KR960013120B1 - 유산균 변이주를 이용한 녹차 발효생균 음료의 제조방법 - Google Patents
유산균 변이주를 이용한 녹차 발효생균 음료의 제조방법 Download PDFInfo
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Description
본 발명은 유산균 변이주를 사용하여 녹차 발효생균 음료를 제조하는 방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 락토바실러스 또는 스트렙토코커스 속의 유산균을 이용하여 녹차 발효생균 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다.
녹차는 기원전 2,700년경부터 음용되어온 기호식품으로서 그 역사적 의의가 클 뿐만 아니라 최근에는 녹차에 함유된 여러 성분들의 약리적인 메카니즘이 점차 밝혀짐에 따라 그 가치가 재인식되고 일반인들도 녹차에 대한 관심이 점차 고조되어 그의 소비가 증대되는 추세에 있다.
차의 성분은 차 나무의 품종, 재배조건, 채엽시기, 채엽부위, 토질, 제조방법, 나무의 수령이나 수세등에 따라 조성이 달라지게 되며, 폴리페놀, 카페인, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 색소성분 및 각종 유기산류, 효소, 비타민, 무기성분 등으로 구성되어 있다. 이들 성분들중 특히 탄닌, 카페인, 비타민 C, 폴라보노이드 및 무기성분들은 항산화작용, 항암작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 피부미용 및 강심작용 등의 각종 중요한 약리적 효능을 나타낸다.
이와 같이 약리적 효능 및 기호성이 우수한 녹차는 종래 그대로 사용되거나 또는 반발효 또는 발효법에 의해 발효되어 각각 녹차, 우롱차 및 홍차의 형태로 이용되어 왔다.
그러나, 녹차를 섭취하는데에는 녹차 특유의 취와 특이한 맛으로 인한 거부감 등이 문제시되어 녹차의 풍미개량을 목적으로 종래에는 유기산을 첨가하려 과즙이나 인공적인 향을 첨가하는 것이 일반적인 방법으로 되어 왔다.
본 발명자들은 이와 같이 약리적 효능 및 기호성이 우수한 녹차를 거부감없이 누구나 손쉽게 음용할 수 있도록 하기 위해 광범위하게 연구한 결과, 녹차에서 유산생성 및 풍미가 우수한 두 종류의 유산균 변이주를 사용하여 녹차를 발효시킴으로써 유기산이나 향의 첨가없이도 유산균 발효에 의해 그의 맛과 기호성이 크게 향상된 녹차 발효생균 음료를 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 가당 녹차에 유산균을 발효시켜 녹차 발효생균 음료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 락토바실러스 아시도필러스 TP104 및 스트렙토코커스 써모필러스 TP105로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 유산균을 이용하여 녹차를 발효시키므로써 녹차 발효생균 음료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 락토바실러스 아시도필러스 TP104 및 스트렙토코커스 써모필러스 TP105의 2 : 1 중량부 혼합 균주를 이용하여 녹차를 발효시키므로써 녹차 발효생균 음료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 유산균에 의해 생성된 유산과 풍미에 의해 기호성을 크게 개선시켜 쉽게 음용할 수 있을 뿐 아니라 건강식품으로서의 기능면에서도 녹차의 약효성분을 그대로 함유함은 물론 녹차 고유의 위장기능 강화작용에 유산균에 의한 정장효과가 추가됨으로써 위장의 기능 강화 및 정장효과를 더욱 크게 얻을 수 있는 녹차 발효생균 음료를 제공할 수 있다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서 사용되는 녹차는 건조녹차(증제차 혹은 덖음차)를 취하여 증류수를 가하여 침출, 여과하여 녹차 침출액을 얻고, 여기에 설탕, 과당, 포도당등을 적절비율로 첨가하여 10°Brix 정도로 조절하고 탄산나트륨(Na2CO3)이나 중탄산나트륨(NaHCO3)으로 pH를 6.5로 조정시킨 후 살균 및 냉각하여 제조한다.
녹차 발효에 이용할 산생성능이 우수하고 풍미물질 생성이 왕성한 균주를 얻기 위해 본 발명자들은 소채(蔬菜)류와 물김치에서 분리한 유산균주중 락토바실러스속(Lactobacillus sp.) 4종, 스트렙토코커스속(Streptococcus sp) 2종류, 류코노스탁속(Leuconostoc sp.) 1종등 총 7종의 유산균을 동정하였다.
동정된 7종의 야생형 유산균주를 각각 10% 환원탈지유에서 배양하여 그의 생균주가 107-108/ml인 스타터를 만든 다음 이를 녹차 총중량의 0.6-1%가량 접종하여 배양하고, 각 균주의 균체 생장능, 유산 생성능 및 풍미물질 생성능을 검사하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
각 유산균주의 가당 녹차 침출액에서 발효성적
초기 당농도 110g/ℓ(Glucose 기준)
상기 표 1에서 관능점수는 각각의 균주를 사용하여 가당 녹차 침출액을 발효시킨 후 15명의 관능검사 요원으로 하여금 다음의 5점 척도에 따라 기호도를 평가하도록 하였다.
5 : 매우 좋다.
4 : 좋다.
3 : 보통이다.
2 : 나쁘다.
1 : 매우 나쁘다.
상기 기호도의 평가 결과에 따라 소채류와 물김치에서 분리해 낸 야생 유산균주 7종중 녹차 침출액의 발효에 있어 산생성력이 비교적 우수하고 풍미가 좋은 락토바실러스 아시도필러스 W1031과 스트렙토코커스 써모필러스 W1032를 선정하였다. 그러나 상기 표 1과 같은 발효 패턴에 있어서, 이들의 발효시간이 오래 걸린다는 점과 풍미물질 생성에 있어 만족스러운 결과를 보이지 못한 점 등으로 경제성이 떨어지는 문제점이 있었다.
그래서 본 발명자들은 1차 선정한 2종의 야생균주에 물리, 화학적 변이처리를 병행하여 락토바실러스 아시도필러스의 경우 산생성이 더욱 우수하여 발효기간을 단축시킬 수 있고 스트렙토코커스 써모필러스의 경우 산생성과 함께 풍미물질의 생성이 왕성하여 기호성을 증진시킬 수 있는 변이균주를 계속 선택 분리하였다.
이하 변이주를 얻기 위한 본 발명의 실험 및 결과를 나타내었다.
선정된 2종의 야생균주를 MRS 액체 배지에 배양하여 생균수가 108/ml 이상인 배양액을 얻고 이를 0.1M 멸균 인산 완충용액(pH7.2)에 희석하여 균수가 108-104/ml의 균희석액을 만든다.
실험예 1
미리 준비한 여러개의 MRS 한천배지를 고정시킨 페트리접시에 멸균 피펫으로 각각 0.2ml씩 락토바실러스 아시도필러스 W103 및 스트렙토코커스 써모필러스 W1032의 희석액을 떨어뜨린후 도말하여 적색광(5W)의 암실하에서 페트리접시의 뚜껑을 개봉한 상태로 파장 253.7nm의 자외선 살균등(15W)을 50㎝의 거리로 하기 표 2에 나타낸 시간대별로 조사한 후 36℃에서 72시간 배양하여 자외선 등을 조사하지 않은 대조군과 집락(Colony)수를 비교하여 생존율을 구하였다.
[표 2]
자외선 조사시간에 따른 각 균주 생존율
일반적으로 자외선 조사시 변이균주는 생존율 0.1~1%의 조건하에서 분리하는 것을 감안하여 락토바실러스 아시도필러스 W1031는 5~10분, 스트렙토코커스 써모필러스 W1032는 3~5분 조사시 생존한 집락을 취하였다.
실험예 2
상기에서 얻어진 변이제-처리 균주를 탄소원으로 설탕과 과당만을 사용하도록한 최소배지(설탕 2.5%, 과당 2.5%, 인산제일칼륨 0.1%. 인산제이칼륨 0.05%, 황산철 0.005%, 황산마그네슘 0.0125%, 황산암모늄 0.2%, 판토텐산 칼슘 0.0125%, 염화나트륨 0.006%, 비오틴 20㎍/ℓ)에서 24시간 배양한 후 원심분리(5000g×15분)하여 균체를 수집하고 이를 0.1M의 인산완충용액(pH7.2)으로 2회 세척한 후 동일완충용액에 107-108/ml의 최종농도로 현탁하여 균주 현탁액을 만들었다.
여기에 DNA의 인산이나 염기부분을 손상하여 변이를 일으키는 유기제로서 알려진 EMS(에틸메탄설페이트), MMS(메틸메탄설페이트), MNNG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)을 각각 약 300㎍/ml의 최종농도로 첨가하여 30℃에서 60분 경과후 생균수를 측정하였다.
표 3에 각 화학적 변이제를 상기 조건으로 처리하였을때 락토바실러스 아시도필러스 W1031와 스트렙토코커스 써모필러스 W1032의 생존율을 나타내었다.
[표 3]
각 변이제 처리에 따른 생존율
각 변이제 처리시 상기 생존율로 얻어진 변이균주중 산생성력이 우수한 균주를 선별하기 위해 pH 지시약으로 변색 범위가 5.8(황)-7.2(적)인 아리자린(Alizarin, Merck cat. No 1016)을 0.005% 첨가한 최소 한천배지(설탕 2.5%, 과당 2.5%, 한천 2%, 인산제일칼륨 0.1%, 인산제이칼륨 0.05%, 황산철 0.02%, 황산마그네슘 0.025%, 판토텐산 칼슘 0.015%, 염화나트륨 0.06%, 비오틴 20㎍/ℓ)에서 배양하여 색상의 변화를 관찰하였으며 그 결과 MNNG 처리한 변이균주의 산생력이 가장 우수하여 집락주위의 색상이 진한 황색으로 변색되었고 집락의 크기와 황색띠와의 상대비가 가장 큰 것으로 나타났다.
MNNG로 처리하였던 분리 변이균주를 다시 아리자린이 첨가된 10% 당농도(설탕 5%, 과당 5%)의 최소 한천 배지에 도말하여 변색정도로 선택분리하였으며 10회 이상 동일조건으로 계대 배양하여 분리하여 변이의 안정성을 확보하였다. 이렇게 얻어진 변이균주는 친주인 야생균주와 비교하였을때 탄소원으로 설탕과 과당의 이용능력이 뛰어났으며 산생성력도 우수하였다. 이들 변이주들을 당농도 5%(설탕 2.5%+과당 2.5%) 또는 10%(설탕 5%+과당 5%)이며 아리자린이 첨가된 최소배지에서 얻어진 변이균주와 친주의 당이용능 및 산생성능 등의 특성을 비교하여 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
야생균주와 변이균주와의 당이용성 및 산생성력 비교
(+++ : 아주 강함, ++ : 강함, + : 보통)
실험예 3
상기 실험예 1과 2를 거쳐 얻어진 변이균주중 산생성력이 우수한 균주를 선별하기 위해 pH 지시약으로서 그의 변색범위가 4.4(적)-6.2(황)으로서 산성쪽에 더 가까운 메틸레드(Methyl red, Merck cat. No 6076)을 최소한천배지에 0.07% 첨가한 후 이 배지에서 생성된 집락중 주위 색상이 적색으로 많이 변색되고 집락크기와 적색띠와의 상대비가 큰 집락만을 선택적으로 선별하였다.
선별된 균주로 다시 위의 조작을 여러회 반복하였으며 최종 선별된 변이균주는 초기의 변이균주와 비교하였을때 아리자린(Alizarin)이 첨가된 MRS 한천배지내에서 집락을 형성함과 동시에 주위를 황색으로 변색시켰으며 메틸레트(Methyl red)가 첨가된 MRS 한천배지내에서 72시간 배양하여 완전한 집락을 형성하였을때 집락주위의 색상이 초기 변이균주에 비해 훨씬 진한 적색에 가까웠다.
상기 실험예 1-3을 거쳐 얻어진 최종 변이균주를 각각 락토바실러스 아시도필러스 TP104, 스트렙토코커스 써모필러스 TP105라 명명하였으며 실제 이 변이균주로써 설탕, 과당, 포도당을 첨가하여 10° Brix로 조절한 녹차를 발효시켰을 때 락토바실러스 아시도필러스 TP104의 경우 산생성력이 월등하였으며 스트렙토코커스 써모필러스 TP105의 경우 산생성과 풍미물질 생성이 더 우수하였다.
본 발명의 변이주 락토바실러스 아시도필러스 TP104와 스트렙토코커스 써모필러스 TP105는 1994년 5월 13일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁되어 각각 KFCC-10819 및 KFCC-10820의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명의 두 변이주는 산생성능이 우수하고 풍미가 우수한 발효산물을 생성하기 때문에 후술하는 각종 실험예에서 입증되듯이 녹차 발효생균 음료의 제조에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 균주들은 개별적으로 사용될 수도 있고, 또는 함께 사용될 수도 있다. 함께 사용되는 경우 얻어지는 발효 음료의 기호성이 우수하기 때문에 두 균주를 병용하여 발효 음료를 제조하는 것이 바람직하다.
위에서 얻은 L. acidophilus TP104와 s. thermophilus TP105의 균학적 특성(형태학적 및 생리학적 특성)을 그의 친주들과 비교하여 결과를 표 5 및 제 6에 각각 나타내었다.
[표 5]
락토바실러스 아시도필러스의 균학적 특성
Bergey's manual의 L. acidophilus 동정 항목에 의거하여 변이주인 락토바실러스 아시도필러스 TP104를 야생균주와 비교하였을때 다른 성질은 유사하나, 과당, 설탕, 포도당에서 산생성이 현저하게 높다는 점과 pH 4.5에서 생장하는 것이 상이한 점으로 관찰되었다.
[표 6]
S. thermophilus의 균학적 특성
Bergey's manual의 S. thermophilus 동정항목에 의거하여 S. thermophilus TP105를 야생균주와 비교하였을때 다른 성질은 유사하나, 과당, 설탕, 포도당에서 산생성력이 우수한 점과 글루코스배지에서 최종 pH가 3.95-4.3 정도까지 낮다는 점, 그리고 pH 4.5에서 야생주보다 생장이 우수하고 그의 풍미가 우수하다는 점이 관찰되었다.
실험예 4
각 야생균주 및 변이주를 당이 첨가된 최소 한천배지에서 배양하고, 배양 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일후에 산생성력을 비교하여 산도(%)를 계산하고 결과를 표 7에 나타내었다.
[표 7]
배양시간에 따른 산생성력을 비교
상기 표 7의 결과와 같이 발효기간중 산생성의 변화는 2일 경과후부터 변이균주와 야생균주가 큰 폭의 차이를 보이고 있으며 변이주 L. acidophilus TP104의 경우 발효기간 2일 경과후부터 야생균주에 비해 산생성능에 있어서 약 30-65%의 증가를 보였다.
실험예 5
각 친부와 변이균주를 가당 녹차침출액에서 5일간 발효시키고, 그들의 발효성적을 생균수, 산도, 발효액의 pH, 잔당의 양 및 당소비율의 측면에서 평가하고 그 결과를 표 8에 나타내었다.
[표 8]
가당 녹차 침출액에서 각 야생균주와 변이주의 발효성적
주 : 초기당 110g/ℓ(Glucose 기준)
실험예 6
변이주 L. acidophilus TP104와 S. thermophilus TP105를 단독 또는 1 : 1, 2 : 1 또는 1 : 2의 비율로 혼합한 균주를 실시예 1의 가당 녹차 침출액에 이들의 총중량의 약 1%로 되게 접종하여 발효를 행하여, 각 균주군 모두 발효액의 산도가 0.15-0.2%에 도달하면 발효를 중지하고 훈련된 10명의 관능검사 요원에 의해 그의 맛과 향, 전체적인 기호성을 테스트하고 결과를 표 9에 나타내었다.
기호성의 평가는 +++ : 아주 좋음, ++ : 좋음, 그리고 + : 보통의 기준에 따라 행하였다. 표 9에서 A는 L. acidophilus TP104를, 그리고 B는 S. thermophilus TP105를 나타내었다.
[표 9]
녹차침출액 발효시 균주 혼합 비율에 따른 관능검사 결과
상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, L. acidophilus TP104(KFCC-10189)와 S. thermophilus TP105(KFCC-10820)를 2 : 1의 중량비로 혼합하여 녹차를 발효시키는 경우 기호성이 가장 우수한 녹차 발효생균 음료가 얻어졌다.
본 발명의 방법에 따라 유산균 변이균주를 사용하여 녹차 발효생균 음료를 제조하는 방법에 있어 각 공정별로 간단히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서 사용될 가당 침출액은 다음과 같이 제조할 수 있다. 건조녹차를 취하여 85℃의 증류수를 20배수를 채운 후 85℃에서 약 10분간 침출하고 400메쉬로 여과하여 녹차 침출액을 얻는다. 여기에 복용시 적정 당도와 유산균이 이용할 탄소원의 제공을 목적으로 설탕과 과당, 포도당을 첨가하여 10°Brix 정도로 당도를 조절하여 탄산나트륨(Na2CO3)이나 중탄산나트륨(NaHCO3)으로 pH 6.5에 조정시킨 후 70~80℃에서 20~30분간 살균하고 40℃ 냉각하여 발효를 위한 가당 녹차 침출액을 만든다.
발효에 사용될 변이 균주인 L. acidophilus TP104(KFCC-10189)와 S. thermophilus TP105(KFCC-10820)를 유산균 생육가능 배지인 10% 환원 탈지유 혹은 맥아즙배지에 0.1% 이상 접종하여 35~40℃에서 15~20시간 배양한 후 균수가 107-108/ml될 때 이를 스타터로 사용한다.
여기서 스타터는 발효시킬 녹차 침출액에 직접 혼입되어 맛에 영향을 미치므로 스타터 제조시 유산균 생육가능 배지는 따로 단백질, 아미노산등 질소원의 첨가가 필요없는 10% 환원 탈지유나 맥아즙을 가압 살균하여(120℃ 15분) 사용하는 것이 좋으며 녹차침출액에 대한 스타터의 접종량은 1중량% 이상 첨가시 발효기간이 단축되는 효과를 거두나 녹차발효 음료의 맛에 영향을 미칠 수 있고 0.6중량% 이하 첨가시 발효기간이 오래 걸려 경제성이 떨어지므로 0.6-1중량%가 적당하다.
여기서 스타터로 사용되는 균주는 두 균주를 단독으로 또는 병용하여 사용할 수 있다. 병용하는 경우 그 비율은 L. acidophilus TP104 스타터 대 S. thermophilus TP105 스타터가 2 : 1중량비이다. 이는 각 균주를 단독으로 사용하는 경우보다 균주수가 높게 나타나며 발효 초기에 많은 균주의 L. acidophilus에 의해 산생성이 빨라 발효기간을 단축시킴과 동시에 또한 S. thermophilus의 경우 높은 산도에서 배양할수록 그의 풍미가 우수한 경향이 있어 초기에 L. acidophilus에 의해 생성된 산에 의해 두 균주의 배양조건이 적절한 조화를 이루기 때문이다.
스타터를 접종한 후 침출액을 35-40℃의 배양온도로 2-3일간 발효하여 산도가 0.15-0.2%에 도달하면 발효를 중지하고 5℃ 이하로 급냉하여 녹차 발효생균 음료를 제조한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.
실시예 1
발효에 사용된 균중에 L. acidophilus TP104(KFCC 10819)와 S. thermophilus TP105(KFCC 10820)를 각각 유산균 생육 가능 배지인 10% 환원 탈지유 또는 맥아즙 배지에 0.1% 이상 접종하여 38℃에서 18시간 배양하여 균수가 107-108/ml인 각 스타터를 얻었다.
별도로 건조 녹차(증제차) 60g을 취하여 85%의 증류수 20배수를 채운 후 85℃에서 약 10분간 침출하고 400메쉬로 여과하여 녹차 침출액을 만든 다음 여기에 설탕 100g을 첨가하여 10°Brix 정도로 조절하고 탄산나트륨(Na2CO3)으로 pH를 6.5에 조정하여 80℃에서 30분간 열처리한 후 40℃로 냉각하였다.
이 가당 녹차 침출액에 상기의 L. acidophilus TP104 스타터와 S. thermophilus TP105 스타터를 2 : 1 비율로 혼합하여 0.6~1% 접종한 후 38℃ 배양 온도로 2~3일 발효하여 산도가 0.15~0.2% 도달시 발효를 중지하고 5℃ 이하로 급냉하였다.
실시예 2
실시예 1의 녹차 침출액에 설탕 70g, 액상 과당 37.5g을 첨가하여 10°Brix 정도로 조절한 후 이후의 과정은 실시예 1에서와 동일하게 실시하여 녹차 발효 음료를 제조하였다.
실시예 3
실시예 1의 녹차 침출액에 설탕 70g, 액상 과당 25g, 포도당 11g을 첨가하여 10°Brix 정도로 조절한 후 이후의 과정은 실시예 1에서와 동일하게 실시하여 녹차 발효 음료를 제조하였다.
실시예 4
실시예 1의 증제차를 덖음차로 변경하여 실시하며, 설탕 60g, 액상 과당 50g을 첨가하여 10°Brix 정도로 조절한 후 이후의 과정은 실시예 1에서와 동일하게 실시하여 녹차 발효 음료를 제조하였다.
실시예 5
실시예 1의 증제차를 덖음차로 변경하여 실시하며 설탕 100g을 첨가하여 10°Brix 정도로 조절하고, 중탄산나트륨으로 pH를 6.5로 조정한 후, 이후의 과정은 실시예 1에서와 동일하게 실시하여 녹차 발효 음료를 제조하였다.
실시예 6
실시예 1의 증제차를 덖음차로 변경하여 실시하며, 설탕 70g, 액상 과당 25g, 포도당 11g을 첨가하여 10°Brix 정도로 조절하고, 중탄산나트륨으로 pH를 6.5로 조정한 후 이후의 과정은 실시예 1에서와 동일하게 실시하여 녹차 발효 음료를 제조하였다.
Claims (4)
- 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus Acidophilus) TP104(KFCC-10819) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) TP105(KFCC-10820)로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 유산균을 이용하여 가당 녹차 침출액을 발효시킴을 특징으로 하는 녹차 발효생균 음료의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 락토바실러스 아시도필러스 TP104(KFCC-10819) 및 스트렙토코커스 써모필러스 TP105(KFCC-10820)의 2 : 11 중량비 혼합 균주를 이용하여 가당 녹차 침출액을 발효시킴을 특징으로 하는 녹차 발효생균 음료의 제조방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유산균은 가당 녹차 침출액에 0.6~1중량%의 양으로 접종함을 특징으로 하는 녹차 발효생균 음료의 제조방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유산균을 이용한 발효는 유산이 0.15~0.2%의 양으로 생성될 때까지 2~3일간 실시함을 특징으로 하는 녹차 발효생균 음료의 제조방법.
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1994
- 1994-07-25 KR KR1019940017951A patent/KR960013120B1/ko not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109430456A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-03-08 | 齐鲁工业大学 | 一种茶酵素及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR960003613A (ko) | 1996-02-23 |
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