KR0128714B1

KR0128714B1 - 산 생성능이 우수한 락토바실러스속 변이주 및 그를 이용한 녹차 발효음료의 제조방법

Info

Publication number: KR0128714B1
Application number: KR1019940017948A
Authority: KR
Inventors: 안종현; 이병순; 김영걸
Original assignee: 한동근; 주식회사태평양
Priority date: 1994-07-25
Filing date: 1994-07-25
Publication date: 1998-04-04

Abstract

본 발명은 산 생성능이 우수하고, 풍미가 우수한 발효산물을 생산하며, pH 4.5에서도 생장이 가능한 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus, acidophilus) TP104(KFCC-10819)를 제공한다. 본 발명의 균주는 상기한 특성에 의하여 녹차 침출액 또는 알로에 베라액에 첨가하여 발효시키므로써 녹차 발효생균 음료 또는 알로에 베라 발효음료를 생산하는데 유용하게 이용될 수 있고, 이 균주를 이용하여 얻은 발효음료는 유산균 발효에 의해 기호성이 뛰어나고 녹차 또는 알로에가 원래 갖고 있는 고유한 약리학적 효능을 그대로 유지하는 장점이 있다.

Description

산 생성능이 우수한 락토바실러스속 변이주 및 그를 이용한 녹차 발효음료의 제조방법

본 발명은 유산균 변이주에 관한 것이고, 보다 상세하게는 유산 생성력이 우수하고 기호성이 좋은 풍미를 생성하는 신규한 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)균에 관한 것이다.

녹차는 기원전 2,700년경부터 음용되어온 기호식품으로서 그 역사적 의의가 클 뿐만 아니라 최근에는 녹차에 함유된 여러 성분들의 약리적인 메카니즘이 점차 밝혀짐에 따라 그 가치가 재인식되고 일반인들도 녹차에 대한 관심이 점차 고조되어 그의 소비가 증대되는 추세에 있다.

차의 성분은 차 나무의 품종, 재배조건, 채엽시기, 채엽 부위, 토질, 제조방법, 나무의 수령이나 수세등에 따라 조성이 달라지게 되며, 폴리페놀, 카페인, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 색소성분 및 각종 유기산류, 효소, 비타민, 무기성분 등으로 구성되어 있다. 이들 성분들중 특히 탄닌, 카페인, 비타민 C, 플라보노이드 및 무기성분들은 항산화작용, 항암작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 피부미용 및 강심작용등의 각종 중요한 약리적 효능을 나타낸다.

이와 같이 약리적 효능 및 기호성이 우수한 녹차는 종래 그대로 사용되거나 또는 반발효 또는 발효법에 의해 발효되어 각각 녹차, 우롱차 및 홍차의 형태로 이용되어 왔다.

한편 알로에 베라는 식물학상으로 백합과의 알로에속에 속하는 다년생초이며 원생지는 아프리카나 오늘날에는 열대와 온대지방에 폭넓게 자생하고 약 4천년간 민간약과 한방약으로 애용되어 온 인류간발견한 최고의 약초라고 일컬어 진다. 알로에속의 식물은 세계에 약 500여종이 넘으나 약용알로에는 6,7중에 불과하며, 생즙을 그대로 쓰는 식용 알로에인 사포나리아, 알로에 아보레센스, 알로에 베라가 대표적이다.

그중에서도 특히 알로에 베라(Aloe barbadensis Miller)는 많은 유효한 생리활성 물질을 함유하고 있어 건강식품으로 가장 많이 이용되며 그 약리작용을 크게 4가지로 구분하면 첫째, 모든 내장기능을 향진시키며 특히 위장기능을 강화하는 작용; 둘째, 신체 세포액을 개선시키고 이상 세포를 파괴하며 체내 유독물질을 분해 배출시키는 작용; 셋째, 혈액순환 촉진으로 인한 모세혈관 확장과 혈관내 콜레스테롤 강화작용; 넷째, 신체의 정상세포로 하여금 같은 성질의 세포를 형성케하는 능력을 촉진시는 작용 등이 지금까지 알려져 있는 알로에 베라의 효능 및 효과이다.

그러나, 알로에 베라겔을 섭취하는 데에는 알로에 특유의 취와 특이한 맛으로 인한 거부감 등이 문제시되어 알로에 베라겔의 풍미개량을 목적으로 종래에는 유기산을 첨가하고 과즙이나 인공적인 향을 첨가하는 것이 일반적인 방법으로 되어 있었다.

본 발명자들은 약효가 우수한 알로에 베라를 거부감없이 누구나 손쉽게 음용할 수 있도록 하기 위해 알로에 베라겔에서 유산 생성 및 풍미가 우수한 유산균을 사용하여 발효시킴으로써 유기산이나 향의 첨가없이 유산균 발효에 의해 그의 맛과 기호성이 크게 향상된 발효 알로에 베라겔을 제공할 수 있고, 또한 녹차를 발효시켜 음료를 제조하면 녹차가 갖는 고유한 효능과 기호성을 유지하면서 동시에 균이 생성하는 풍미물질에 의한 풍미와 발효산물에 의해 청량감 있는 녹차 발효생균 음료를 제공할 수 있으리라는 착상하에, 광범위하게 각종 균에 대하여 타당성을 시험하였고 그 결과로서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 녹차를 발효시켜 녹차 발효생균 음료를 제고하는데 사용하거나 알로에 베라겔의 제조에 사용할 수 있는 신규한 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 산 생성능이 우수하며 기호성이 좋은 풍미를 생성하는 유산균을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적 및 작용은 이하 상세한 설명에 의해 당업자에게 명확해질 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명자들은 녹차를 발효시켜 녹차 발효생균 음료를 제고하거나 또는 알로에 베라겔의 발효에 유용하게 사용할 수 있는 신규한 균주를 찾기 위하여, 각종 소채(蔬菜)류와 김치에서 생육하는 야생 유산균주중 비교적 유산 생성력이 우수하며 기호성이 좋은 풍미를 생성하는 균주를 선별하고 변이제 처리방법으로써 변이시켜 가당 녹차 침출액에서 유산생성력(생성속도, 생성량)이 우수하며 또한 기호성이 좋은 풍미를 생성하는 유산균 변이주를 얻었다.

소채류와 물김치에서 분리한 유산균주중 락토바실러스속(Lactobacillus sp.) 4종, 스트렙토코커스속(Streptococcus sp.) 2종류, 류코노스탁속(Leuconostoc sp.) 1종등 총 7종의 유산균을 동정하였다.

동정된 7종의 야생형 유산균주를 각각 10% 환원탈지유에서 배양하여 그의 생균수가 10⁷-10⁸/㎖인 스타터를 만든 다음 이를 녹차침출액 총중량의 0.6-1 중량%의 양으로 접종하여 배양하고, 각 균주의 균체생장능, 유산 생성능 및 풍이물질 생성능을 검사하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

각 유산 균주의 가당 녹차 침출액에서 발효성적

한편 별도로 알로에 생엽을 채취하여 공지의 방법으로 세척, 제피한 후 마쇄하여 점질상의 겔을 얻고 비타민과 점증제등을 첨가하였다. 여기에 다른 영양원의 공급없이 설탕, 과당, 포도당을 적정비율 첨가하여 10˚Brix 정도로 조절하고 탄산나트륨(Na₂CO₃)이나 중탄산나트륨(NaHCO₃)으로 pH를 6.5에 조정시킨 후 살균하여 냉각한 가당 알로에 베라겔을 만들었다.

상기에서와 동일한 7종의 야생 유산균주를 각각 10% 환원 탈지유에서 배양하여 그의 생균수가 10⁷-10⁸/㎖인 스타터를 만든다음 이를 알로에 베라겔 총중량의 0.6-1% 접종하여 배양하고, 각 균주의 균체생장능, 유산 생성능 및 풍미물질 생성능을 검사하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

각 유산 균주의 알로에 베라겔에서 발효 성적

상기 표 1 및 2에서 관능점수는 각각의 균주를 사용하여 가당 녹차 침출액 또는 알로에 베라겔을 발효시킨후 15명의 관능검사 요원으로 하여금 다음의 5점 척도에 따라 기호도를 평가하도록 하였다.

5 : 매우좋다.

4 : 좋다.

3 : 보통이다.

2 : 나쁘다.

1 : 매우 나쁘다.

상기 기호도의 평가 결과에 따라 소채류와 물김치에서 분리해낸 야생 유산균주 7종중 녹차 침출액 및 알로에 베라겔의 발효에 있어 산생성력이 비교적 우수하고 풍미가 좋은 락토바실러스 아시도필러W1031과 스트렙토코커스 써모필러스 W1032를 선정하였다. 그러나 상기 표 1 및 2와 같은 발효패턴에 있어서, 이들의 발효시간이 오래 걸린다는 점과 풍미물질 생성에 있는 만족스리운 결과를 보이지 못한점 등으로 경제성이 떨어지는 문제점이 있었다.

그래서 본 발명자들은 1차 선정한 2종의 야생균주에 물리, 화학적 변이처리를 병행하여 락토바실러스 아시도필러스의 경우 산생성이 더욱 우수하여 발효기간을 단축시킬 수 있고 스트렙토코커스 써모필러스의 경우 산생성과 함께 풍미물질의 생성이 왕성하여 기호성을 증진시킬 수 있는 변이균주를 계속 선택 분리하였다.

이와 변이주를 얻기 위한 본 발명의 실험 및 결과를 나타내었다.

선정된 2종의 야생균주를 MRS 액체 배지에 배양하여 생균수가 10⁸/㎖이상인 배양액을 얻고 이를 0.1M 멸균 인산 완충용액(pH 7.2)에 희석하여 균수가 10³-10⁴/㎖의 균희석액을 만든다.

실험예 1

미리 준비한 여러개의 MRS 한천배지로 고정시킨 페트리접시에 멸균 피펫으로 각각 0.2㎖씩 락토바실러스 아시도필리스 W1031 및 스트렙토코서스 써모필러스 W1032의 희석액을 떨어드린 후 도말하여 적색광(5W)의 암실하에서 페트리접시의 뚜껑을 개봉한 상태로 파장 253.7nm의 자외선 살균등(15W)을 50㎝의 거리로 하기 표 4에 나타낸 시간대별로 조사한 후 36℃에서 72시간 배양하여 자외선 등을 조사하지 않은 대조군과 집락(Colony)수를 비교하여 생존율을 구하였다.

[표 4]

자외선 조사시간에 따른 각 균주 생존율

일반적으로 자외선 조사시 변이균주는 생존율 0.1∼1%의 조건하에서 분리하는 것을 감안하여 락토바실러스 아시도필러스 W1031는 5∼10분, 스트렙토코커스 써모필러스 W1032는 3∼5분 조사시 생존한 집락을 취하였다.

실험예 2

상기에서 얻어진 변이제-처리 균주를 탄소원으로 설탕과 과당만을 사용하도록한 최소배지(설탕 2.5%, 과당 2.5%, 인산제일칼륨 0.1%, 인산제이칼륨 0.05%, 황산철 0.005%, 황산 마그네슘 0.0125%, 황산암모늄 0.2%, 판토텐산 칼슘 0.0125%, 염화나트륨 0.006%, 비오틴 20㎍/ℓ)에서 24시간 배양한 후 원심분리(5000g×15분)하여 균체를 수집하고 이를 0.1M인산완충용액(pH7.2)으로 2회 세척한 후 동일 완충용액에 10⁷-10⁸/㎖의 최종농도로 현탁하여 균주 현탁액을 만들었다.

여기에 DNA의 인산이나 염기부분을 손상하여 변이를 일으키는 유기제로서 알려진 EMS(에틸메탄설페이트), MMS(메틸메탄설페이트), MNNG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)을 각각 약 300㎍/㎖ 의 최종농도로 첨가하여 30℃에서 60분 경과후 생균수를 측정하였다.

표 5에 각 화학적 변이제를 상기 조건으로 처리하였을때 락토바실러스 아시도필러스 W1031와 스트렙토코거스 써모필러스 W1032의 생존율을 나타내었다.

[표 5]

각 변이제 처리에 따른 생존율

각 변이제 처리시 상기 생존율로 얻어진 변이균주중 산생성력이 우수한 균주를 선별하기 위해 pH 지시약으로 변색 범위가 5.8(황)-7.2(적)인 아리자린(Alizarin, Merck cat. No 1016)을 0.005% 첨가한 최소 한천배지(설탕 2.5%, 과당 2.5%, 한천 2%, 인산제일칼륨 0.1%, 인산제이칼륨 0.05%, 황산철 0.02%, 황산마그네슘 0.025%, 판토텐산칼슘 0.015%, 염화나트륨 0.06%, 비오틴 20㎍/ℓ)에서 배양하여 색상의 변화를 관찰하였으며 그 결과 MNNG 처리한 변이균주의 산생성력이 가장 우수하여 집락주위의 색상이 진한 황색으로 변색되었고 집락의 크기와 황색띠와의 상대비가 가장 큰 것으로 나타났다.

MNNG로 처리하였던 분리 변이균주를 다시 아리자린이 첨가된 10% 당농도(설탕 5%, 과당 5%)의 최소 한천 배지에 도말하여 변색정도로 선택분리하였으며 10회 이상 동일조건으로 계대 배양하여 분리하여 변이의 안정성을 확보하였다. 이렇게 얻어진 변이균주는 친주인 야생균주와 비교하였을때 탄소원으로 설탕과 과당의 이용능력이 뛰어났으며 산생성력도 우수하였다. 이들 변이주들을 당농도 5%(설탕 2.5%+과당 2.5%) 또는 10%(설탕 5%+과당 5%)이며 아리자인이 첨가된 최소배지에서 얻어진 변이균주와 친주의 당이용능 및 산생성능 등의 특성을 비교하고 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6]

야생균주와 변이균주와의 당이용성 및 산생성력 비교

실험예 3

상기 실험예 1과 2를 거쳐 얻어진 변이균주중 산생성력이 우수한 균주를 선별하기 위해 pH지시약으로서 그의 변색범위가 4.4(적)-6.2(황)으로서 산성쪽에 더 가까운 메틸레드(Methyl red, Merck cat. No 6076)을 최소한천배지에 0.07% 첨가한 후 이 배지에서 생성된 집락중 주위 색상이 적색으로 많이 변색되고 집락크기와 적색띠와의 상대비가 큰 집락만을 선택적으로 선별하였다.

선별된 균주로 다시 위의 조작을 여러회 반복하였으며 최종 선별된 변이균주는 초기의 변이균주와 비교하였을때 아리자린(Alizarin)이 첨가된 MRS 한천배지내에서 집락을 형성함과 동시에 주위를 황색으로 변색시켰으며 메틸레드(Methyl red)가 첨가된 MRS 한천배지내에서 72시간 배양하여 완전한 집락을 형성하였을때 집락주위의 색상이 초기 변이균주에 비해 훨씬 진한 적색에 가까왔다.

상기 실험예 1-3을 거쳐 얻어진 최종 변이균주를 각각 락토바실러스 아시도필러스 TP104, 스트렙토코커스 써모필러스 TP105라 명명하였으며 실제 이 변이균주로써 설탕, 과당, 포도당을 첨가하여 10˚Brix로 조절한 녹차 침출액을 발효시켰을때 락토바실러스 아시도필러스 TP104의 경우 산생성력이 월등하였으며 스트렙토코거스 써모필러스 TP105의 경우 산생성과 풍미물질 생성이 더 우수하였다.

본 발명의 변이주 락토바실러스 아시도필러스 TP104와 스트렙토코커스 써모필러스 TP105는 1994년 5월 13일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁되어 각각 KFCC-10819 및 KFCC-10820의 수탁번호를 부여받았다.

본 발명의 두 변이주는 산생성능이 우수하고 풍미가 우수한 발효산물을 생성하기 때문에 후술하는 각종 실험예에서 입증되듯이 녹차 발효생균음료 및 알로에벨라겔 발효음료의 제조에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 균주들은 개별적으로 사용될 수도 있고, 또는 함께 사용할 수도 있다. 함께 사용하는 경우 얻어지는 발효 음료의 기포성이 우수하기 때문에 두 균주를 병용하여 발효음료를 제고하는 것이 바람직하다.

위에서 얻은 균주중 L.acidophilus TP104의 균학적 특성(형태학적 및 생리학적 특성)을 그의 친주와 비교하고 결과를 표 7에 나타내었다.

[표 7]

락토바실러스 아시도필러스의 균학적 특성

Bergey's manual의 L.acidophilus 동정 항목에 의거하여 변이주인 락토바실러스 아시도필러스 TP104를 야생균주와 비교하였을때 다른 성질은 유사하나, 과당, 설탕, 포도당에서 산생성이 현저하게 높다는 점과 pH 4.5에서 생장하는 것이 상이한 점으로 관할되었다.

설험예 4

각 야생균주 및 변이주를 당이 첨가된 최소 한천배지에서 배양하고, 배양 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일후에 산생성력을 비교하여 산도(%)를 계산하고 결과를 표 8에 나타내었다.

[표 8]

배양시간에 따른 산생성력의 비교

상기 표 8의 결과와 같이 발효기간중 산생성의 변화는 2일 경과후부터 변이균주와 야생균주가 큰폭의 차이를 보이고 있으며 변이주 L. acidophilus TP104의 경우 발효기간 2일 경과후부터 야생균주에 비해 약 30∼65%의 산생성력의 증가를 보였다.

실험예 5

각 친주와 변이균주를 가당 녹차 침출액 또는 알로에 베라겔에서 5일간 발효시키고, 그들의 발효성적을 생균수, 산도, 발효액의 pH, 잔당의 양 및 당소비율의 측면에서 평가하였다. 표 9에는 가당 녹차 침출액에서의 발효성적을, 표 10에는 알로에 베라겔에서의 발효성적을 나타내었다.

[표 9]

배양시간에 따른 산생성력의 비교

주 : 초기당 110g/ℓ(Glucose기준)

[표 10]

알로에 베라겔에서 각 야생균주와 변이주의 발효성적

주 : 초기당 110g/ℓ(Glucose기준)

실험예 6

변이주 L.acidophilus TP104와 S.thermophilus TP105를 단독 또는 1 : 1, 2 : 1 또는 1 : 2의 비율로 혼합한 균주를 알로에 베라겔에 또는 녹차 침출액에 이들의 총중량의 약 1%로 되게 접종하여 발효를 행하고, 각 균주군 모두 발효액의 산도가 0.15%∼0.2%에 도달하면 발효를 중지하고 훈련된 10명의 관능검사 요원에 의해 그의 맛과 향, 전체적인 기호성을 테스트 하였다. 녹차에 대한 결과를 표 11에, 그리고 알로에 베라겔에 내한 결과를 표 12에 나타내었다.

기호성의 평가는 +++: 아주좋음, ++ : 좋음, 그리고 + : 보통의 기준에 따라 행하였다. 표 11 및 12에서 A는 L.acidophilus TP104를, 그리고 B는 S.thermophilus TP105를 나타낸다.

[표 11]

녹차침출액 발효시 균주 혼합 비율에 따른 관능검사 결과

[표 12]

알로에 베라겔 발효시 균주 혼합 비율에 따른 관능검사 결과

이러한 변이균주를 사용하여 발효음료를 제조하는 방법에 있어 공정별로 간단히 설명하면 다음과 같다.

발효에 사용될 변이 균주인 L.acidophilus TP104(KFCC-10189)와 S.thermophilus TP105(KFCC-10820)를 유산균 생육가능 배지인 10% 환원 탈지유 혹은 맥아즙 배지에 0.1%이상 접종하여 35∼40℃에서 15∼20시간 배양한 후 균수가 10⁷-10⁸/㎖될때 이를 스타터로 사용한다.

여기서 스타터는 발효시킬 녹차 침출액 또는 알로에 베라겔에 직접 혼입되어 맛에 영향을 미치므로 스타터 제조시 유산균 생육가능 배지는 따로 단백질, 아미노산등 질소원의 첨가가 필요없는 10% 환원 탈지유나 맥아즙을 가압 살균하여(120℃ 15분) 사용하는 것이 좋으며 녹차침출액 또는 알로에 베라겔에 대한 스타터의 접종량은 1중량%이상 첨가시 발효기간이 단축되는 효과를 거두나 녹차발효음료 또는 발효 알로에 베라겔의 맛에 영향을 미칠수 있고 0.6중량% 이하 첨가시 발효기간이 오래 걸려 경제성이 떨어지므로 0.6-1중량%가 적당하다.

여기서 스타터로 사용되는 균주는 두 균주를 단독으로 또는 병용하여 사용할 수 있다. 병용하는 경우 그 비율은 L.acidophilus TP104 스타터 대 S.thermophilus TP105 스타터가 2 : 1 비율이다. 이는 각 균주를 단독으로 사용하는 경우보다 균주수가 높게 나타나며 발효 초기에 많은 균주의 L.acidophilus에 의해 산생성이 빨라 발효기간을 단축시킴과 동시에 또한 S.themophilus의 경우 높은 산도에서 배양할수록 그의 풍미가 우수한 경향이 있어 초기에 L.acidophilus에 의해 생성된 산에 의해 두 균주의 배양조건이 적절한 조화를 이루기 때문이다.

스타터를 접종한 후 녹차 침출액 또는 알로에 베라겔을 35-40℃의 배양온도로 2-3일간 발효하여 산도가 0.15%-0.2%에 도달하면 발효를 중지하고 5℃이하로 급냉한다.

Claims

당으로부터 산을 생성하는 능력이 우수하고, pH 4.5에서 생장이 가능한 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) TP104(KFCC-10819).
하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차 발효음료의 제조방법 : (1) 제1항에 기재된 락토바실러스 아시도필러스 TP104(KFCC-10819)를 10% 환원 탈지유 혹은 맥아즙 배지에 0.1% 이상 접종하여, 35∼40℃에서 15∼20시간동안, 균수가 10⁷∼10⁸/㎖로 될 때까지 배양하여 스타터를 제조하는 단계, (2) 녹차 침출액에, (1)단계에서 제조한 스타터를 0.6∼1.0중량%의 양으로 접종한 후 35∼40℃에서 2∼3일간, 산도가 0.15∼0.2%에 도달할 때까지 발효시키는 단계 및 (3) 발효 중지후,5℃이하로 급냉시키는 단계.