KR101669450B1 - 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 커피생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피 및 이의 제조방법에 관한 것으로 (A) 커피 생두 추출물을 영양원으로 하여 생장하는 김치 유산균을 분리하는 단계; (B) 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 30 내지 45 에서 배양하여 배양액을 제조하는 단계; (C) 커피 생두에 상기 (B)단계에서 제조된 배양액을 첨가여 커피 생두에 배양액을 접종하는 단계; 및 (D) 배양액이 접종된 커피 생두를 질소가스 하, 28 내지 32 에서 5 내지 15일 동안 고체발효하는 단계;를 포함함으로써, 카페인의 농도 변화 및 수용성 물질의 변화 없이 휘발성 유기 물질의 종류 및 농도만을 증대시킬 수 있다.

Description

커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피 및 이의 제조방법{Coffee fermented with lactic acid cultured from coffee beans extract and preparation method thereof}

본 발명은 커피에 함유된 성분에는 영향을 주지 않으면서 커피의 풍미를 향상시킬 수 있는 커피생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

커피는 커피나무 열매의 씨를 볶아서 만든 원두나 가루를 원료로 한 음료로서, 커피나무 열매가 붉게 익으면 과육이 벌어지면서 푸른빛을 띤 생두가 나오는데, 이것을 말려서 볶은 뒤 가루를 내어 사용한다.

맛은 쓴맛, 신맛, 단맛, 떫은맛 등 다양한데, 쓴맛은 카페인, 떫은맛은 탄닌, 신맛은 지방산, 단맛은 당질에서 비롯된다. 지방산은 포화지방산인 팔미트산과 스테아르산, 불포화지방산인 올레신과 필수지방산인 리놀레산이다. 그밖에 수분, 조단백질, 추출물, 조섬유, 회분과 휘발성 유기산 등이 들어 있다.

커피는 자극제로서 신경계통에 작용해 정신의 활동력과 지각을 활발하게 만들어 사고를 한층 명료하게 하고, 육체적으로는 근육을 긴장시켜 노동력을 증진시키며, 이뇨작용을 도와줘 위장활동을 촉진시키는 효능이 있는 것으로 알려지고 있다.

특히, 커피 속의 마그네슘 성분은 당뇨병 억제에 도움이 되며, 클로로겐산(chlorogenic acid) 성분은 폴리페놀 화합물의 일종으로서, 생체 내에서 과산화지질의 생성 억제효과, 콜레스테롤 생합성 억제효과, 항산화 작용 및 항암작용 등을 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 커피는 잠을 쫓는 각성효과 외에 학습능력 향상, 다이어트, 운동능력 제고, 숙취방지 및 해소, 암냄새 제거, 동맥경화 억제 등에 효과가 있는 것으로도 보고되고 있다.

한편, 식물추출물 발효식품은 채소, 과일, 종실, 해조류 등 식용식물을 압착 또는 당류의 삼투압에 의해 얻은 추출물을 자체발효 또는 유산균이나 효모 등을 접종, 발효시켜 식용유래 성분과 발효생성물을 섭취에 적합하도록 가공한 액상의 것을 말한다. 이를 응용한 발효기술로서, 식물체에 존재하는 효소 또는 유산균의 접종을 통한 식물 추출액을 발효시키면 효소들이 활성화되어 여러 가지 생화학반응을 일으킴으로써 식물체의 영양성분이 소화, 흡수되기 쉬운 형태로 변환될 수 있을 뿐만 아니라 효소작용에 의해 생성된 성분이 새로운 생리조절기능을 발현할 수 있다.

이러한 발효에 관계되는 미생물은 자연계에 많은 종류가 있으며 인체 내에도 수백억 이상이 존재하고 있다. 이러한 미생물은 인체에 유익한 종류가 있는 반면에 유해한 세균들도 많이 있다.

인체에 유익한 미생물의 대표격인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하는 균으로서, 유산균이 당으로부터 유산을 만드는 것을 발효라 하며, 이러한 발효과정을 거쳐서 발효유, 치즈, 버터와 같은 발효식품이 만들어진다.

따라서, 이러한 발효방법을 커피 생두에 적용하여 커피의 효능은 그대로 유지하면서 르왁과 같이 우수한 풍미를 보이는 커피 생두가 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제1014871호 대한민국 등록특허 제1045310호

본 발명의 목적은 커피 생두로부터 분리된 신규한 균주를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 카페인의 농도 변화 및 수용성 물질의 변화 없이 휘발성 유기 물질의 종류 및 농도만을 증대시킬 수 있는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피의 제조방법은 (A) 커피 생두 추출물을 영양원으로 하여 생장하는 김치 유산균을 분리하는 단계; (B) 상기 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 30 내지 45 ℃에서 배양하여 배양액을 제조하는 단계; (C) 커피 생두에 상기 (B)단계에서 제조된 배양액을 첨가여 커피 생두에 배양액을 접종하는 단계; 및 (D) 상기 배양액이 접종된 커피 생두를 질소가스 하, 28 내지 32 ℃에서 5 내지 15일 동안 고체발효하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 김치 유산균은 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P] 또는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]일 수 있다.

상기 (A) 단계에서의 커피 생두 추출물은 90 내지 120 ℃에서 열수추출한 추출물일 수 있다.

상기 (A) 단계에서의 김치 유산균은 상기 커피 생두 추출물 및 한천을 이용하여 커피 생두 고체배지를 제조하는 단계; 15 내지 18 ℃에서 7 내지 10일 동안 발효시킨 배추김치 국물을 희석하여 상기 커피 생두 고체배지에 도말하는 단계; 및 상기 배추김치 국물이 도말된 커피 생두 고체배지를 28 내지 32 ℃에서 45 내지 50시간 동안 배양하는 단계;를 포함하여 제조된 것일 수 있다.

상기 (C)단계 이전에 상기 커피 생두를 이산화탄소 가스 하에서 20 내지 30시간 동안 방치하는 단계를 추가할 수 있다.

상기 (C)단계에서 배양액이 접종된 커피 생두의 수분함량은 15 내지 20 중량%일 수 있다.

또한, 상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피는 커피 생두 추출물을 영양원으로 포함하는 배지에서 생장한 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 배양한 배양액으로 커피 생두를 고체 발효시킨 것일 수 있다.

상기 발효 시 상기 배양액과 혼합된 커피 생두의 수분함량은 15 내지 20 중량%일 수 있다.

상기 커피 생두 추출물은 90 내지 120 ℃에서 열수추출한 추출물일 수 있다.

상기 김치 유산균은 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P] 또는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]일 수 있다.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 신규한 균주는 커피 생두 추출물을 영양원으로 포함하는 배지에서 생육하는 김치유래 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P] 또는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]일 수 있다.

본 발명의 발효 커피는 카페인의 농도 변화 및 수용성 물질의 변화 없이 휘발성 유기 물질의 종류 및 농도만을 증대시켜 커피에 포함된 성분과 성상에는 영향을 주지 않으면서 커피의 풍미를 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 배양균을 커피 생두에 접종하여 발효 시 사용되는 발효기를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2 및 3, 비교예 2 및 3에서 제조된 발효 커피의 외관을 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 3에서 제조된 발효 커피에서 생장된 유산균의 16S-rDNA의 TGGE 프로파일이다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 발효 커피를 HPLC로 측정한 그래프이다. 이때 자외선 검출기의 흡수파장은 270 nm이다.
도 5는 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 발효 커피를 HPLC로 측정한 그래프이다. 이때 자외선 검출기의 흡수파장은 300 nm이다.
도 6은 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 발효 커피를 HPLC로 측정한 그래프이다. 이때 자외선 검출기의 흡수파장은 330 nm이다.
도 7은 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 발효 커피를 GLC로 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P]에 대한 계통수(Phylogenetic tree)이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]에 대한 계통수(Phylogenetic tree)이다.

본 발명은 카페인의 농도 변화 및 수용성 물질의 변화 없이 휘발성 유기 물질의 종류 및 농도만을 증대시킬 수 있는 커피생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 명세서에서, 용어 '고체발효'란 고체 기질에 일정량의 수분을 함유하게 한 후, 미생물을 키워서 발효시키는 방법을 의미하는 것으로서, '고상발효'라고도 알려져 있고, 고체발효는 액체발효와 비교하여 추출 및 정제가 용이하며 발효물의 본연에 물질 획득의 장점이 있다.

그러나 고체발효는 수분함량에 좌우되는데 12%이하가 되면 발효가 중단되고 80-85%이상이 되면 유리수가 나타나 발효를 저해하는 문제점이 있기 때문에 주의해야 한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발효 커피는 배양액으로 커피 생두를 발효시키는 것으로서, 상기 배양액은 커피 생두 추출물을 영양원으로 하여 생장하는 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 배양하여 얻은 것이다.

발효 커피(배양액 + 커피 생두)

배양액으로 커피 생두를 발효 시 상기 배양액에 접종된 커피 생두의 수분함량은 15 내지 20 중량%, 바람직하게는 16 내지 17 중량%가 되도록 한다. 상기와 같은 수분함량이 되도록 유산균 배양액이 접종되면 커피 생두는 촉촉한 상태가 되어 고체발효가 진행된다. 이는 커피 생두에 충분한 수분을 공급하여 팽윤시켜 조직을 연화시킨 다음 발효시키는 액상 발효와는 달리, 수용성 물질의 손실이 없어 커피 고유의 맛을 잃지 않을 수 있다.

커피 생두의 수분함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 발효균의 생장이 제한되어 발효의 효율이 낮아지고 발효가 중단될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 유동성 액체가 커피의 성분을 침출시킬 수 있어 커피의 성분이 감소하거나 고유의 풍미를 손상시킬 수 있다.

상기 배양액을 제조 시 김치 유산균의 균수는 종균 5 내지 15 부피%이다. 상기 초기 접종 균수가 종균 5 부피% 미만인 경우에는 배양시간이 길어지는 문제점이 있고, 15 부피%를 초과하는 경우에는 종균을 대량배양 해야 하는 문제점이 있을 수 있다.

배양액

상기 배양액은 커피 생두 추출물을 영양원으로 하여 생장하는 김치 유산균과 커피 생두 희석액을 30 내지 45 ℃에서 2 내지 3일 동안 배양하여 얻은 것이다. 통상적으로 유산균은 3일 이상 배양하지 않는데 이는 영양물질의 고갈로 유산균의 활성이 약해질 수 있고 젖산이 축적되어 유산균의 생균수가 감소할 수 있기 때문이다.

또한, 상기 커피 생두 추출물은 90 내지 120 ℃에서 열수추출한 추출물로서, 냉수추출, 초고압 추출 등의 다른 추출법에 의해 추출된 추출물에 비하여 김치 유산균과 배양이 잘 이루어지며 우수한 관능성을 가진 발효 커피를 얻을 수 있다.

또한, 상기 커피 희석액은 커피 생두 분말이 정제수에 현탁된 액체이다.

상기 김치 유산균은 커피 생두 추출물을 영양원으로 하여 생장하는 균주로서, 하기와 같은 방법을 통해 제조된다.

상기 김치 유산균은 (a) 커피 생두 추출물 및 한천을 이용하여 커피 생두 고체배지를 제조하는 단계; (b) 15 내지 18 ℃에서 7 내지 10일 동안 발효시킨 배추김치 국물을 희석하여 상기 커피 생두 고체배지에 도말하는 단계; 및 (c)상기 배추김치 국물이 도말된 커피 생두 고체배지를 28 내지 32 ℃에서 45 내지 50시간 동안 배양하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.

먼저, 상기 (a)단계에서 커피 생두는 열수추출한 커피 생두 추출물일 수 있다. 상기 커피 생두 추출물과 한천을 1 : 2의 중량비로 혼합한 후 정제수에 현탁하고 110 내지 130 ℃에서 10 내지 20분 동안 가압멸균한 다음 용기에 분주하여 응고시킴으로써 커피 생두 고체배지를 제조한다.

다음으로, 상기 (b) 및 (c)단계에서는 15 내지 18 ℃에서 7 내지 10일 동안 발효시킨 배추김치 국물을 800 내지 1500배 희석한 후 상기 희석된 배추김치 국물을 상기 제조된 커피 생두 고체배지에 도말하고 28 내지 32 ℃에서 45 내지 50시간 동안 배양하여 생장된 김치 유산균을 얻는다.

상기 커피 생두를 이용하여 생장된 김치 유산균은 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P] 또는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]이다.

상기 김치 유산균을 제조 시 사용되는 배추김치는 통상적인 방법으로 제조된 것으로서, 배추를 소금에 20 내지 24시간 동안 절인 후, 상기 절인 배춧잎 사이사이에 양념장을 골고루 발라 15 내지 18 ℃에서 7 내지 10일 동안 발효시킨 것이다. 상기 양념장 또한 통상적인 방법으로 제조된 것으로서, 무, 생강, 고춧가루, 배, 양파, 쪽파, 멸치액젓, 설탕 등을 혼합한 것이다.

본 발명에 사용되는 모든 커피 생두, 예컨대 고체배지를 제조할 때 사용되는 커피 생두, 배양할 때 사용되는 커피 생두 및 배양액으로 발효되는 커피 생두 모두 아라비카종이지만 생산지의 영향이나 품종의 영향을 받지 않는다.

또한, 본 발명은 커피 생두 추출물로 배양된 유산균 배양액으로 발효된 커피의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 발효 커피의 제조방법은 (A) 커피 생두 추출물을 영양원으로 하여 생장하는 김치 유산균을 분리하는 단계; (B) 상기 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 30 내지 45 ℃에서 배양하여 배양액을 제조하는 단계; (C) 커피 생두에 상기 (B)단계에서 제조된 배양액을 첨가여 커피 생두에 배양액을 접종하는 단계; 및 (D) 상기 배양액이 접종된 커피 생두를 질소가스 하, 28 내지 32 ℃에서 5 내지 15일 동안 고체발효하는 단계를 포함한다.

먼저, 상기 (A)단계 및 (B)단계에서는 커피 생두 추출물을 영양원으로 하여 생장하는 김치 유산균을 분리한 후, 상기 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 배양하여 배양액을 제조한다.

또한, 도 1과 같은 발효기에 커피 생두를 투입한 후 순도 99.99%인 이산화탄소 가스를 주입하여 20 내지 30시간 동안 실온(23 내지 25 ℃)에서 방치하여 상기 커피 생두의 표면에 존재하는 오염된 세균을 살균하는 단계를 추가할 수 있다.

다음으로, 상기 (C)단계에서는 커피 생두에 상기 (B)단계에서 제조된 액상의 배양액을 첨가하여 커피 생두에 배양액을 접종한다. 이때, 배양액은 커피 생두의 수분 함량이 15 내지 20 중량%가 되도록 투입함으로써 발효 시 고체발효가 되도록 한다.

다음으로, 상기 (D)단계에서는 상기 발효기에 질소가스를 투입하여 배양액이 접종된 커피 생두를 질소가스 하, 28 내지 32 ℃에서 5 내지 15일 동안 발효시킨다. 상기 배양액을 접종시킨 후 6시간이 경과하면 배양액은 커피 생두에 모두 흡수되어 유동성 액체가 없는 고체발효가 이루어진다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

<제조예>

제조예 1. 커피 생두 고체배지의 제조

커피 생두를 볼밀(ball meal)로 분쇄한 후 100 ℃의 물을 이용하여 열수추출한 다음 상기 커피 생두 추출물 10 g과 건조분말한천 20 g을 1 L의 정제수에 현탁하고 121 ℃에서 15분 동안 가압멸균하였다. 상기 가압멸균된 액체를 플라스틱 페트리디쉬에 20 ml씩 분주하고 응고시켜 커피 생두 고체배지를 제조하였다.

제조예 2. 커피 생두 희석액(커피 생두 액체배지)의 제조

커피 생두를 볼밀(ball meal)로 분쇄한 후 커피 생두 분말 10 g을 1 L의 정제수에 현탁하고 121 ℃에서 15분 동안 가압멸균하였다. 상기 가압멸균된 액체를 플라스틱 페트리디쉬에 20 ml씩 분주하여 커피 생두 희석액을 제조하였다.

<실시예 1>

실시예 1. 김치 유산균 분리_커피 생두 고체배지

15 ℃에서 7일 동안 발효된 포기김치 국물을 1000배 희석하여 상기 제조예 1에서 제조된 커피 생두 고체배지에 도말한 후 30 ℃의 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 커피 생두 고체배지에서 생장된 집락을 분리하였다.

비교예 1. 김치 유산균 분리_MRS 고체배지

상기 실시예 1과 동일하게 제조하되, 고체배지로 MRS 고체배지를 사용하여 생장한 미생물 집락 50여개 중에 비교적 크기가 크고 분리가 용이한 20개 집락을 분리하였다.

<시험예 1-2>

시험예 1. 실시예 1에서 분리된 김치 유산균의 동정

김치 유산균으로부터 유전체 DNA(Genomic DNA)의 정제

상기 실시예 1에서 분리된 2종류의 집락을 멸균 식염수 1 ml에 현탁한 후 13,000xg의 원심력으로 1분간 원심분리하여 상등액을 완전히 제거한 후 배양액을 제거한 세균체에 50 mM EDTA(ethylenediamine tetraacetate) 250 mL를 첨가하여 현탁한 다음 10 mg/mL의 용균효소(lysozyme) 50 mL을 첨가하여 37 ℃에서 60분 동안 배양하고 13,000xg의 원심력으로 1분간 원심분리하여 상등액을 완전히 제거한다. 상기 효소처리한 세균체에 300 uL의 알칼리 완충용액(alkaline buffer)을 첨가하고 약 3분 동안 약하게 교반한 다음 80 ℃에서 5분 동안 반응시킨 후 반응액에 약 1.5 uL의 RNase를 첨가하여 약하게 흔들어 37 ℃에서 60분 동안 반응시켰다. 상기 반응액의 온도를 실온으로 냉각하고 100 uL의 단백질응집용 완충용액(protein precipitation buffer: GeneAll, Korea)을 첨가하여 강하게 교반한 후 5분 동안 얼음물에 담가 냉각하였다. 상기 냉각한 반응액을 14,000xg에서 3분 동안 원심분리하고 상등액을 300 uL의 이소프로판올이 담긴 EP 튜브에 옮겨 DNA가 응집되도록 하였다. 상기 응집된 DNA가 백색의 실 모양으로 나타나면 14,000xg에서 1분 동안 원심분리하여 상등액 완전히 제거하고 300 uL의 70% 에탄올을 첨가하여 불순물을 세척한 후 다시 14,000xg에서 1분 동안 원심분리 하여 DNA를 수확한다. 상기 수확한 DNA는 10 내지 15분 동안 실온에서 건조하여 에탄올을 제거하고 100 uL의 RE 완충용액(Rehydration buffer: GeneAll, Korea)을 첨가하여 최종적으로 DNA 수용액을 수확하였다.

상기 유전체 DNA로부터 16S-rDNA의 복제

상기 유전체 DNA를 주형으로 이용하여 16S-rDNA(리보솜의 16S 단위의 RNA 합성 유전자)를 PCR(polymerase chain reaction)기술을 이용하여 복제하였다. 전체 16S-rDNA를 복제하기 위해 순방향(forward)의 5'-GAGTTGGATCCTGGCTCAG-3'와 역방향(reverse)의 5'-AAGGAGGGGATCCAGCC-3'을 개시인자(primer)로 사용하였으며 반응용액(50 uL)은 2.5U Tag polymerase, 각 250 uM의 dNTP, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 40 mM KCl, 100 ng template, 50 pM primer, 및 1.5 mM MgCl₂으로 구성하였다. 반응 조건, 시간, 온도 등은 16S-rDNA의 복제를 위해 최적화된 조건(30 사이클, 주형 변성을 위하여 95 ℃에서 1분 동안 반응, 어닐링을 위하여 55 ℃에서 1분 동안 반응, DNA 연장을 위하여 72 ℃에서 2분 동안 반응)에 근거하여 Supercycle 8800(Agilent Technology, USA) PCR machine에 적용하였다. 16S-rDNA의 염기서열은 유전자분석 전문회사인 마크로젠에 의뢰하여 분석하였으며 염기서열을 기반으로 GenBank 데이타베이스에 공개된 자료를 이용하여 DNA의 염기서열과 일치하는 2종의 유산균을 확인하였다. 그리고 계통학적 분석은 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동성은 ClustalW 와 Mega 4 program을 이용하여 비교분석하였다(Thompson 등, 1994)(phylogenic tree; 도 8, 도 9).

16s-rDNA 염기서열 분석결과, 상기 2 종의 유산균은 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[서열번호 1] 및 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[서열번호 2]로 동정되었다.

상기 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주와 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주는 2014년 8월 25일에 각각 KFCC11597P 및 KFCC11598P로 수탁번호를 부여받았다.

시험예 2. 비교예 1에서 분리된 김치 유산균의 동정

상기 시험예 1과 동일한 방법으로 유산균을 동정한 결과, MRS 고체배지에서 생장한 유산균은 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 바실러스 프밀러스(Bacillus pumilus), Lysinibacillus sp ., 바실러스 스트라토스페리쿠스(Bacillus stratosphericus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), Bacillus methylotrophicus, Bacillus sp., 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), Lactobacillus fuchuensis, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 웨이셀라 김치아이(Weissella kimchii), 웨이셀라 코레엔시스(Weissella koreensis), 락토버실러스 퍼맨텀(Lactobacillus fermentum), Bacillus lichenifiormis , 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides), 류코노스톡 김치(Leuconostoc kimchi)이다.

따라서, 실시예 1과 같이 커피 생두 고체배지에서 생장하는 유산균은 일반적인 배지(MRS)에서도 생장할 수 있지만 MRS에서는 김치에서 서식하는 모든 종류의 세균이 생장할 수 있어 커피 생두 고체배지에서 생장하는 유산균만 선택적으로 분리하거나 배양하는데 유용하지 않다. 특히, 상기 비교예 1에서 분리된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)는 실시예 1에서 분리된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC, 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB와 염기서열이 상이하다.

< 실시예 2-3>

실시예 2. [기탁번호 KFCC11597P ]의 유산균 이용 배양액 + 커피 생두

상기 실시예 1에서 분리된 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P]를 상기 제조예 2에서 제조된 커피 생두 희석액으로 접종하여 30 ℃ 배양하였으며, 종균으로 사용하기 위해 5회 계대 및 확대 배양하여 배양액을 제조하였다.

한편, 발효기에 커피 생두를 넣고 밀폐한 후 가스주입구와 배출구를 모두 열어 순도 99.99%인 이산화탄소 가스를 약 10분 동안 분당 유속 1-10리터의 속도로 주입하고 가스배출구의 밸브를 폐쇄하고 압력게이지가 3기압이 되면 가스주입구의 밸브를 폐쇄하여 24시간 동안 실온에 방치함으로써 커피 생두의 표면에 오염된 세균을 살균한다. 발효기의 뚜껑을 열고 상기 배양액을 15 ml/100 g_{커피 생두}로 첨가하여 커피 생두의 수분함량이 약 16-17 중량%가 되도록 접종한 후 다시 밀폐하고 주입구와 유출구의 밸브를 이용하여 질소가스를 20분간 분당 유속 2-20리터로 주입함으로써 이산화탄소를 완전히 제거하고 밸브를 조절하여 순도 99.99%의 질소가스를 1.5기압이 되도록 조절한다. 상기 발효기의 온도를 30 ℃로 조절하고 10일 동안 배양하여 배양액으로 발효된 커피를 제조하였다.

상기 배양액을 접종 후 약 6시간이 경과하면 배양액은 커피 생두에 모두 흡수되어 유동성 액체가 없는 고체발효가 이루어진다.

실시예 3. [기탁번호 KFCC11598P ]의 유산균 이용 배양액 + 커피 생두

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 배양액을 제조 시 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]를 사용하고, 상기 배양액을 이용하여 발효된 커피를 제조하였다.

비교예 2. 발효과정 없는 커피 생두

무처리된 커피 생두를 준비하였다.

비교예 3. 세균으로 발효된 커피 생두

발효기에 커피 생두 및 동량의 멸균 증류수를 넣고 밀폐한 후 질소가스를 20분간 분당 유속 2-20리터로 주입하여 순도 99.99%의 질소가스를 1.5기압이 되도록 조절한 다음 발효기의 온도를 30 ℃로 조절하고 10일 동안 배양하여 커피 생두 표면에 존재하는 세균으로 발효된 커피를 제조하였다.

비교예 4. 르왁

인도네시아산 코피르왁(kopi luwak)을 준비하였다.

< 시험예 3-7>

시험예 3. 발효 커피의 외관 특성

도 2는 본 발명의 실시예 2 및 3, 비교예 2 및 3에서 제조된 발효 커피의 외관을 촬영한 사진이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 2 및 3의 발효된 커피(도 2C, 도 2D)는 약 15 중량%의 수분을 함유하고 있어 크기가 크고 밝은 갈색을 띠지만, 비교예 2의 커피(도 2A)는 크기가 작고 녹색을 띠며 비교예 3의 커피(도 2B)는 크기가 크고 녹색을 띠는 것을 확인하였다.

이와 같이, 커피의 색상이 다르다는 것은 커피에 포함된 유기물질을 이용하여 생장하는 미생물이 커피의 화학적 특성을 변화시킨 것을 의미한다.

시험예 4. 발효 커피에서 생장한 유산균의 특성

TGGE 기술을 이용한 발효 커피의 세균 군집 분석

실시예 2, 실시예 3 및 비교예 3에서 제조된 발효 커피 생두 30알을 무균적으로 20 mL의 멸균 생리식염수에 넣고 4 ℃에서 200 rpm의 속도로 30분 동안 진탕하였다. 발효된 커피 생두로부터 분리된 세균의 현탁액은 멸균된 원심분리튜브에 옮겨 5,000xg의 원심력으로 30분간 원심분리하였다. 원심분리튜브로부터 상등액을 제거하고 침전된 세균은 상기 시험예 1과 같은 방법으로 유전체 DNA를 추출하였다. 시험예 1의 복제 방법과 같이 추출한 유전체 DNA를 주형으로 16S-rDNA를 PCR을 이용하여 복제하고 상기 16S-rDNA를 주형으로 16S-rDNA의 가변영역을 복제하였다. 순방향 프라이머로 341f 5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'(진정세균, V3 영역)을 역방향 프라이머로 518r 5'-ATTACCGCGGCTGC-TGG-3'(유니버셜, V3 영역)를 사용하였다. 복제한 16S-rDNA 가변영역은 고체배지에서 생장한 다양한 종의 세균으로부터 유래한 복합 DNA로 구성되어 있어 각 종의 세균으로부터 유래한 DNA는 온도구배전기영동(thermal gradient gel electrophoresis: TGGE) 기술을 이용하여 분리하였다.

TGGE를 위하여 복제한 16S-rDNA의 가변영역 forward primer(341f)에 GC클램프(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG-GCCTACGGGAGGCAGCAG-3')를 부착하였다. PCR 조건은 16S-rDNA를 복제할 때와 동일하였으나 annealing을 위한 온도조건을 55 ℃에서 53 ℃로 변경하였다. TGGE 시스템(Bio-Rad, DcodeTM, Universal Mutation Detection System, USA)은 제조업체의 설명서에 따라 가동하였다. GC clamp가 부착된 PCR 산물(45 uL)은 온도 기울기 30 내지 52 ℃를 적용하여 아크릴아미드 8%, 요소 8 M, 포름아미드 20%로 구성된 겔에서 100V 정전압과 1.5 배 TAE 완충액으로 12.5시간 동안 전기영동하고 이어서 40V에서 0.5시간 동안 전기영동 하였다. 한편, 전기영동하기 전에 겔을 30~45분 동안 온도 기울기와 평형을 유지하게 하였다.

DNA 염기서열을 이용한 세균동정

TGGE 젤에서 분리된 각 DNA 밴드는 젤과 함께 절단하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 정제용 도구(Accuprep, Bioneer, Korea)를 사용하여 젤 성분과 불순물을 제거하였고 341f와 518r primer를 이용하여 복제하였다. 복제한 16S-rDNA의 가변영역의 염기서열(약 200 bp)은 유전자은행자료시스템 (GenBank database system)에서 공개한 염기서열과 비교하여 동질성을 결정하였다. 김치발효과정에서 작용한 세균 가운데 MRS 고체배지 또는 커피생두고체배지에서 생장한 세균의 속 또는 종은 16S-rDNA의 전체 염기서열(약 1,500 bp)의 동질성에 근거하여 결정하였다.

상기와 같은 방법으로 측정한 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 3에서 제조된 발효 커피에서 생장한 미생물은 실시예 2에서 5종, 실시예 3에서 3종, 비교예 3에서 11종의 미생물이 확인되었다. 특히, 실시예 2 및 실시예 3에서 확인된 미생물은 대부분 또는 모두 유산균이었으나, 비교예 3에서 확인된 미생물은 대부분 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 오염균이었다.

따라서, 실시예 2 및 실시예 3에서 제조된 발효 커피 생두는 유산균이 커피 생두에 포함된 영양분을 소비하면서 오염균의 생장을 억제하는 기능이 있다는 것을 확인하였다. 이때 검출된 오염균(도 3에서 실시예 2의 5번 및 실시예 3의 3번)은 이산화탄소로 살균 시 포자상태로 생존하였기 때문에 검출된 것으로 사료된다.

도 3에 기재된 번호에 따른 미생물 종은 하기 [표 1]에 나타내었다.

밴드 번호	실시예 2	실시예 3	비교예 3
1	Leuconostoc sp.	Weissella cibaria	Leuconostoc sp.
2	Leuconostoc holzapfelii	Uncultured Weissella sp.	Uncultured bacterium
3	Uncultured Leuconostoc sp.	Bacillus licheniformis	Bacillus sp.
4	Uncultured Leuconostoc sp.	-	Uncultured bacterium
5	Bacillus licheniformis	-	Bacillus circulans
6	-	-	Bacillus flexus
7	-	-	Bacillus aryabhattai
8	-	-	Uncultured bacterium
9	-	-	Uncultured Bacillus sp
10	-	-	Weissella cibaria
11	-	-	Uncultured bacterium

시험예 5. 수용성 물질 측정

실시예 2 및 3, 비교예 2 및 3에서 제조된 발효 커피를 각각 175 ℃에서 30분 195 ℃에서 60분 동안 열처리한 후 커피 전용 분쇄기로 3분 동안 처리하여 분말화하였다. 상기 커피 분말은 동일하게 1.0 g을 취하여 25.0 g의 3차 증류수와 혼합하여 밀봉한 후 100 ℃에서 10분간 중탕 추출하였다. 상기 추출한 커피는 자외선 검출기를 장착한 HPLC(Delivery pump, UV730 detector, 영린기기)를 이용하여 분석하였다. HPLC 컬럼은 Ultra C18(5 mm, 250x4.6 mm, Restek)를 적용하였고, 10 mM 인산을 포함하는 40% 메탄올 용액을 적용하였으며, 자외선 검출기의 흡수파장은 270, 300, 330 nm를 선택하였다.

상기 270 nm의 흡수파장은 카페인에 의해 선택적으로 흡수되고, 300 nm와 330 nm의 흡수파장은 당, 유기산, 미네랄 등에 의해 흡수되지 않고 커피에 포함된 자외선 감응성의 수용성 물질과 반응하기 때문에 물질의 정성적인 특성을 확인할 수 없지만 발효균의 차이에 따른 수용성 물질의 변화는 비교할 수 있다. 실험적으로 확인된 특정 자외선 파장을 흡수하는 물질은 방향족 아미노산(280 nm), 핵산(260 nm), NADH(340 nm), 카페인(270 nm) 등이 있는데 이들은 공통적으로 분자 내에 방향족 또는 이중결합 고리형 구조를 포함하고 있어 본 연구에서 적용한 270-330 nm의 파장에서는 일반적인 대사산물이나 식물에 포함된 물질(유기산, 당, 지방산) 등은 검출되지 않는다. 반면, 폴리페놀, 플라보놀, 비타민 등은 270-330 nm의 파장에서 검출될 가능성이 있다.

도 4는 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 발효 커피를 HPLC로 측정한 그래프이다. 이때 자외선 검출기의 흡수파장은 270 nm이다.

도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 및 비교예 3의 커피 추출물을 270 nm의 자외선 검출기 흡수파장으로 측정한 결과, 4개의 그래프에서 변화가 발견되지 않았다. 따라서, 4개의 커피 추출물 모두 카페인의 농도가 변하지 않은 것을 확인하였다.

도 5 및 도 6은 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 발효 커피를 HPLC로 측정한 그래프이다. 이때 자외선 검출기의 흡수파장은 각각 300 nm 및 330 nm이다.

도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 및 비교예 3의 커피 추출물을 각각 300 nm 및 330 nm의 자외선 검출기 흡수파장으로 측정한 결과, 4개의 그래프에서 변화가 발견되지 않았다. 따라서, 4개의 커피 추출물 모두 수용성 물질의 차이가 없는 것을 확인하였다.

이와 같은 결과는 무처리(비교예 2)된 커피와 비교하여 유산균을 이용한 발효(실시예 2 및 3), 및 세균 발효(비교예 3) 시에 커피에 포함된 다양한 기능성 물질이 분해되지 않고 당, 유기산, 아미노산 등의 영양물질만 변화되었을 가능성을 나타낸다.

시험예 6. 휘발성 유기 물질 측정

실시예 2 및 3, 비교예 2 및 3에서 제조된 발효 커피를 상기 시험예 5와 동일한 방법으로 추출한 후 추출한 커피를 GLC(Gas-Liquid Chromatography, 영린기기)로 분석하여 휘발성 유기 물질을 분석하였다.

도 7은 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 및 비교예 3에서 제조된 발효 커피를 GLC로 측정한 그래프이다.

도 7에 도시된 바와 같이, 실시예 2 및 실시예 3의 발효 커피는 비교예 2 및 비교예 3에 비하여 휘발성 유기 물질의 종류 및 농도가 상당히 다른 것을 확인하였다.

이와 같이, 실시예 2 및 실시예 3이 비교예 2 및 비교예 3에 비하여 휘발성 유기 물질의 종류와 농도 면에서 차이가 발생하지만, 수용성 물질의 종류와 농도 면에서는 차이가 발생하지 않는 것은 유산균을 이용한 커피의 발효(실시예 2 및 실시예 3)가 커피에 포함된 성분과 성상에 영향을 주지 않으면서 커피의 풍미를 변화시킬 수 있는 유용한 방법이 될 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 예컨대, 유산균을 이용한 커피의 고체발효는 커피의 본질을 손상시키지 않으면서 단일 종류의 원두로부터 다양한 맛의 커피를 생산할 수 있는 유용한 방법인 것이다.

시험예 7. 관능 검사

실시예 및 비교예에서 제조된 발효 커피를 전문패널 12명에게 시식하게 한 후 5점 척도법(정도가 클수록 7점에 가까움)으로 관능검사를 실시하여 평균값을 구하였으며, 이를 하기 [표 2]에 나타내었다.

-고소함, 신맛, 종합적인 기호도 : 1=매우 나쁘다, 5점=매우 좋다

-쓴맛, 이미, 이취: 1=매우 약하다, 5점=매우 강하다

구분	실시예 2	실시예 3	비교예 2	비교예 3	비교예 4
고소함	4.39±0.37	4.41±0.29	4.36±0.18	2.56±0.24	4.51±0.11
쓴맛	3.55±0.28	3.45±0.34	4.61±0.34	4.85±0.31	3.02±0.17
신맛	4.12±0.34	4.25±0.49	3.23±0.25	2.14±0.36	4.34±0.24
이미	1.45±0.43	1.37±0.21	2.98±0.24	4.35±0.34	1.24±0.19
이취	1.52±0.27	1.20±0.18	2.81±0.38	4.55±0.27	1.06±0.20
종합적인 기호도	4.370.15	4.540.21	3.190.41	2.450.19	4.690.14

위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 2 및 3에 따라 제조된 발효 커피는 비교예 2 및 3에 비하여 고소함, 신맛, 쓴맛, 이미, 이취 및 종합적인 기호도 모두 우수한 것을 확인하였다. 목넘김이 좋고 부드러운 커피는 신맛이 약간 강한 커피이므로 신맛이 보다 강한 실시예 2 및 3이 비교예에 비하여 목넘김이 좋고 부드럽다.

한편, 르왁 커피인 비교예 4는 실시예 2 및 3과 거의 유사한 관능성을 보이는 것을 확인하였다.

한국미생물보존센터 KFCC11597P,KFCC11598P 20140825

<110> PARK, doo hyun <120> Coffee fermented with lactic acid cultured from coffee beans extract and preparation method thereof <130> HPC5334 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1120 <212> RNA <213> Leuconostoc holzapfelii KB <400> 1 aaagggggac ggcgctatct gtgtctcgtg cgcgcgaaag tggtgccggc acccttgttt 60 ccagtggcga acgggtgagt aacacgtgga taacctgcct caaggctggg gataacattt 120 ggaaacagat gctaataccg aataaaactt agtatcgcat gatatcaagt taaaaggcgc 180 tacggcgtca cctagagatg gatccgcggt gcattagtta gttggtgggg taaaggctta 240 ccaagacgat gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg ccacattggg actgagacac 300 ggcccaaact cctacgggag gctgcagtag ggaatcttcc acaatgggcg caagcctgat 360 ggagcaacgc cgcgtgtgtg atgaaggctt tcgggtcgta aagcactgtt gtatgggaag 420 aaatgctaaa atagggaatg attttagttt gacggtacca taccagaaag ggacggctaa 480 atacgtgcca gcagccgcgg taatacgtat gtcccgagcg ttatccggat ttattgggcg 540 taaagcgagc gcagacggtt gattaagtct gatgtgaaag cccggagctc aactccggaa 600 tggcattgga aactggttaa cttgagtgtt gtagaggtaa gtggaactcc atgtgtagcg 660 gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggcttact ggacaacaac 720 tgacgttgag gctcgaaagt gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacac 780 cgtaaacgat gaatactagg tgttaggagg tttccgcctc ttagtgccga agctaacgca 840 ttaagtattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 900 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960 cttgacatcc tttgaagctt ttagaagata gaagtgttct cttcggaaac aaagtgacag 1020 gtggtgcatg gtcgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg gggttaagtc ccgcaacgaa 1080 ccgcaaccct tattgttaat tgccagcatt cagttgggca 1120 <210> 2 <211> 1139 <212> RNA <213> Weissella cibaria KC <400> 2 gggaaaaggg atagcctcga gctgtttcgt gagcggtgtc ggtgtaaccc caaccctttt 60 gctcggacgc gacaattttt attgcagaga gtggctaacg ggtgagtaac acgtgggaaa 120 cctacctctt agcaggggat aacatttgga aacagatgct aataccgtat aacaatagca 180 accgcatggt tgctacttaa aagatggttc tgctatcact aagagatggt cccgcggtgc 240 attagttagt tggtgaggta atggctcacc aagacgatga tgcatagccg agttgagaga 300 ctgatcggcc acaatgggac tgagacacgg cccatactcc tacgggaggc agcagtaggg 360 aatcttccac aatgggcgaa agcctgatgg agcaacgccg cgtgtgtgat gaagggtttc 420 ggctcgtaaa acactgttgt aagagaagaa tgacattgag agtaactgtt caatgtgtga 480 cggtatctta ccagaaagga acggctaaat acgtgccagc agccgcggta atacgtatgt 540 tccaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc agacggttat ttaagtctga 600 agtgaaagcc ctcagctcaa ctgaggaatt gctttggaaa ctggatgact tgagtgcagt 660 agaggaaagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag 720 tggcgaaggc ggctttctgg actgtaactg acgttgaggc tcgaaagtgt gggtagcaaa 780 caggattaga taccctggta gtccacaccg taaacgatga gtgctaggtg tttgagggtt 840 tccgccctta agtgccgcag ctaacgcatt aagcactccg cccgggggag tacgaccgca 900 aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaaac cggtggacca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaaaaac cttaccaggg tcttgacatc cctttgacaa ctccgaaaga 1020 tggaaccttt cccttcgggg aacagatgga caggctagtc catgggtagt cgtcaagctc 1080 gtgtcattag aatatttgga ttaaattccc gaaaaggaac gggagccttt tatgaaaag 1139

Claims (13)

1. (A) 커피 생두 추출물을 영양원으로 하는 배지에 김치국물을 도말한 후 배양시켜 생장된 김치 유산균을 분리하는 단계;
   (B) 상기 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 30 내지 45 ℃에서 배양하여 배양액을 제조하는 단계;
   (C) 커피 생두의 수분함량이 15 내지 20 중량%가 되도록 커피 생두에 상기 (B)단계에서 제조된 배양액을 접종하는 단계; 및
   (D) 상기 배양액이 접종된 커피 생두를 질소가스 하, 28 내지 32 ℃에서 5 내지 15일 동안 고체발효하는 단계;를 포함하되,
   상기 김치 유산균은 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P] 또는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]인 것을 특징으로 하는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피의 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 (A) 단계에서의 커피 생두 추출물은 90 내지 120 ℃에서 열수추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 (A) 단계에서의 김치 유산균은
   상기 커피 생두 추출물 및 한천을 이용하여 커피 생두 고체배지를 제조하는 단계;
   15 내지 18 ℃에서 7 내지 10일 동안 발효시킨 배추김치 국물을 희석하여 상기 커피 생두 고체배지에 도말하는 단계; 및
   상기 배추김치 국물이 도말된 커피 생두 고체배지를 28 내지 32 ℃에서 45 내지 50시간 동안 배양하는 단계;를 포함하여 제조된 것을 특징으로 하는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 (C)단계 이전에 상기 커피 생두를 이산화탄소 가스 하에서 20 내지 30시간 동안 방치하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피의 제조방법.
6. 삭제
7. 커피 생두 추출물을 영양원으로 포함하는 배지에 김치국물을 도말하여 생장한 김치 유산균 및 커피 생두 희석액을 배양한 배양액을 커피 생두에 접종시켜 고체 발효하되,
   상기 김치 유산균은 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii) KB 균주[기탁번호 KFCC11597P] 또는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) KC 균주[기탁번호 KFCC11598P]이며, 상기 배양액에 접종된 커피 생두의 수분함량은 15 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피.
8. 삭제
9. 제7항에 있어서, 상기 커피 생두 추출물은 90 내지 120 ℃에서 열수추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피.
10. 제7항에 있어서, 상기 김치 유산균은
    상기 커피 생두 추출물 및 한천을 이용하여 커피 생두 고체배지를 제조하는 단계;
    15 내지 18 ℃에서 7 내지 10일 동안 발효시킨 배추김치 국물을 희석하여 상기 커피 생두 고체배지에 도말하는 단계; 및
    상기 배추김치 국물이 도말된 커피 생두 고체배지를 28 내지 32 ℃에서 45 내지 50시간 동안 배양하는 단계;를 포함하여 제조된 것을 특징으로 하는 커피 생두 추출물로 배양된 유산균으로 발효된 커피.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

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