)
● 엘.쿠르바투스(L. curvatus)
● 엘.플란타룸(L. plantarum)
● 엘.사케(L. sake)
● 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum)
● 류.메센테로이데스(Leu . mesenteroides)
● 류.파라메센테로이데스(Leu . paramesenteroides)
● 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)
● 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)
● 페디오코커스 액시딜락티시(Pediococcus acidilactici)
● 페디오코커스 담노서스(Pediococcus damnosus)
● 페디오코커스 펜토카쿠스(Pediococcus pentocacus)
실시예 2. 프로바이오틱 유기체 성장 및 폴리사카라이드 사용 증진을 위한 추가의 제제.
생체내 또는 시험관내에서 이로운 세균의 증식을 촉진시키거나 경쟁 세균의 증식을 억제하는 폴리사카라이드 이외의 추가의 제제의 함유는 이로울 수 있다. 당해 추가 물질의 예는 다음을 포함할 수 있다:
(1) 락토바실러스 및 비피도박테리아와 같은 그람 양성 세균에 대해 적은 효과를 가지면서 그람-음성 세균의 성장을 억제하는 선택적 항생제 물질
(2) 박테리오이데스 종과 같은 그람 음성 세균에 대해 적은 효과를 가지면서 그람 양성 세균의 성장을 억제하는 선택적 항생제 물질
(3) 동물 사료에 사용되어 이로운 세균의 성장을 자극하는, 아역청질 부식 물질과 같은 프로바이오틱 세균의 성장을 자극하는 물질
(4) 성장계의 pH 조건을 변화시켜 이로운 프로바이오틱 미생물의 성장을 지지하는 무기산 또는 유기산 및 염기와 같은 물질
(5) 성장계의 산화-환원 조건을 변화시켜 박테리오이데스, 락토바실리 및 피비도박테리아와 같은 이로운 혐기성 미생물의 성장을 지지하는 성장계의 산화-환원 조건을 변화시키는 화학적 환원력을 갖는 수소화물 및/또는 다른 화학물질과 같은 물질
실시예 3. 프로바이오틱의 존재 또는 부재하에 프로바이오틱 프로세싱된 폴리사카라이드를 선택하고 제조하기 위한 조성물 및 방법.
박테리오이데스 테타이오타오미크론(Bacterioides thetaiotaomicron)
천연 폴리사카라이드(들) 및 박테리오이데스 테타이오타오미크론의 생존 세포를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물 제형
천연 폴리사카라이드(들) 및 박테리오이데스 테타이오타오미크론의 생존 세포 및 그람 음성 혐기성 미생물의 성장을 자극하는 선택된 성장 촉진 제제를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물 제형
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해에 영향을 주기 위해 박테리오이데스 테타이오타오미크론을 사용한 세균적으로 변형된 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드의 제조 방법
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해에 영향을 주기 위해 박테리오이데스 테타이오타오미크론을 사용한 면역학적 활성을 갖는 세균적으로 변형된 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 제조 방법
박테리오이데스 프라질리스(Bacterioides fragilis)
천연 폴리사카라이드(들) 및 박테리오이데스 프라질리스의 생존 세포를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물 제형
쳔연 폴리사카라이드(들) 및 박테리오이데스 프라질리스의 생존 세포 및 그람 음성 혐기성 미생물을 자극하는 선택된 성장 촉진 제제를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물 제형
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하기 위해 박테리오이데스 프라질리스를 사용하는 세균적으로 변형된 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드를 제조하기 위한 방법
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하기 위해 면역학적 활성을 갖는 박테리오이데스 프라질리스를 사용하여 세균적으로 변형된 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 제조하는 방법
비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)
천연 폴리사카라이드(들) 및 비피도박테리움 론검의 생존 세포를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물
천연 폴리사카라이드(들) 및 비피도박테리움 론검의 생존 세포 및 혐기성 미생물의 성장을 자극하는 선택된 성장 촉진제를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하기 위해 비피도박테리움 론검을 사용하는 세균적으로 변형된 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드를 제조하기 위한 방법
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하기 위해 비피도박테리움 론검을 사용하는 면역학적 활성을 갖는 세균적으로 변형된 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 제조하기 위한 방법
엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)
천연 폴리사카라이드(들) 및 엔테로코커스 파에시움의 생존 세포를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물
천연 폴리사카라이드(들) 및 엔테로코커스 파에시움의 생존 세포 및 그람 음성 혐기성 미생물의 성장을 자극하는 선택된 성장 촉진제를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물 제형
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하기 위해 엔테로코커스 파에시움을 사용하는 세균적으로 변형된 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드를 제조하기 위한 방법
폐쇄된 생물반응기 시스템에서 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하기 위해 엔테로코커스 파에시움을 사용하는 면역학적 활성을 갖는 세균적으로 변형된 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드의 제조 방법
다양한 프로바이오틱 세균
하기 그룹으로부터 특이적 비병원성 식품 프로세싱 미생물의 선택: 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드를 제조하기 위한 글루 코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무 및 이의 배합물로부터 선택된 폴리사카라이드를 사용하는 능력을 갖는 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로바이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 자이고사카로마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스
하기의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리사카라이드의 배합물: 프로바이오틱 식이 보충물 또는 식품을 제조하기 위한 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로바이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 자이고사카로마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스로부터 선택된 비병원성 미생물 종의 생존 세포와 함께 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무 및 이의 배합물
하기의 그룹으로부터 선택된 비병원성 미생물 종을 사용한 부분적으로 분해된 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 및 모노사카라이드를 제조하 기 위한 방법: 폐쇄된 생물반응기 시스템에서 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무로부터 선택된 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하는 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로바이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 자이고사카로마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스
하기의 그룹으로부터 선택된 비병원성 미생물 종을 사용한 면역학적 활성을 갖는 부분적으로 분해된 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 제조하기 위한 방법: 폐쇄된 생물반응기 시스템에서 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무로부터 선택된 천연적으로 존재하는 폴리사카라이드의 효소적 분해를 수행하는 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로바이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 자이고사카로마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스
상당한 사람 역사 동안에 인기가 있었던 몇몇 약용 식물의 이득은 부분적으로 이들의 면역조절 폴리사카라이드(IP) 함량 덕택일 수 있다. 예를 들어, 에키나세아 푸르푸레아(Echinacea purpurea), 파낙스 진셍(Panax ginseng), 및 쿠르크마 롱아(Curcma longa)의 면역조절 활성은 부분적으로 이들의 아라비노갈락탄 함량 덕택일 수 있다. 알로에 베라 겔 중 폴리사카라이드, 특히, 아세틸화된 만난은 또한 강력한 면역조절 물질이다. 하기된 내용은 본 발명의 한가지 양태에 대한 예이다.
시험관내 면역조절 폴리사카라이드(IP)는 대식세포를 활성화시키고 T-세포 및 B-세포의 증식을 자극하고 보체 활성을 억제하고 사이토카인 방출을 조절하고 장내 면역계를 자극할 수 있다. 고분자량(MW)의 폴리사카라이드는 보다 강력한 면역 조절 효과를 갖는다. 하기의 경구 섭취 IP는 암환자의 생존 연장 및 삶의 질을 개선시키기 위한 보조 치료제로서 사용될 수 있다. 섭취되는 경우 복합 식물 폴리사카라이드(CPP)는 전형적으로 대부분 온전한 상태로 장에 진입하고 여기서 이들은 다양한 정도로 장내에서 복합 마이크로플로라에 의해 분해될 수 있다. 이에 의해 이들 물질은 세균 플로라의 조성 및 밀도에 영향을 주고 모노사카라이드, 단쇄 지방산, CPP 단편 및 대사물 및 가스를 생성할 수 있다. 이들 CPP 분해 생성물은 이어서 GI 면역계에 영향을 주고 흡수되거나 배출될 수 있다. 하기된 시험관내 입증은 면역계 지지를 위해 제형화된 혼합-사카라이드 식이 보충물(MSS) 및 이의 CPP 성분 중 2개, 아라비노갈락탄(LAG) 및 고분자량의 알로에 베라 겔 폴리사카라이드(AVP)에 대한 사람 결장 세균의 이용을 설명한다. 당해 입증은 에너지원으로서 및 보다 많은 세균 작제를 위한 물질로서 CPP에 대해 최상으로 경쟁할 수 있는 결 장 세균을 위해 채택되었다.
하기의 제제는 본 발명에 사용하기 위한 전형적인 폴리사카라이드이다.
CPP(낙엽송 아라비노갈락탄); 고분자량의 알로에 베라 겔 폴리사카라이드; 혼합 사카라이드 식이 보충물(LAG, AVP, 아노게이수스 라티폴리아(Anogeissus latifolia) 줄기 고무, 아스트라갈루스 구미페르(Astragalus gummifer) 줄기 고무, 글루코사민 HCl 및 운다리스 피나티피다(Undaris pinnatifida) 추출물을 함유하는 AdvancedAmbrotoseTM)의 칭량한 샘플을 200rpm에서 4시간 동안 회전 진탕기상에서 탈이온수 중에서 완전히 혼합하였다. 현탁액은 7.63 내지 7.9 g/L이었다. 100 ml의 각각의 현탁액을 이어서 대략 10L의 diH2O 용적에 대하여 4℃에서 20시간 동안 6,000 내지 8,000 MWCO 배관에서 투석시켰다. diH2O는 20시간 동안에 2회 갈아주었다. 투석된 샘플을 동결건조 전에 0℃에서 1시간 동안 먼저 동결시켰다.
4명의 건강한 사람의 배설물 샘플을 수득하였다. 45세 미만의 연령을 갖고 전체 규정식이 25% 미만의 패스트 푸드를 포함하며 최근 12개월 이내에 항생제를 복용하지 않았고 최근 5년 이내에 GI 문제점을 갖지 않았으며 불규칙 장 운동을 갖지 않았으며 변비, 위 또는 장 복통 또는 설사 때문에 OTC 약물을 사용하지 않았고 최근 6개월에 독성 음식을 섭취하지 않았으며 병에 걸릴 염려가 없는 대상체를 선택하였다. 배설물 샘플에서 하기의 병원체가 음성임을 확인하였다: 클로스크리디움 디피실(Clostridium difficile), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter), 비브리오(Vibrio), 여시니아(Yersinia), 및 이.콜라이(E. coli) O157. 10g의 배설물 샘플을 750ml의 뇌 심장 주입물과 혼합하고 37℃에서 6시간 배양 전에 30초 4회 펄스 동안 블렌더에서 혼합하였다. 1ml의 적정액을 사용전에 80℃에서 20% 글리세롤 중에 저장하였다. 입증하는 날에 적정액을 온수에서 신속하게 해동시키고 이어서 2ml의 혐기성 E 배지 (0.2%) wlv 시트르산, 1% wlv K2HPO4, 0.35% w/v NaNH4HPO4·4H2O 및 0.002% w/v MgSO4·7H2O)에 첨가하고 CPP를 함유하는 E 배지에 첨가하기 전에 48시간 동안 배양하였다. CPP는 diH20에서 2시간 동안 진탕시킴에 의해 현탁시켰고 이어서 혐기성 E 배지에 첨가하여 최종 조성이 1% w/v가 되게 하였다. 혐기성 조건하에서, 20㎕의 배설물 현탁액을 E 배지 현탁액 중 CPP 2ml에 첨가하고 혐기성 조건(CO2 가스 팩)하에서 37℃에서 3일 동안 배양하였다. CPP 없이 E 배지에 첨가된 배설물 현탁액으로 이루어진 하나의 대조군 예시 세트는 E 배지에서 CPP의 효과를 평가하기 위해 포함시켰고, 또 다른 대조군 예시 세트는 배양 조건하에서 9일 동안 E 배지에서 CPP를 갖는다. 3일 배양 후(즉, 3일), 20㎕의 배양물을 E 배지 중에 2ml의 새로운 CPP에 첨가하였다. 이를 다시 6일째에 반복하였다. 9일의 종점에서, 세균을 원심분리로 회수하고 무수 빙-에탄올 슬러리로 스냅 동결시켰다. 상청액을 취득하고 HPLC 굴절 검출에 의한 화학적 조성을 평가하였다. 대조군 예시 세트는 이들에 배설물을 접종시키지 않는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 프로세싱되었다. 9일째 세균을 수거하고 16s rDNA 동정을 위해 프로세싱하였다.
165 rDNA 서열분석에 의한 세균 동정. 9일째에 샘플을 분리용 세균 성장 배 지 플레이트상으로 도말하였다. 사용되는 배지는 다음과 같다: 1) DifcoTM 락토바실러스 MRS 한천, 2) NNLP(날라딕스산, 네오마이신, 염화리튬 및 파라모마이신 설페이트)를 함유한 비피도바에세리아 MRS, 3) 4% NaCl을 함유한 MRS, 4) 2% 담즙 염을 함유한 MRS, 및 5) pH 5.2에서 MRS. 총 57개의 분리물을 4개의 배설물 배양물의 계대로부터 선택하였다. DNA는 제조업자의 지침에 따라 BactReady Kit (GenScript; Piscataway, NJ)를 사용하여 분리물로부터 추출하였다. 정제된 DNA의 PCR 증폭은 TaKaRa SpeedSTAR HS DNA 폴리머라제 시약 및 16S rDNA 증폭을 위한 범용 프라이머, 정방향 F8 - 5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3' (서열번호 1) 및 역방향 R1492 - 5' - GGTTACCTTGTTACGACTT - 3' (서열번호 2)을 사용하여 수행하였다. PCR 증폭을 위한 조건은 15분 동안 94℃; 40초 동안 94℃ 및 30초 동안 60℃의 35회 사이클; 2분 동안 72℃에 이어서 4℃에서의 홀드였다. 생성물의 순도는 2% 아가로스 E-겔상에서 2㎕를 전개함에 의해 확인하였다. 앰플리콘은 Alpha Biolabs로 서열분석하였다. 수득한 물질은 BLAST 검색에 적용하였고 최상의 매치가 보고되었다. 그람 염색에 대한 생화학적 시험은 제조업자의 지침에 따라 키트를 사용하여 각각의 분리물에 대해 수행하였다. 용혈은 5% 양의 혈액 한천을 함유하는 DifcoTM 트립신 분해 대두 한천 플레이트상에서의 분리된 콜로니 성장에 의해 결정하였다. 옥시다제 생성은 제조업자의 지침에 따라 옥시다제 시약을 사용함에 의해 결정하였다. 카탈라제 생성은 분리물이 과산화수소에서 기포를 생성하는 능력에 의해 결정하였다. 제조업자의 지침에 따라 API 스트렙 또는 API20 E 스트립을 사용하여 동정 하였다.
세균 상청액의 화학적 분석. 상청액을 실온에서 해동시키고 탈이온수에 첨가하고 HPLC 분석 전에 0.2㎛ 폴리프로필렌 소형 UniPrepTM 필터로 여과하였다. 분자 크기를 기준으로 하는 분리는 BioSep-SEC-S-4000 칼럼 HPLC를 사용하여 평가하였다. 5,000; 10,000; 및 800,000 폴리말토트리오스 MW 표준물을 탈이온수(약 1mg/ml)에 첨가하고 HPLC로 분석하여 CPP 투석이 보다 작은 사카라이드(<6,000 MW)을 제거하였음을 확인하고 CPP 및 상청액의 MW를 평가하였다(도 1). 도 1은 y축이 MW이고 x축이 체류시간(분)인 5,000, 10,000 및 800,000 폴리말토트리오스 MW 표준물의 HPLC 체류 시간에 대한 다이아그램이다.
결과. 세균. 서열 분석으로 엔테로코시 속의 52개 분리물, 에스케리키아 콜라이의 4개의 분리물 및 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)의 1개의 분리물을 수득하였다. 서열 분석은 모든 분리물 중 속 수준에 대해서 및 40개 분리물의 종 수준에 대해 93% 초과의 신뢰도를 가졌다. 세균 종 및 표현형 특성에 대한 추가의 동정 및 확인은 시판되는 API 시험 스트립 및 통상적인 미생물학적 시험 방법을 사용하는 생화학적 프로파일링에 의해 수득하였다. 서열 동정, 그람 균주, 옥시다제 및 카탈라제 결과를 사용하여 적당한 API 시험 스트립, 엔테로코시에 대해 API 20 스트렙 및 장 분리물에 대해 API 20 E를 결정하였다. 수득한 스트립 정보는 API 데이터베이스를 사용하여 평가하고 수득한 동정을 결정하였다(표 I).
하기 표 1은 특정 CPP 배지에서 성장한 배설물 샘플로부터 배양된 엔테로코시 종 분리물의 생화학적 특성을 보여준다. 당해 값은 각각의 입증에 대해 양성 % 로서 나타낸다.
엔테로코시 종 분리물의 생화학적 특성
엔테로코커스 파에칼리스 엔테로코커스 파에시움 엔테로코커스 듀란스 엔테로코커스 아비움
분리물의 개수 2 46 1 3
CPP LAG LAG, AVP, MSS LAG AVP
그람 염색 +구균 +구균 +구균 +구균
베타 용혈 50% 0% 0% 0%
카탈라제 0% 0% 0% 0%
옥시다제 0% 0% 0% 0%
API 20 스트렙 스트립 n 시험
보게스 프로스카우어 (Voges Proskauer) 100% 97.8% 100% 100%
히푸르산 가수분해 100% 86.9% 0% 33.3%
에스쿨린 가수분해 100% 100% 100% 100%
피롤리도닐 아릴아미다제 100% 97.8% 100% 33.3%
알파-갈락토시다제 0% 67.4% 100% 33.3%
베타-글루쿠로니다제 0% 0% 0% 0%
베타-갈락토시다제 50% 100% 100% 0%
알칼리성 포스파타제 100% 43.5% 100% 66.6%
류신 아미노펩티다제 100% 95.6% 100% 100%
아르기닌 데하이드롤라제 100% 100% 100% 0%
리보스 100% 100% 100% 100%
아라비노스 50% 97.8% 0% 100%
만니톨 100% 100% 0% 100%
소르비톨 100% 36.9% 0% 100%
락토스 100% 100% 100% 100%
트레할로스 100% 100% 100% 100%
이눌린 0% 4.3% 100% 100%
라피노스 0% 82.6% 0% 33.3%
아미돈 100% 80.4% 100% 66.6%
글리코겐 0% 0% 0% 0%
엔테로코시는 엔테로코커스 파에시움(46), 엔테로코커스 파에칼리스(2), 엔테로코커스 듀란스(1), 및 엔테로코커스 아비움(2)이다. 이전에 공개된 정보에 따라 모든 분리된 엔테로코커스 종은 그람 양성, 카탈라제 음성, 옥시다제 음성 및 에스쿨린의 가수분해에 대해 양성이다. 52개 분리물의 단지 5개는 혈액 한천상에서 베타 용혈성이었다. 이.파에시움 및 이.듀란스 100%, 및 이.파에시움 50%는 베타-갈락토시다제에 대해 양성이고 아라비노갈락탄 가수분해를 위해 효소가 필요하다. 이.파에시움 100% 및 이.파에칼리스 50%는 아라비노갈락탄 중 주요 모노사카라이드인 아라비노스를 발효시킬 수 있었지만 이.듀란스는 아라비노스를 발효시킬 수 없었다.
이.콜라이 분리물(4)은 단지 LAG를 사용한 배양물에서 발견되었다. 단일 클렙시엘라 뉴모니애 분리물은 AVP 배양물로부터 회수하였다. 하기 표 2는 이.콜라이 및 클렙시엘라 뉴모니애 분리물로부터의 대사적 프로파일링 결과를 보여준다. 이들 장내세균은 카탈라제 양성 및 옥시다제 음성인 그람 음성 바실리이다. 이.콜라이 중 하나의 분리물만이 베타 용혈성인 것으로 동정되었다.
하기 표 2는 CPP 배지상에서 성장한 배설물 샘플으로부터 분리된 장내세균의 생화학적 특성을 열거한다. 당해 값은 각각에 대해 양성 %를 나타낸다.
장내세균의 생화학적 특성
에스케리키아 콜라이 클렙시엘라 뉴모니애
분리물의 개수 4 1
IP LAG AVP
그람 염색 -간균 -간균
베타 용혈 25% 0%
카탈라제 100% 100%
옥시다제 0% 0%
API 20 E 시험 스트립 시험
베타-갈락토시다제 0% 0%
아르기닌 디하이드롤라제 25% 100%
리신 데카복실라제 75% 0%
오르니틴 데카복실라제 25% 0%
시트레이트 사용 0% 0%
황화수소 생산 0% 0%
우레아제 0% 0%
트립토판 데아미나제 0% 0%
인돌 생산 75% 0%
보게스 프로스카우어 25% 0%
젤라티나제 0% 0%
글루코스 100% 0%
만니톨 75% 0%
이노시톨 0% 0%
소르비톨 75% 0%
라피노스 75% 0%
사카로스 75% 0%
멜리비오스 75% 0%
아미그달린 25% 0%
아라비노스 75% 0%
상청액. 세균 배양물을 위해 사용된 것들과 동일한 조건하에서 9일 동안 배양된 대조군과 비교하여 모든 분자량 범위의 CPP가 손실되었음이 명백하였다. 그러나, 당해 손실은 다양할 수 있고 CPP 및 배설물 샘플에 의존한다. 모든 4명의 대상체의 배설물 배양물은 800,000 내지 약 12,000 MW 범위 사이에 있는 LAG 중합체를 매우 균등하게 소비하였다. 그러나 12,000 MW 미만의 중합체는 상이한 양으로 소비되었다(도 2). 도 2는 4개의 대상체 사람 결장 세균과의 72시간 배양 후 낙엽송 아라비노갈락탄(LAC) 최종 생성물을 보여주는 다이아그램이다. LAG 대조군(실선)은 결장 세균 없이 프로토콜에 적용하였다. y-축은 mRIU이고 x-축은 체류 시간(분)이다.
대략 1,000,000 내지 대략 50,000 MW 사이의 AVP 중합체 성분은 모든 대상체 기원의 배설물 세균에 의해 거의 완전히 소모되었지만 일부 가변성이 있고 특히 1,000,000 MW 범위에서 가변성이 있다. 10,000 미만의 중합체는 상이한 배설물 배양에 의해 고도로 가변적인 방식으로 소모되었다(도 3). 도 3은 4명의 대상체 사람 결장 세균과의 72시간 배양 후 알로에 베라 겔 폴리사카라이드(AVP) 최종 생성물을 보여준다. AVP 대조군(실선)은 세균없이 프로토콜에 적용하였다. y-축은 mRIU이고 x-축은 체류 시간(분)이다.
대략 1,000,000의 MSS의 중합체 성분은 소모되지 않았지만 800,000 내지 1,000,000 MW 사이의 중합체는 MSS에 의해 선택된 상이한 배양물에 의해 다양한 정도로 소모되었다. 흥미롭게도, 이들 대상체에서, AVP 또는 LAG가 아닌 MSS의 배설물 배양물 분해는 대조군 MSS에서는 발견되지 않는 저분자량 중합체 약 1,000 MW를 축적시켰고 이는 모 분자로부터 CPP의 소분획을 절단하는 당 효소를 방출함을 시사한다(도 4). 도 4는 4명의 대상체 사람 결장 세균과의 72시간 배양 후 혼합된 사카라이드 보충물(MSS)을 보여준다. MSS 대조군(실선)은 결장 세균 없이 프로토콜에 적용하였다.
고찰. 사람 장 마이크로비오타는 500 내지 1,000개의 종을 포함하는 것으로 사료되고 약 1.5kg의 바이오매쓰에 기여한다. 생체내 사람 GI 관내 폴리사카라이드의 세균 이용은 의심할 바 없이 고도로 복합한 과정이다. 중합체 분해는 당해 과정에 관여하는 많은 상이한 세균 기원의 효소들의 협력적 활성이다. 여기에서, 사용가능한 탄소원으로서 CPP만을 함유하는 새로운 배지에 배설물 세균을 반복적으로 계대시키는 과정은 CPP에 대해 최상으로 경쟁할 수 있고 이를 이용할 수 있는 세균을 위해 선택하였다. 이들 당을 효율적으로 이용할 수 있는 세균은 덜 효율적인 다른 종에 비해 보다 많은 자손을 생성하는 경향이 있다. 시간 경과에 따라 당해 종은 배양물을 장악한다. 이것은 엔테로코커스 종이 LAG를 이용한다는 것을 보여주는 첫번째 입증이다(표 1).
LAG는 모든 대상체에 의해 불완전하게 분해되었지만 보다 낮은 MW(약 10,000) 부분을 분해하는 능력에 있어서 대상체간에 가변성이 있었다(도 2, 화살표). 경구용 알로에 베라 겔이 장 기능을 개선시키는 것으로 밝혀졌지만 이것은 사람 결장 세균에 의한 알로에 베라 겔 폴리사카라이드의 활용을 설명하는 첫번째 입증이다. 한가지 사실은 AVP의 고분자량 (>1,000,000) 성분을 이용하는 능력에 관하여 개체간에 보다 큰 가변성이 있다는 것이다(도 3, 화살표). 가용성이 제한된 매우 큰 분자의 소모는 엔테로코커스 종이 이들 대형 분자를 이용할 수 있음을 설명한다. 보다 작은 성분으로의 후속적 분해와 함께 대형 CPP 입자의 내재화를 포함하는 몇가지 경로가 사용될 수 있다. 또 다른 경로는 몇몇 세균이 글리코시다제를 분비하여 보다 작은 분자량 성분으로의 대형 분자의 분해를 유도하는 것이다. 최종적으로, 당해 사용은 이들 과정의 조합을 포함할 수 있다. 엔테로코커스 파에칼리스는 21개의 글리코실하이드롤라제를 암호화하고 있는 것으로 공지되어 있다. 이것은 당해 혼합된 식이 보충물(MSS)이 사람 결장 세균에 의해 이용됨을 보여주는 첫번째 입증이다. 당해 명백한 설명은 이.파에시움에 MSS를 주입했을때 상청액 중에 비교적 소형(약 1,000) 중합체를 풍부하게 생성시킨다는 것이다(도 4, 화살표). MSS 대조군은 5,000을 초과하기 때문에 저분자량의 물질의 생성은 대형 분자의 분해로부터 유래되는 것이어야만 한다. 이것은 이.파에시움에 의해 상청액으로 배출되는 효소에 의한 대형 분자의 분해로부터 또는 세균 자체에 의한 소형 중합체의 분비로부터 발생할 수 있다. 놀라운 것은 당해 현상이 LAG 또는 AVP에 대해 개별적으로 관찰되지 않는다는 것이다. 박테로이데스 및 비피도박테리아 종은 우세하지만 엔테로코시 종은 당해 시스템의 최저 단계에서 풍부하게 증가하였다. MSS의 다른 성분의 사람 결장 분해가 조사되었다. 다르게는 정제된 섬유(α 및 β 연결된 황산화된 푸칸) 및 유.피나티피다(U. pinnatifida) 기원의 총 해조류 섬유(α 및 β 연결된 알기네이트)의 사람 시험관내 발효를 조사하였다. 정제된 황산화 푸칸은 분해되지 않았다. 알기네이트의 47 내지 62%는 단쇄 푸리산으로 완전히 대사된다. 다르게는 알기네이트의 60%가 "일반적이지 않고 공지되지 않은" 발효 경로에 의해 분해되는 것으로 보인다고 결론지어졌다.
엔테로코클리스(Enrerococclis)는 생태학적으로 다재다능하고 광범위한 온도 및 pH 조건에서 내성일 수 있다. 이것은 사람의 소장 및 대장을 군집화한다. 3개의 CPP에 대해 최상으로 경쟁할 수 있는 2개의 종인 이.파에칼리스 및 이.파에시움은 보편적인 프로바이오틱이다. 사람 프로바이오틱 보충 연구는 당해 2개의 종이 면역계를 자극할 수 있음을 입증하였다. 이.파에시움 보충은 또한 혈청 콜레스테롤을 감소시키고 염증 반응에 관여하는 세포 수용체의 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 장에서 배양가능한 99.9% 초과의 세균 집단은 절대적 혐기성 미생물이고 GI 관에서 거주하는 추정 세균의 80%는 어떠한 조건하에서도 배양될 수 없다. 본 연구의 9일 배양물에 존재하는 세균 종은 CPP를 이용할 수 있는 비교적 소수의 종을 나타내고 몇몇 종은 생체내에서 CPP를 용이하게 이용할 수 있지만 본원에 사용된 것과 같은 방법을 사용하여 동정될 수 없다.
이것은 알로에 베라 겔 및 혼합된 사카라이드 식이 보충물로부터 면역조절 폴리사카라이드의 사람 GI 세균에 의한 이용을 설명하는 첫번째 입증이다. 엔테로코커스 종은 당해 연구에 사용되는 기타 종보다 효율적으로 CPP를 이용하여 반복된 계대 후에 배양물을 이들이 장악하게 된다. CPP 최종 생성물의 MW 분석은 CPP를 이용하는 상이한 개체로부터 회수된 세균 바이오매쓰의 능력에서의 가변성을 보여준다. 생체내에서 대상체는 고분자량의 AVP 성분을 완전히 분해시킬 수 있고; 저분자량의 성분은 다양하게 소모된다. MSS상에서 성장한 결장 세균은 비교적 저분자량(약 1,000)의 중합체를 풍부하게 생성시키고 이러한 현상은 MSS의 2개 주요 성분인 LAG 또는 AVP에서는 관찰되지 않는다. 생체내 GI 관과 매우 유사한 시스템과 함께 당해 성분들과 다른 CPP에 대한 연구는 또한 본 발명에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 논의된 임의의 양태는 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약 또는 조성물과 관련하여 수행될 수 있는 것으로 고려되고 그 반대의 경우도 고려된다. 추가로, 본 발명의 조성물을 사용하여 본 발명의 방법을 달성할 수 있다.
본원에 기재된 특정 양태는 단지 설명을 위한 것이지 본 발명을 제한하려고 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 다양한 양태로 사용될 수 있다. 당업자는 단지 통상적인 실험, 본원에 기재된 특정 과정에 대한 많은 등가물을 사용하여 인지하고 확인할 수 있다. 당해 등가물은 본 발명의 범위내에 있는 것이고 특허청구범위에 의해 보호되는 것으로 고려된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허원은 본 발명이 속하는 당업자의 수준을 지적한다. 모든 공보 및 특허원은 본원에서 개별 공보 또는 특허원이 특이적으로 개별적으로 본원에 참조로서 인용되는 것과 동일한 정도로 참조로서 인용된다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 연계하여 사용되는 경우 부정관사 "a" 또는 "an"의 사용은 하나를 의미할 수 있지만 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일맥상통한다. 특허청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 명백하게 단지 대체물을 언급하도록 지적되거나 대용물이 상호 배타적이지 않는 경우 "및/또는"을 의미하는데 사용되지만 당해 기재내용은 유일한 대용물 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다. 본원 전반에 걸쳐 용어 "약"은 수치가 장치 또는 수치를 측정하는데 사용되는 방법에 대한 고유 오류 변수 또는 연구 과제중에 존재하는 변수를 포함함을 지적하기 위해 사용된다.
본원 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"(및 "포함하는"의 임의의 형태, 예를 들어 "포함한다"), "갖는"(및 "갖는"의 임의의 형태, 예를 들어, "갖는다"), 또는 "함유하는"(및 "함유하는"의 임의의 형태, 예를 들어, "함유한다")은 포괄적이고 개방어(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소들 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "또는 이의 조합"은 그 용어의 앞에 열거된 항목의 모든 순열 및 조합을 언급한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중 적어도 하나를 포함하고 순서가 특정 문장에서 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 어느 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 당해 예시와 연속해서 특히 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 함유하는 조합, 예를 들어 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등이 포함된다. 당업자는 문장에서 달리 명백하지 않는 경우 전형적으로 임의의 조합에서 항목 또는 용어의 수에 특정 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원에 기재된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명의 기재 관점에서 과도한 실험 없이 제조되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 관점에서 기재되었지만 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 이탈하지 않고 당해 조성물 및/또는 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 가해질 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 당해 유사한 대용 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 한정된 바와 같이 본 발명의 취지, 범위 및 개념내에 있는 것으로 간주된다.
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Claims (35)

  1. 생물반응기 시스템에서 프로바이오틱 세균과 함께 미리 배양된 하나 이상의 천연 폴리사카라이드로부터 제조된 보충물을 포함하는 식이 보충물로서, 상기 세균이 폴리사카라이드를 프로세싱하여 생성된 프로세싱된 폴리사카라이드가 영양 보충물로 제공되는 식이 보충물.
  2. 제1항에 있어서, 생물반응기로부터 프로세싱된 폴리사카라이드가 식품 또는 식이 보충물로 적용되는 보충물.
  3. 제1항에 있어서, 프로세싱된 폴리사카라이드가 단일 투여 형태로 적용되는 보충물.
  4. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무 중 하나 이상을 포함하는 보충물.
  5. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 알로에 베라 기원의 아세틸화된 만난을 포함하는 보충물.
  6. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드 및 프로바이오틱 세균이 단일 투여 형태로 별도로 제공되는 보충물.
  7. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드 및 프로바이오틱 세균이 생물반응기에서 배양되는 보충물.
  8. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드 및 프로바이오틱 세균이 지연 방출 형태로 제공되는 보충물.
  9. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 헤테로폴리사카라이드, 호모폴리사카라이드 또는 이들 둘다인 보충물.
  10. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 미생물 세포로부터 분리되고, 당해 분리된 폴리사카라이드가 산제, 캅셀제, 겔캡, 정제, 비등성 정제, 액체 또는 고무질로부터 선택되는 투여 형태에 로딩되는 보충물.
  11. 하나 이상의 천연 폴리사카라이드 및 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 아세토박터(Acetobacter), 캔디다(Candida), 클루베로마이세스(Kluveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 토룰라(Torula), 토룰라스포라(Torulaspora), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 박테리오이데스(Bacterioides), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 루미노코커스(Ruminococcus) 및 페디오코커스(Pediococcus) 중 하나 이상의 생존 미생물 세포를 포함하는 프로바이오틱 식품 또는 식이 보충물 제제.
  12. 제11항에 있어서, 폴리사카라이드가 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무 중 하나 이상을 포함하는 제제.
  13. 제11항에 있어서, 폴리사카라이드가 알로에 베라 기원의 아세틸화된 만난을 포함하는 제제.
  14. 제11항에 있어서, 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포가 단일 투여 형태로 별도로 제공되는 제제.
  15. 제11항에 있어서, 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포가 생물반응기에서 배양되는 제제.
  16. 제11항에 있어서, 폴리사카라이드 및 생존 미생물 세포가 지연 방출 형태로 제공되는 제제.
  17. 제11항에 있어서, 폴리사카라이드가 헤테로폴리사카라이드, 호모폴리사카라이드 또는 이들 둘다인 제제.
  18. 천연 폴리사카라이드 및 비병원성 프로바이오틱 미생물 종을 포함하는 단일 투여 형태의 식이 보충물.
  19. 제18항에 있어서, 천연 폴리사카라이드 및 비병원성 프로바이오틱 미생물 종이 사람 GI 관으로 동시에 제공되는 식이 보충물.
  20. 제18항에 있어서, 비병원성 프로바이오틱 미생물 종에 의한 천연 폴리사카라이드의 프로세싱이 사람 위장관의 영역내에서 달성되는 식이 보충물.
  21. 제18항에 있어서, 미생물 세포가 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커 스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로마이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 지고사카로마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스 중 하나 이상을 포함하는 식이 보충물.
  22. 제18항에 있어서, 폴리사카라이드가 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무 중 하나 이상을 포함하는 식이 보충물.
  23. 제18항에 있어서, 폴리사카라이드가 알로에 베라 기원의 아세틸화된 만난을 포함하는 식이 보충물.
  24. 생물반응기에서 비병원성 프로바이오틱 미생물 종에 의한 선택된 천연 폴리사카라이드의 프로세싱으로부터 비롯된 추출물을 포함하는 식이 보충물.
  25. 천연 폴리사카라이드의 세균에 의한 프로세싱을 자극하는 조건하에서 생물반응기 시스템에서 하나 이상의 천연 폴리사카라이드와 프로바이오틱 세균을 혼합하여, 프로세싱된 폴리사카라이드를 제조하는 단계 및
    상기 천연 폴리사카라이드의 적어도 일부가 세균에 의해 프로세싱된 후 식이 보충물 제조하는 단계
    를 포함하는 식이 보충물의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세균이 폴리사카라이드를 프로세싱하여 생성된 프로세싱된 폴리사카라이드가 단일 투여 영양 보충물로 제조되는 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    천연 폴리사카라이드 및 세균으로부터 프로세싱된 폴리사카라이드를 분리하는 단계 및
    상기 프로세싱된 폴리사카라이드를 포함하는 투여 형태를 제조하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 프로세싱된 폴리사카라이드, 천연 폴리사카라이드 및 세균을 포함하는 투여 형태를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제25항에 있어서, 프로세싱된 폴리사카라이드가 산제, 캅셀제, 겔캡, 정제, 비등성 정제, 액제 또는 고무질로부터 선택된 투여 형태에 로딩되는 방법.
  30. 제25항에 있어서, 세균이 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 엔테 로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로마이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 지고사카로마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  31. 제25항에 있어서, 천연 폴리사카라이드가 글루코만난, 알로에 글루코만난, 곤약 글루코만난, 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 낙엽송 아라비노갈락탄, 해조류 폴리사카라이드, 푸코이단, 진균류 폴리사카라이드, 진균류 글루코만난, 트라가칸트 고무, 가티 고무, 크산탄 고무, 구아 고무 및 아카시아 고무 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  32. 제25항에 있어서, 천연 폴리사카라이드가 알로에 베라 기원의 아세틸화된 만난을 포함하는 방법.
  33. 제25항에 있어서, 프로세싱된 폴리사카라이드가 세균으로부터 분리되고, 프로세싱된 폴리사카라이드가 산제, 캅셀제, 겔캡, 정제, 비등성 정제, 액제 또는 고무질로부터 선택된 투여 형태에 로딩되는 방법.
  34. 생물반응기 또는 발효기 시스템에서 프로바이오틱 세균과 함께 배양된 프로세싱된 알로에 베라 내엽 겔을 포함하는 식이 보충물 제품 또는 식품 제품으로서, 상기 세균이 알로에 베라 내엽 겔을 생체이용가능한 생성물로 프로세싱하는 식이 보충물 제품 또는 식품 제품.
  35. 제34항에 있어서, 프로바이오틱 세균이 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 아세토박터, 캔디다, 클루베로마이세스, 사카로마이세스, 토룰라, 토룰라스포라, 데바리오마이세스, 지고사카로마이세스, 박테리오이데스, 바실러스, 비피도박테리움, 유박테리움, 펩토스트렙토코커스, 루미노코커스 및 페디오코커스로부터 선택된 하나 이상의 세균을 포함하는 제품.
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