KR101080322B1

KR101080322B1 - 신규한 초산균

Info

Publication number: KR101080322B1
Application number: KR1020100017370A
Authority: KR
Inventors: 장재권; 박영서; 최영진; 정명수; 박훈; 심건섭
Original assignee: 경원대학교 산학협력단; 청강문화산업대학 산학협력단; 주식회사 그린바이오; 이화여자대학교 산학협력단; 선문대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2011-11-08
Also published as: KR20110097500A

Abstract

본 발명은 복숭아로부터 분리되고 초산 생성능(acetic acid production activity)이 우수한 미생물, 구체적으로 복숭아로부터 분리되고, 초산 생성능이 우수하며, 양파 착즙액을 발효하여, 사과산(malic acid), 구연산(citric acid) 및 숙신산(succinic acid)을 생성할 수 있고, 양파 착즙액으로부터 초산을 생성할 수 있는 능력이 매우 우수하며, 생성된 양파 초산발효액에 항암활성 및 혈전생성 억제능을 강화시킬 수 있는 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis)에 관한 것이다.
본 발명의 미생물은 양파 착즙액에 대한 초산 생성능이 우수할 뿐만 아니라, 상기 미생물에 의해 생성된 양파 초산발효액에 항암활성 및 혈전생성 억제능을 강화시킬 수 있으므로, 상기 미생물은 양파를 이용한 고기능성 음료의 제조를 포함한 양파와 관련된 다양한 산업분야에 이용될 수 있다.

Description

신규한 초산균{A NOVEL ACETIC ACID BACTERIUM}

본 발명은 복숭아로부터 분리되고 양파 착즙액의 초산 생성능(acetic acid production activity)이 우수한 미생물에 관한 것이다.

양파(Allium cepa L.)는 외떡잎식물 백합목 백합과에 속하는 다년초로서, 양파는 비교적 냉한 기후에 적합한 작물로 연작이 가능한 채소이다.

양파는 오랜 재배역사를 가지고 있고, 향기성분의 특성으로 인하여 고추, 마늘 등과 더불어 전 세계적으로 많이 이용되고 있는 조미 채소 중의 하나이다. 양파의 독특한 냄새는 육류의 좋지 못한 냄새나 맛을 제거하는데 효과적일 뿐만 아니라 방부효과도 있는 것으로 알려져 주로 고기 등의 요리에 향신료로 사용되고 있다. 또한, 영양학적으로 양파에는 각종 비타민과 함께 칼슘 및 인산 등의 무기질이 들어 있는 것으로 알려져 있다.

양파는 우리나라에서는 주로 남부지방에서 생산되며, 대부분 5월 내지 7월 사이에 생산된다. 수확된 양파는 주로 저온고에 저장되었다가, 수요량이 많은 시기에 출하하는데, 일부는 절임용 또는 건조가공용 등으로 소비되나, 생산량의 약 90% 이상이 생채로 저온 저장되었다가 출하된다. 국내의 양파 생산량은 1990년 이후 꾸준히 증가 추세에 있으며, 2005년 전국 생산량은 1,023,000톤으로 마늘 생산량의 약 2배 정도를 차지하고 있다.

현재까지 양파의 생리활성에 관한 연구는 상당이 많이 이루어져 동물실험을 통하여 심혈관계 질환 예방, 혈전증 치료에 관한 효과, 혈당 저하효과, 항산화 효과 및 납 독성의 해독효과, 항균 효과, 항암 효과, 항산화 및 중금속 제거 효과 등 다양한 생리활성기능에 관한 연구들이 보고되어 있다. 상기 다양한 생리활성기능에 관한 연구에 의해 양파는 소비자들에게 있어서 건강기능성 소재로 인식되어 가고 있다.

양파는 대부분 삶거나 볶아서 향신료 및 조미용으로 각종 요리에 사용되며, 압출스낵, 조미액, 스프 등의 가공식으로도 이용되고 있다. 그러나 양파는 저장성이 낮아 저장 중 조직의 부패, 연화 등으로 인하여 전체 생산량의 10 내지 20%가 상품적 가치를 상실하여 퇴비로 이용되거나 버려지고 있다. 또한, 양파는 양파세포가 파괴되었을 때 생성되는 allinase라는 효소는 비휘발성의 냄새가 없는 전구물질에 작용하여 황을 함유한 많은 휘발성 화합물 등을 생성함으로써 냄새가 너무 강하여 식품가공산업에서 선호도가 낮은 편이다.

저장성이 낮은 양파의 저장성 향상 기술과 가공기술에 관한 연구도 일부 이루어져 양파의 분말화를 위해 여러 가지의 건조 공정이 적용되었으며, 방사선 처리나 훈증 처리를 통해 저장성을 향상시키려는 시도도 있었으나, 아직까지 만족할만한 높은 저장성을 확보하지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 양파의 소비를 증진시키기 위해서 소비자가 쉽게 섭취할 수 있는 가공식품의 형태로 이용하는 방법에 대한 개발이 요구된다.

이러한 요구에 따라, 양파의 새로운 이용방법 및 제품에 대한 연구가 진행되고 있다. 현재까지 진행된 양파에 관한 제품 연구로는 양파스낵 제조에 관한 연구, 건조 양파 착즙박과 건조 양파를 이용한 압출스낵의 물리적 특성에 관한 연구를 바탕으로 양파 착즙박과 양파를 이용한 압출스낵을 제조하기 위한 연구, 양파로부터 퀘르세틴(quercetin)을 분리하는 기술에 대한 연구, 건조 양파의 저장 안정성에 관한 연구, 양파분말을 첨가한 식빵의 품질 특성에 관한 연구 및 양파를 첨가한 딸기잼의 품질 특성에 관한 연구 등이 보고되어 있다.

또한, 초산균은 자연계에 널리 존재하며 에탄올을 이용하여 초산을 생산할 수 있는 미생물로, 상기 초산균은 초산을 비롯하여 TCA 순환(TCA cycle)에 관여하는 유기산을 다량 생산하고 있으므로, 상기 초산균에 의해 생성된 생성물은 체내에 젖산을 축적시키지 않고 TCA cycle을 순조롭게 진행시켜 과격한 운동이나 과로에 의한 피로회복에 좋으며, 혈액을 약 알칼리성으로 만들어 주는 작용을 한다. 대표적인 초산생산균주로는 Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus 또는 Gluconobacter oxydans등이 있으며, 상기 초산균에 대한 연구는 주로 양조식초와 관련되어 진행되어왔다.

상기 초산균을 이용한 제품은 다이어트에 효과가 있고, 과산화지질을 분해하여 동맥경화를 예방하며, 스트레스를 관리하는 부신피질 호르몬의 분비를 촉진하고, 소화 및 식욕촉진에 효능이 있다고 알려져 있으며, 혈압 강하, 피로회복 또는 칼슘 흡수 촉진 등 여러 가지 생리적 기능을 지니고 있는 것으로 보고되고 있다.

식초함유 음료의 등장으로 인하여 현재 양조식초는 조미용 범위를 넘어 건강식품으로 선호되고 있고, 이러한 추세로 식초 및 식초음료 시장규모는 점차 증가하고 있는 추세이다.

현재 양파의 국내 자급률은 100%에 이를 정도로 양파의 국내 생산량이 높아, 저장성이 낮은 양파의 소비촉진을 위해서는 다양한 양파의 이용방법이 요구되고 있는 실정이다.

따라서, 국내 소비량을 초과하여 생산될 수 있어, 그 소비촉진을 위한 새로운 이용형태의 개발이 요구되는 양파와 관련하여, 그 기능성을 강화시킬 수 있는 대안으로 이와 관련된 균주에 대한 연구 및 이를 이용한 양파를 주재료로 하는 제품에 대한 개발의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 양파의 초산 발효능, 구체적으로 양파 착즙액로부터 초산을 생성할 수 있는 초산 생성능(acetic acid production activity)이 우수하고, 양파를 발효시켜 기능성을 부가시킬 수 있는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복숭아로부터 분리되고 양파의 초산 발효능을 가진 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) 균주를 제공한다. 바람직하게는 상기 균주는 양파 착즙액의 초산 발효능이 우수하고, 양파 착즙액을 발효시켜 사과산, 구연산 및 숙신산을 생성할 수 있으며, 산 생성능이 우수한 아세토박터 트로피칼리스 균주일 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에 있어서, 발효(fermentation)이란 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미하며, 초산발효란 미생물이 유기물을 분해시키는 발효과정에서 초산이 생성되는 발효과정을 의미한다.

본 발명자들은 양파 착즙액의 초산 발효능이 우수하고, 양파를 발효시켜 기능성을 부가시킬 수 있는 미생물에 대해 연구하던 중, 초산 생성능이 우수한 아세토박터 트로피칼리스 No. 22(Acetobacter tropicalis No. 22)를 양파 착즙액에 접종하여 발효시키는 경우, 양파 착즙액의 항암 활성 및 혈전생성 억제능을 개선할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 복숭아로부터 분리되고 양파 착즙액의 초산 발효능을 가진 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) 균주, 보다 구체적으로는 신냄새가 나는 복숭아로부터 분리되고, 산 생성능을 가지며, 초산 생성능이 우수하고, 양파의 초산 발효능을 가지며, 양파를 발효시켜 사과산(malic acid), 구연산(citric acid) 및 숙신산(succinic acid)을 생성할 뿐만 아니라 상기 양파를 초산 발효시켜 생성된 초산 양파 발효물에 항암활성 및 혈전생성 억제능을 강화시킬 수 있는 아세토박터 트로피칼리스 No. 22(Acetobacter tropicalis No. 22)에 관한 것이다.

상기 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22(Acetobacter tropicalis No. 22)는 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221번지 유림빌딩 2층에 위치한 한국미생물보존센터에 2009년 12월 18일자로 기탁하여, 수탁번호 KFCC 11476P를 부여 받았다.

상기 아세토박터 트로피칼리스 균주는 구체적으로 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22, 더욱 구체적으로는 초산 생성능이 우수하며, 양파 착즙액을 발효하여, 사과산(malic acid), 구연산(citric acid) 및 숙신산(succinic acid)을 생성할 뿐만 아니라 생성된 양파 초산발효액에 항암활성 및 혈전생성 억제능을 강화시킬 수 있고, 기탁번호 KFCC 11476P를 갖는 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis KFCC 11476P)일 수 있다.

상기 균주는 상기 균주를 이용하여 제조된 양파 발효액, 구체적으로 양파 착즙액의 발효액에 항암활성 및 혈전생성 억제능과 같은 생리활성을 부가하거나 이를 강화시킬 수 있으며, 구체적으로는 하기와 같은 균학적 성질을 갖는 균주이다.

보다 구체적으로, 상기 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22는 운동성이 없는 그람 음성(Gram-negative)의 간균으로, 포자염색에서 음성반응을 나타낸 무포자 균이고, catalase 활성도 양성 반응을 나타내었으며, decarboxylase test, MR test, VP test, oxidase test, indole test 및 gelatin test에서 모두 음성반응을 나타내는 초산균이다.

상기 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22는 16S rRNA 염기서열 분석결과 공시균주인 아세토박터 트로피칼리스 LMG 1663 및 아세토박터 트로피칼리스 NRIC 0312 isolate No. 39와 98%의 높은 상동성을 나타내어, 아세토박터 트로피칼리스로 동정되었다.

또한, 본 발명인 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22는 양파를 발효시켜, 구체적으로 양파 착즙액을 발효시켜 양파 착즙액으로부터 초산을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 사과산(malic acid), 구연산(citric acid) 및 숙신산(succinic acid)을 생성할 수 있고, 옥살산(oxalic acid) 및 주석산(tartaric acid)도 생성할 수 있다.

또한, 상기 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22의 최적 산 생성 조건 즉 최적 반응 조건은 초기 에탄올 농도의 측면에서는 초기 에탄올 농도가 4%(v/v)인 것이 최적 산 생성 조건이고, 초기 glucose 농도의 측면에서는 초기 glucose 농도가 2.5%인 것이 최적 산 생성 조건인 균주이다.

본 발명의 균주는 초산 생성능이 우수하고, 양파로부터 초산을 비롯한 다양한 유기산을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 균주를 이용하여 제조된 양파 발효물은 항암 활성 및 혈전생성 억제능이 현저하게 개선시킬 수 있다.

상기 양파는 바람직하게는 양파 착즙액일 수 있으며, 상기 착즙액이란 물기가 들어있는 물체, 구체적으로 양파로부터 압착 등과 같은 방법으로 즙을 짜내 제조한 액을 의미한다. 구체적으로 상기 양파 착즙액은 양파를 녹즙기와 같은 착즙기로 갈아서 제조한 것일 수 있고, 원심분리 또는 여과의 과정을 통해 불용물을 제거하는 과정을 추가로 수행하여 제조된 것일 수 있다.

상기 항암 활성 및 혈전생성 억제능의 개선과 관련하여, 본 발명의 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22(Acetobacter tropicalis No. 22)는 상기 양파 착즙액에 대한 발효 과정을 수행하면서, 양파 착즙액의 항암 활성을 강화시킬 뿐만 아니라, 혈전생성 억제능이 인정되지 않던 양파 착즙액에 상기 혈전생성 억제능을 부여할 수 있다.

따라서, 상기 균주는 양파식초를 포함한 양파를 이용한 다양한 발효식품의 제조에 사용될 수 있으며, 양파 발효 음료를 포함한 양파 발효물 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있을 것으로 평가된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22(Acetobacter tropicalis No. 22)는 양파의 발효능이 우수하고, 초산생성능이 뛰어나며, 양파로부터 초산을 비롯한 다양한 유기산, 구체적으로 사과산, 구연산, 숙신산, 옥살산 및 주석산을 생성할 수 있고, 상기 아세토박터 트로피칼리스 균주 No. 22에 의해 발효된 양파 발효물의 경우 항암활성 및 혈전생성 억제능이 현저하게 개선될 수 있다는 것이 확인되어, 고기능성 및 고품질의 우수한 양파 발효 음료를 제조하기 위한 종균으로 사용될 수 있을 것이므로, 양파를 이용한 고기능성 음료의 제조를 포함한 양파와 관련된 다양한 제품의 생산에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 국내에서 생산되는 농산물을 이용한 건강식품시장의 활성화와 우리나라 농산물의 새로운 수요 창출 및 고부가가치화를 유도한다는 점에서 산업적 이용가치가 매우 크다할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) No. 22의 16S rRNA의 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) No. 22의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 에탄올농도에 따른 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) No. 22의 배양배지의 산도변화를 나타내는 그래프이다. 상기 도 3에서 *는 초기 에탄올 농도가 3%인 것을 의미하고, ●는 초기 에탄올 농도가 4%인 것을 의미하며, ▲는 초기 에탄올 농도가 5%인 것을 의미하고, ◆는 초기 에탄올 농도가 6%인 것을 의미하며, ■는 초기 에탄올 농도가 7%인 것을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) No. 22를 이용하여 양파 착즙액을 발효시켜 발효액을 제조함에 있어서, 초기 초산농도가 미치는 영향을 나타낸 것으로, 상기 도 4a는 배양기간에 따른 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) No. 22의 생육도를 나타낸 그래프이고, 상기 도 4b는 발효기간에 따른 발효액의 산도 변화를 나타낸 그래프로, ● 및 ○는 초기 초산농도가 0%인 것을 의미하고, ◆ 및 ◇는 초기 초산농도가 1%인 것을 의미하며, ▲ 및 △는 초기 초산농도가 2%인 것을 의미하고, ■ 및 □는 초기 초산농도가 3%인 것을 의미하며, *는 초기 초산농도가 4%인 것을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) No. 22를 이용하여 양파 착즙액을 발효시켜 발효액을 제조함에 있어서, 초기 글루코스(glucose) 농도가 미치는 영향을 나타낸 것으로, 상기 도 5a는 초기 글루코스 농도 별 배양기간에 따른 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis) No. 22의 생육도를 나타낸 그래프이고, 상기 도 5b는 초기 글루코스 농도 별 발효기간에 따른 발효액의 산도 변화를 나타낸 그래프로, 도면에 표시된 수치는 글루코스 농도(w/v)를 의미한다.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것일 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 초산균주의 분리 및 동정

1-1 초산균주의 분리

낙과 복숭아를 밀폐용기 안에 넣고 30℃에서 5일간 보관하면서 신 냄새가 나는 시기에 낙과 복숭아 액을 취하여 10진 희석법(serial dilution)에 의해 희석하여 CaCO₃가 1% 함유되어 있는 YCE 아가배지(glucose 3g, beef extract 1g, ethanol 4 ml, CaCO₃ 1g, agar 1.5g 및 증류수 88.3 ml)에 도말하였다. 상기 도말한 아가배지(agar plate)는 30℃에서 3일간 배양한 다음, 투명환을 형성한 균주를 분리하여, 총 23주의 초산균을 분리하였다. 상기 분리된 23주의 균주 중에서, 투명환이 큰 10주를 선정하여, GYP 배지(glucose 1.5g, Peptone 0.3g, Yeast extract 0.2g, ethanol 3ml, Acetic acid 1g 및 증류수 94 ml)에 접종한 후, 30℃에서 8일간 진탕배양하면서, 생육도와 초산생성능을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

균주 번호	OD_660nm	Acidity(%)	pH
No. 1	0.334	3.73	1.8
No. 2	0.000	1.07	2.4
No. 3	0.257	3.80	1.9
No. 6	0.274	3.54	2.1
No. 7	0.280	3.76	1.9
No. 10	0.301	3.26	1.9
No. 16	0.194	3.38	1.8
No. 20	ND	1.15	2.4
No. 22	0.303	3.88	1.9
No. 27	0.264	3.83	1.9

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 산 생성능이 가장 우수하여, 양파 착즙액의 초산 발효능이 우수할 것으로 예상되는, No 22.의 균주가 가장 바람직한 것으로 확인되었고, No 27.의 균주도 상기 No 22.의 균주와 유사한 정도의 초산 발효능을 갖는 것으로 확인되었다. 한편, 상기 No 27.의 균주는 최종적으로 Gluconobacter cerinus로 동정되어, Acetobacter tropicalis의 균주 중에서는 상기 No 22.의 균주가 초산 발효능이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

상기 No 22. 균주에 대하여 형태학적 분석, 보다 구체적으로 광학현미경을 통한 형태의 분석, 그람 염색(Gram stain kit BD Co., USA), 운동성 시험, 카탈라아제 시험(Biomrieux Co., France), 포자 염색, decarboxylase 시험, MR 시험, VP 시험, oxidase 시험, indole 시험 및 gelatin 시험을 수행하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

특 성	No.22
Source	복숭아
형태(Morphology, Shape)	간균
그람염색(Gram-stain) 여부	그람음성
운동성 시험	-
카탈라아제 시험(catalase test)	+
포자염색	-
디카복시라아제 시험(decarboxylase test)	-
MR 시험	-
VP 시험	-
옥시다아제 시험(oxidase test)	-
인돌 시험(indole test)	-
젤라틴 시험(gelatin test)	-

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 No 22. 균주는 간균이고, 그람음성이며, 운동성은 없고, 포자염색에서는 음성반응으로 무포자균으로 확인되었다. 또한, 카탈라아제 시험에서 양성 반응을 나타내었다. 또한, decarboxylase test, MR test, VP test, oxidase test, indole test 및 gelatin test에서 모두 음성반응을 나타내어, 잠정적으로 초산균(Acetobacter spp.)의 특성을 지니고 있는 것으로 확인되었다.

1-2 초산균주의 동정

상기 실시예 1-1에서 잠정적으로 초산균으로 분리된 No 22. 균주의 분자유전학적 특성에 의한 동정을 위해 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후 분석하였다.

구체적으로, 분리균주의 16S rRNA 유전자를 추출한 후, 하기 표 3에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하여, 상기 분리균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하였다.

Primers	서열 (5′→3′)
8F	AGAGTTTGATCATGGCTCAG
15R	AAGGAGGTGATCCAACCGCA

상기 PCR은 AccuPower^®PreMix(Bioneer, 대한민국)를 사용하여, PCR sprint(Hybaid Ltd., 영국)로 반응시켰다. PCR 조건은 하기 표 4와 같은 조건으로 수행하였다.

		온도	시간	Cycle
1^st Denaturation		94℃	2 분	1 Cycle
Amplification	2^nd Denaturation	94℃	30 초		35 Cycle
	Annealing	60℃	1분
	Extension	72℃	1분	go to 2^nd Denaturation
Final Extension		72℃	7 분	1 Cycle

상기 PCR 수행 산물은 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동으로 확인하였고, 상기 아가로스 겔로부터 DNA 단편의 회수는 AccuPrep^®Gel Purification Kit(Bioneer, 대한민국)를 사용하여, 제작사의 매뉴얼(manual)에 따라 수행하였다.

상기 PCR 산물의 염기서열 결정은 Applied Biosystem사(USA)의 ABI PRISM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Kit를 사용하여, MJ Reserch사(Reno, USA)의 PTC-225 Peltier Thermal Cycler와 ABI PRISM 3730 XL Analyzer를 이용하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.

또한, DNA 염기서열의 분석은 InfoMax Inc.(USA)의 Vector NTI Suite 7.1 program을 사용하여 수행하였으며, DNA의 염기서열의 homology 분석은 BLASTN online program(http://www.ncbi.nih.gov/blast/)을 이용하였다.

상기 분석결과에 따른 계통분석도(Phylogenetic tree)는 MEGA4 program(Center for Evolutionary Functional Genomics, The Biodesign Institute, USA)을 이용하여 작성하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 초산 생성능이 가장 우수한 분리균주 No. 22의 경우 Acetobacter tropicalis LMG 1663 및 Acetobacter tropicalis NRIC 0312 isolate No. 39의 16S rRNA 유전자의 염기서열과 각각 98%의 높은 상동성을 나타내어, 상기 No. 22 균주는 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis)로 최종 동정되었다.

상기한 바와 같이, 도 2는 분리균주 No. 22의 경우 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis)로 최종 동정되었다는 것을 나타내며, 그 결과 No. 22를 아세토박터 트로피칼리스 No. 22로 명명하였고, 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221번지 유림빌딩 2층에 위치한 한국미생물보존센터에 2009년 12월 18일자로 기탁하여, 수탁번호 KFCC 11476P를 부여받았다.

1-3 초기 에탄올 농도에 따른 초산 생성능

상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22를 상기 실시예 1-1의 GYP 배지에서 진탕배양기를 이용하여 160 rpm 및 30℃의 조건으로 3일간 생육시켜 배양액을 제조하였다. 상기 배양액을 최종농도가 3%가 되도록 GYP 배지에 첨가한 후, 2일 간격으로 배양액 10ml를 취하고, 상기 배양액에 에탄올의 농도(v/v)가 3%, 4%, 5% 및 6%가 되도록 에탄올을 첨가한 후, 30℃에서 10일간 배양하였다. 상기 배양에 의한 배양액의 산도를 도 3에 나타내었다. 본 실시예에서 산도란 아세트산을 중화시키기 위한 적정 산도(titratable acidity, %)로 10 ml의 배양액을 중화시키기 위해 사용된 0.1N NaOH(NaOH/kg 당량)의 부피(volume)로 결정된다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 초기 에탄올 농도가 3%(v/v)인 경우에 비하여 초기 에탄올 농도가 4%(v/v)인 경우에 산도가 증가하여, 현저하게 초산 생성능이 증가하는 것이 확인되었다. 한편, 초기 에탄올 농도가 5%(v/v) 및 6%(v/v)인 경우에는 오히려 산도가 낮아지는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 초기 에탄올 농도가 4%(v/v)인 경우가 최적 산 생성 조건인 것으로 확인되었다.

1-4 초기 산도에 따른 초산 생성능

상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22를 상기 실시예 1-1의 GYP 배지에 3%의 에탄올을 첨가하여 제조한 배지의 초기산도를 0%, 1%, 2%, 3% 및 4%로 각각 초산을 첨가하여 조절한 배지에 상기 실시예 1-3과 같은 방법으로 균주를 30℃에서 10일간 배양하였다. 상기 배양에 의한 균의 생육결과와 총산을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 초기 산도가 낮을수록 균의 생육이 활발하고, 최종 산 생성정도도 더 많은 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 도 4a에서 확인된 바와 같이, 초기 산도가 높을수록 균의 생육이 현저하게 감소되는 것이 확인되었다. 또한, 도 4b에서 확인된 바와 같이, 초기 산도가 높을수록 생성되는 총산함량은 민감하게 감소하였고, 배양 7일째까지는 초기산도가 1%일 때 산도가 가장 높았으나, 배양 8일째부터는 초산을 첨가하지 않은 배양군에서 최종 산도가 가장 높게 나타났으며, 10일째를 기준으로 초산을 첨가하지 않은 실험군에서 산도가 가장 높게 나와 산생성 정도가 가장 많은 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 본 발명의 균주를 이용하여 초산을 생성하는 경우, 발효대상 물질에 인위적으로 산을 첨가하지 않는 것이 가장 바람직한 것으로 확인되었다.

1-5 초기 glucose 농도에 따른 초산 생성능

상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22를 4%(v/v)의 에탄올을 첨가하고 초기 산도를 0으로 조절한 변형된 GYP 배지에 glucose 농도(w/v)를 0%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 6% 및 8%로 각각 glucose를 첨가하여 조절한 배지에 상기 실시예 1-3과 같은 방법으로 균주를 30℃에서 10일간 배양하였다. 상기 배양에 의한 균의 생육결과와 총산을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 5a에 나타낸 바와 같이, 균의 생육 정도와 관련하여, 초기 glucose 농도가 2.0% 내지 3.0%인 경우에만 5일 이전에 균의 성장이 충분히 이루어지고, 이 외의 범위에서는 5일이 경과하여 10일에 이를 때까지 균이 계속해서 성장하는 것으로 확인되었다. 균체의 빠른 증가는 효율적인 발효 특히, 제조공정 상에서 경제적 효과와 직결되는 것이므로, 상기 glucose 농도는 2.0% 내지 3.0%인 것이 바람직한 것으로 확인되었다. 특히, 상기 초기 glucose 농도가 2.5%인 경우에서는 5일 내에 균의 생육이 충분히 이루어질 뿐만 아니라, O.D. 값을 이용한 균체 수에서도 가장 우수한 것으로 확인되었다.

또한, 상기 도 5b에 나타낸 바와 같이, 균의 생육 정도와 관련하여, 초기 glucose 농도가 2.5% 내지 3.0%인 경우에만 10일 이전에 충분한 산의 생성이 이루어지고, 이 외의 범위에서는 10일이 경과하여 15일에 이를 때까지 균이 계속해서 산을 생성하는 것으로 확인되었다. 균의 산 생성은 초산 발효에 있어서, 발효 진행의 지표가 될 수 있는 것으로 산 생성이 단기간 내에 이루어진다는 점은 초산 발효의 시간이 단축될 수 있다는 것을 의미하므로, 이는 제조공정 상에서 경비 절감과 직접적으로 관련이 있다. 따라서, 상기 glucose 농도는 2.5% 내지 3.0%인 것이 바람직한 것으로 확인되었다. 특히, 상기 초기 glucose 농도가 2.5%인 경우에서는 8일 내에 충분한 산이 생성될 뿐만 아니라, 가장 산 생성이 우수했던 최고점을 기준으로 glucose가 첨가된 실험군 중에서는 가장 높은 산 생성능을 나타내어 발효조건으로 가장 우수한 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 본 발명의 균주를 이용하여 초산을 생성하는 경우, 발효대상 물질에 glucose 농도를 2.0% 내지 3.0%, 바람직하게는 2.5% 내지 3.0%, 더욱 바람직하게는 2.5%로 조절하여야 최적 조건에서 초산을 생성할 수 있는 것으로 확인되었다.

< 실시예 2> 양파 초산발효액의 유기산 조성 분석

양파의 껍질을 제거한 후, 세척하고 잘게 절단하여 녹즙기로 갈아 즙을 내어 양파즙을 제조한 후, 110℃에서 10분간 열처리를 하였다. 상기 열처리한 양파즙을 10,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 불용성물질을 제거하여, 양파 착즙액을 제조하였다.

상기 양파 착즙액 1,000 ml에 상기 실시예 1의 아세토박터 트로피칼리스 No. 22의 전배양액을 3%(v/v)가 되도록 접종한 후, 교반속도 600 rpm 및 1vvm의 통기 조건으로 10일간 배양하였다. 상기 양파 착즙액의 초산발효액에 대해 유기산분석을 통하여, 상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22의 유기산 생성능을 측정하였다.

보다 구체적으로 하기 표 5의 조건으로 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하였다.

사용기기	Agilent 1200 sereies
분석 컬럼	Sep-pak C18(Waters Co.)
검출기	UV detector(210 nm)
유속	1.0 mL/분
시료 부피	10 μL
이동상	인산(phosphoric acid)으로 pH를 조정한 1% acetonitril에 NaHPO₄가 20 mM 포함된 용액

상기 표 5의 조건으로 수행한 고성능 액체크로마토그래피 분석 결과를 발효 전 양파 착즙액의 유기산 함량과 발효 후 양파 발효 음료의 유기산 함량을 비교하여 표 6에 나타내었다. 하기 표 6에서 ND 표시는 해당 유기산이 검출되지 않았음을 의미한다.

유기산	발효하지 않은 양파 착즙액(w/v,%)	초산균으로 발효한 양파 발효액(w/v,%)
사과산	0.18	0.69
유산	ND	ND
초산	ND	4.5
구연산	0.04	0.7
숙신산	0.01	0.62
푸마르산	0.0006	ND
옥살산	ND	0.01
주석산	ND	0.09

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 발효 전 양파 착즙액의 경우, 사과산(malic acid)의 함량이 가장 높았으나, 발효 후에는 발효 전에 검출되지 않았던 초산이 가장 많이 포함되어 있어서, 상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22의 초산 생성능이 매우 우수함이 다시 확인되었다.

또한, 사과산의 함량이 0.51% 증가되었고, 이 외에도 구연산 및 숙신산이 증가되었으며, 발효 전에는 전혀 검출되지 않았던 옥살산과 주석산도 검출되어 상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22는 초산 뿐만 아니라 사과산, 구연산, 숙신산, 옥살산 및 주석산에 대한 산 생성능이 있는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3> 양파 초산발효액의 생리활성

상기 실시예 2의 양파 착즙액 1,000 ml에 상기 실시예 1의 아세토박터 트로피칼리스 No. 22의 전배양액을 3%(v/v)가 되도록 접종한 후, 교반속도 600 rpm 및 1vvm의 통기 조건으로 배양하였다. 상기 양파 착즙액의 초산발효액의 최종 산도가 1%인 시점까지 배양한 후, 최종 산도가 1%인 발효액과 상기 양파 착즙액의 암세포에 대한 항암활성과 혈전 생성 억제능에 대하여 측정하였다.

3-1 항암활성의 측정

항암활성 측정을 위한 세포주는 폐암 세포주와 대장암 세포주를 사용하였고, 구체적으로 A-549(human lung carcinoma), SK-MES-1(human lung carcinoma), DLD-1(human colon adenocarcinoma) 및 Caco-2(human colon adenocarcinoma)를 사용하였다. 상기 세포의 배양은 Gibco사(Life Tech nologies, INC., USA)의 RPMI1640 배지와 DMEM 및 MEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS, heat inactivated)과 1% penicillin-streptomycin을 각각 첨가한 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO₂의 조건으로 incubator에서 수행하였다.

상기 종양세포주에 대한 항암활성의 측정은 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay법으로 수행하였다.

구체적으로, 상기 각각의 종양 세포주를 2×10⁵ cells/mL 농도로 조절한 후에, 96 well plate에 100 μL씩 접종하여 37℃ 및 5% CO₂의 조건으로 incubator에서 24시간 배양하고, 상기 양파 착즙액 및 양파 발효액 시료를 각각 100 μL 접종하여 48시간 동안 배양하였다.

상기 배양이 끝나기 4시간 전에 MTT solution(0.5 mg/mL)을 각 well당 50 μL씩 첨가한 후, 4시간 추가 배양하여 formazan 형성을 유도시켰고, 이것을 용해시키기 위하여 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 각 well당 100 μL 첨가한 후, plate shaker에서 20분간 교반하여 Multi-well scanning spectrophotometer(microlate autoreader, Bio-Tek instrument, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 흡광도에 따른 세포성장 저해율로 항암활성을 평가하였고, 세포성장 저해율이 50%이상인 경우에 항암활성이 있는 것으로 확인하였으며, 상기 세포 성장 저해율은 하기 수학식 1로 계산하였다.

상기 측정 결과는 하기 표 7에 기재하였다.

	발효하지 않은 양파 착즙액	초산균으로 발효한 양파 발효액
A-549	79%	96%
SK-MES-1	60%	95%
DLD-1	76%	96%
Caco-2	66%	97%

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 균주인 아세토박터 트로피칼리스 No. 22으로 발효하는 경우 항암 활성이 현저하게 증가되는 것이 확인되었다.

보다 구체적으로, 폐암세포주인 A549 및 SK-MES-1와 관련하여, 양파 착즙액은 A549 세포에 대하여 79%의 증식억제 효과를 나타낸 반면, 양파 발효액의 경우에는 96%의 증식억제 효과를 나타내 항암효과가 개선되었고, SK-MES-1 세포에 대한 양파 착즙액의 증식억제 활성은 60%를 나타내었으나, 양파 발효액의 경우에는 현저히 상승된 95%의 높은 항암 활성을 나타내었다.

또한 대장암세포인 DLD-1과 Caco-2와 관련하여, 발효 전의 양파 착즙액은 DLD-1와 Caco-2 세포에 대하여 각각 76%와 66%의 증식억제 효과를 나타내었으나, 양파 발효액의 경우에는 두 대장암세포에 대하여 모두 95% 이상의 높은 항암 활성을 나타내어, 현저한 항암활성의 개선효과가 확인되었다.

4-2. 혈소판응집억제 활성

혈액응고는 여러 가지 응고인자들이 연속적으로 활성화되어 최종적으로 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 변화시킴으로써 응혈(clot)을 만드는 과정이다. 상기 혈액응고 과정은 혈관벽 손상 등으로 인한 내인계 경로와 외상 등에 의해 유발되는 외인계 경로가 존재한다.

따라서, 혈전 생성 억제능은 내인성경로에 기인하는 억제활성의 측정 기준인 활성 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time, APTT) 및 트롬빈 시간(thrombin time, TT)과 외인성경로(extrinsic pathwat)에 기인하는 억제활성의 측정 기준인 프로트롬빈시간(prothrombin time, PT)과 fibrinogen(FIB)의 양을 혈액응고 자동분석기(CLOT-2S, SEAC SRL., 이탈리아)로 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4-1의 방법으로 양파 발효액을 제조하였고, 상기 측정은 Rat plasma(IRT-N, Innovative research, 3.8% Na citrate)에 시료를 0.1 mL 및 0.01 mL의 함량으로 첨가한 뒤, 37℃에서 5 내지 10 분간 incubation하여, 응고시간을 측정하는 방법으로 수행하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

	APTT(sec)	TT(sec)	PT(sec)	FIB(mg/Dl)
Rat plasma	62.4	31.5	22.6	100
양파 착즙액(0.1ml)	63.2	31.3	23.0	101
양파 발효액(0.1ml)	Vmax	Vmax	Vmax	36
양파 발효액(0.01ml)	71.7	30.1	23.0	104

APTT(activated partial thromboplastin time), TT(thrombin time) 및 PT(prothrombin time)는 수치가 높을수록 항혈전기능이 있는 것으로 평가되고, FIB(fibrinogen)는 수치가 낮을수록 항혈전기능이 있는 것으로 평가된다.

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 양파 즙의 경우에는 APTT, TT 및 PT와 FIB 함량에서 대조군과 거의 유사하여 항혈전기능이 거의 없는 것으로 확인된 반면 양파 초산 발효액의 경우에는 현저하게 높은 항혈전기능이 있는 것으로 확인되었다. 특히, APTT의 경우에는 160초 이상, TT의 경우에는 240초 이상 및 PT의 경우에는 33초 이상의 시간이 소요되어 항혈전기능이 매우 우수한 것으로 확이되었고, 상기 양파 초산 발효액을 양파 즙의 10%에 해당하는 0.01 ml 첨가한 경우에 양파 즙과 유사한 활성을 나타난 것으로, 본 발명의 균주인 아세토박터 트로피칼리스 No. 22는 발효 과정을 통해 양파에 현저히 상승된 항혈전기능을 부여할 수 있는 것으로 확인되었다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 균주인 아세토박터 트로피칼리스 No. 22은 산 생성능 및 양파의 발효능이 우수할 뿐만 아니라, 양파 초산 발효 과정에서 양파 발효액의 항암활성을 강화시키고, 항혈전생성능을 부여하여, 기능성을 강화시킬 수 있으므로, 상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22를 이용할 경우 고기능성 및 고품질의 우수한 양파 발효 음료를 제조할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 아세토박터 트로피칼리스 No. 22는 양파 발효 음료를 제조하기 위한 종균으로 사용될 수 있을 것이므로, 양파의 새로운 이용방법인 초산균을 이용한 양파 발효 음료를 제안하여 국내에서 생상되는 농산물을 이용한 건강식품시장의 활성화에 많은 도움이 될 수 있을 것으로 예상된다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11476

20091218

Claims

복숭아로부터 분리되고, 산 생성능을 가지며, 양파의 초산 발효능을 가지고, 양파를 발효시켜 초산, 사과산, 구연산, 숙신산, 옥살산 및 주석산을 생성할 수 있는 기탁번호 KFCC 11476P를 갖는 아세토박터 트로피칼리스 균주(Acetobacter tropicalis KFCC 11476P).
제1항에 있어서,
상기 아세토박터 트로피칼리스 균주는 양파를 초산 발효시킬 수 있고, 초산 발효된 양파 발효물에 항암활성 및 혈전생성 억제능을 개선시킬 수 있는 아세토박터 트로피칼리스 균주(Acetobacter tropicalis KFCC 11476P).
제2항에 있어서,
상기 아세토박터 트로피칼리스 균주는 최적 산 생성 조건으로 초기 에탄올 농도가 4%(v/v)이고, 초기 glucose 농도가 2.5%인 것인 아세토박터 트로피칼리스 균주(Acetobacter tropicalis KFCC 11476P).