KR102610939B1 - 콤부차의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 효모와 유산균의 복합 발효를 이용한 콤부차의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 콤부차에 관한 것이다. 본 개시의 일 측면에 따른 콤부차의 제조 방법은 다양한 유기산 및 아미노산을 높은 함량으로 포함하며 풍미가 우수한 콤부차를 제조할 수 있다. 또한, 본 개시의 일 측면에 따른 콤부차의 제조 방법은 교반배양을 적용할 수 있어 대량 생산이 가능하다.

Description

콤부차의 제조방법{METHOD FOR PREPARING KOMBUCHA}
본 개시는 콤부차를 제조하는 방법에 관한 것이다.
콤부차(kombucha)는 녹차나 홍차 등과 같은 차에 당을 첨가하고 유익균을 접종하여 발효시킨 음료이다. 콤부차는 시큼하면서도 달콤한 식초 맛과 향이 나며, 발효 과정에서 탄산이 생성돼 마실 때 청량감이 든다. 이러한 콤부차는 중국, 티벳, 러시아, 일본, 폴란드, 불가리아, 독일, 인도네시아 등에서 널리 음용 되어 오고 있으며, 최근에는 미국에서 건강 및 성인병 예방을 위한 건강 음료로서 인식되어 가정에서 제조되어 소비되고 있는 실정이다.
콤부차는 해독작용, 유해미생물에 대한 항미생물작용, 혈압강하효과 및 인체 내 면역증진작용을 통한 항암에 효과가 있다고 알려져 있다. 이러한 콤부차의 효과는 베이스로 사용된 차 추출물의 성분과 폴리페놀, 글루쿠로닌산, DSL, 젖산, 비타민 등 발효에 의해 생합성된 다양한 발효산물들에 기인한다.
일반적으로, 콤부차는 효모에 의한 알코올 발효와 초산균에 의한 초산 발효에 의해 제조된다. 콤부차에서 알코올을 생성하는 효모와 초산을 생성하는 초산균은 중요한 균주로 주목 받았으나, 젖산을 생성하는 유산균의 경우 콤부차에서 적은 양으로 관찰되어 과거에는 많은 관심을 받지 못했다. 종래의 콤부차 제조법은 초산 발효에 의해 유산균 증식에 적합하지 않은 낮은 pH 환경을 조성하여 유산균 증식이 활발히 이루어지지 않았다. 또한, 종래의 콤부차 제조는 주로 정치배양을 통해 이루어져 대량 생산에 적합하지 못한 문제가 있다.
이와 같이 유산균 발효가 제한되는 방법에 따라 제조되는 콤부차의 관능적 및 기능적 효과는 일반 수요자들의 요구를 충족시키기에는 부족하며, 정치배양을 통한 콤부차의 제조 방법은 대량 생산에 한계가 있으므로 새로운 제조 방법에 따른 콤부차에 대한 연구가 절실한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1719197호
일 측면에서, 본 개시는 풍미가 우수하면서 유효성분의 함량이 증진된 콤부차의 제조 방법을 제공하고자 한다.
일 측면에서, 본 개시는 콤부차의 대량 생산이 가능한 콤부차 제조 방법을 제공하고자 한다.
일 측면에서, 본 개시는 풍미가 우수하면서 유효성분의 함량이 증진된 증진된 콤부차를 제공하고자 한다.
일 측면에서, 본 명세서는 차 추출물에 효모 및 유산균을 접종하여 발효하는 1차 발효 단계; 및 1차 발효 단계의 발효물에 초산균을 접종하여 발효하는 2차 발효 단계를 포함하고, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균주를 포함하고, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 포함하고, 상기 초산균은 글루코노박터(Gluconobacter) 속 균주 및 아세토박터(Acetobacter) 속 균주 중 어느 하나 이상을 포함하는 콤부차의 제조 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 명세서는 상기 콤부차의 제조 방법으로 제조된 콤부차를 제공한다.
일 측면에서, 본 명세서는 하기 특성 중 어느 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 콤부차를 제공한다:
(1) 콤부차의 총 부피를 기준으로 23 g/L 이상의 아세트산(acetic acid) 함량;
(2) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.09 g/L 이상의 아스코르브산(ascorbic acid) 함량;
(3) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.11 g/L 이상의 젖산(lactic acid) 함량;
(4) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.06 g/L 이상의 오르니틴(ornithine) 함량;
(5) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.01 g/L 이상의 프롤린(proline) 함량;
(6) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.01 g/L 이상의 사르코신(sarcosine) 함량;
(7) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.06 g/L 이상의 타우린(taurine) 함량.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 콤부차의 제조 방법은 다양한 유기산 및 아미노산을 높은 함량으로 포함하는 콤부차를 제조할 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 콤부차의 제조 방법은 교반배양을 적용할 수 있어 콤부차의 대량 생산이 가능하다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 콤부차의 제조방법으로 제조된 콤부차는 풍미가 우수하며 감칠맛과 산미의 밸런스가 양호하다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 콤부차의 기호도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도별 초산균의 생육을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 초산균의 이화학 분석 및 생균수 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 초산균에 따른 관능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 아세토박터 트로피칼리스 균주의 16s rRNA 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 아세토박터 파스테우리아누스 균주의 16s rRNA 서열을 나타낸 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당해 분야에 종사하는 기술자의 의도, 판례, 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함하여 여기에서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 이해되는 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 동일한 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 본 발명에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는", "갖는", "함유하는"은 포괄적 또는 개방적이고, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에 사용된 용어 "또는 이들의 조합물"은 상기 용어에 앞서 열거된 품목들의 모든 순열 및 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이들의 조합물"은 A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC, 및 특별한 문맥에서 순서가 중요한 경우에는 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB 중 적어도 1개를 포함하는 것으로 의도된다. 이 예와 함께, 1개 이상의 품목 또는 용어의 반복을 함유하는 조합, 예컨대 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등이 포함될 수 있다. 통상의 기술자라면, 문맥상 달리 자명하지 않는 한, 전형적으로 임의의 조합에서 품목 또는 용어의 개수에 제한이 없다는 것을 이해할 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 개시는 차 추출물에 효모 및 유산균을 접종하여 발효하는 1차 발효 단계; 및 1차 발효 단계의 발효물에 초산균을 접종하여 발효하는 2차 발효 단계를 포함하는 콤부차의 제조 방법을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균주를 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 사카로마이세스 속 균주는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 루시(Saccharomyces rouxii), 사카로마이세스 오비폴미스(Saccharomyces oviformis), 사카로마이세스 스테이네리(Saccharomyces steineri), 사카로마이세스 클루베리(Saccharomyces klutveri), 사카로마이세스 코레아누스(Saccharomyces coreanus) 및 사카로마이세스 사케(Saccharomyces sake)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비제를 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 사카로마이세스 세레비제는 기탁번호가 KCCM12008P인 사카로마이세스 세레비제 JTL-L1(Saccharomyces cerevisiae JTL-L1)일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 루트리(Lactobacillus reutri), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbruekii), 락토바실러스 존슨니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus leuteri)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 락토바실러스 플란타룸은 기탁번호가 KCCM11179P인 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261(Lactobacillus plantarum APsulloc 331261)일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 초산균은 글루코노박터(Gluconobacter) 속 균주 및 아세토박터(Acetobacter) 속 균주 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 글루코노박터 속 균주는 글루코노박터 옥시단(Gluconobacter oxydan), 글루코노박터 아사이(Gluconobacter asaii), 글루코노박터 프라테우리(Gluconobacter frateurii) 및 글루코노박터 세리누스(Gluconobacter cerinus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 글루코노박터 옥시단을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 아세토박터 속 균주는 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis), 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 아세티게눔(Acetobacter acetigenum), 아세토박터 아세토섬(Acetobacter acetosum), 아세토박터 메속시단스(Acetobacter mesoxydans), 아세토박터 오르리안스(Acetobacter orleanse), 아세토박터 슈에제네바키(Acetobacter schuezenebachii)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 아세토박터 트로피칼리스 및 아세토박터 파스테우리아누스 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 아세토박터 트로피칼리스는 기탁번호가 KCTC14927BP인 아세토박터 트로피칼리스 sulloc(Acetobacter tropicalis sulloc)일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 아세토박터 파스테우리아누스는 기탁번호가 KCTC14928BP인 아세토박터 파스테우리아누스 sulloc(Acetobacter pasteurianus sulloc)일 수 있다.
본 명세서에서 "차 추출물"은 추출방법, 추출용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 차과에 속하는 상록수인 차(카멜리아 시넨시스; Camellia sinensis)로부터 추출한 것 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis spp.)를 접종하고 발효시킨 차잎 등으로부터 추출한 것을 포함하고, 상기 추출한 것을 특정 용매로 분획한 분획물을 포함한다. 상기 차는 차나무 잎, 꽃, 줄기, 열매, 뿌리, 줄기, 및 뿌리의 심재로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 포함되며, 바람직하게는 잎일 수 있다. 상기 추출 또는 분획은 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 할 수 있다. 유기용매는 알코올, 이소프로판올, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 이산화탄소, 또는 이들 중 둘 이상의 혼합용매를 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 알코올은 C1~C5의 저급 알코올일 수 있다. 추출 또는 분획의 횟수나 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출 등의 방법을 사용할 수 있고, 바람직하게는 냉침 또는 가온하여 유효성분을 추출 또는 분획하고 여과한 다음, 그 여과액을 감압농축하여 차 추출물을 얻을 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 차는 녹차, 홍차, 우롱차 및 보이차로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 1차 발효는 25 내지 35℃에서 수행될 수 있다. 1차 발효가 상기 온도 범위를 벗어나서 수행되는 경우 콤부차의 유효성분 함량이 저하될 수 있다. 구체적으로, 상기 1차 발효는 25℃이상, 25.5℃이상, 26℃이상, 26.5℃이상 또는 27℃이상이면서, 35℃이하, 34.5℃이하, 34℃이하, 33.5℃이하 또는 33℃이하에서 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 1차 발효는 1 내지 5일 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 1차 발효는 1일 이상, 1.5일 이상, 2일 이상 또는 2.5일 이상이면서, 5일 이하, 4.5일 이하, 4일 이하 또는 3.5일 이하의 시간 동안 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 1차 발효 단계에서 효모 및 유산균은 106 내지 108 CFU/mL로 접종될 수 있다. 구체적으로, 상기 1차 발효 단계에 효모 및 유산균은 1 x 106 CFU/mL 이상, 2 x 106 CFU/mL 이상, 3 x 106 CFU/mL 이상, 4 x 106 CFU/mL 이상, 5 x 106 CFU/mL 이상, 6 x 106 CFU/mL 이상 또는 7 x 106 CFU/mL 이상이면서 1 x 108 CFU/mL 이하, 9 x 107 CFU/mL 이하, 8 x 107 CFU/mL 이하, 7 x 107 CFU/mL 이하, 6 x 107 CFU/mL 이하, 5 x 107 CFU/mL 이하, 4 x 107 CFU/mL 이하 또는 3 x 107 CFU/mL 이하로 접종될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 1차 발효 단계는 혐기적 조건에서 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 1차 발효 단계에서 효모 및 유산균을 접종하기 전 차 추출물에 당을 첨가할 수 있다. 상기 당은, 예를 들어, 설탕, 과당, 꿀, 프락토 알리고당 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 당은 당이 첨가된 차 추출물의 당도가 4 내지 8 Brix, 5 내지 8 Brix, 5 내지 7 Brix 또는 6 내지 7 Brix가 되도록 첨가될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 콤부차 제조 방법은 1차 추출 단계 이후 1차 단계의 발효물을 여과하는 1차 여과 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 1차 여과 단계는 원심분리 및 진공여과 필터를 통해 수행될 수 있다. 상기 원심분리는 3000 내지 5000 x g, 1 내지 9 ℃의 조건에서 5 내지 15분 동안 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 2차 발효는 25 내지 45℃에서 수행될 수 있다. 2차 발효가 상기 온도 범위를 벗어나서 수행되는 경우 발효 효율이 저하될 수 있다. 구체적으로, 상기 2차 발효는 25℃이상, 25.5℃이상, 26℃이상, 26.5℃이상, 27℃이상, 27.5℃이상, 28℃이상, 28.5℃이상 또는 29℃이상이면서, 45℃이하, 44.5℃이하, 44℃이하, 43.5℃이하, 43℃이하, 42.5℃이하, 42℃이하에서 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 2차 발효는 2 내지 13일 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 2차 발효는 2일 이상, 2.5일 이상 또는 3일 이상이면서, 13일 이하, 12.5일 이하, 12일 이하, 11.5일 이하 또는 11일 이하의 시간 동안 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 2차 발효 단계에서 초산균은 106 내지 108 CFU/mL로 접종될 수 있다. 구체적으로, 상기 2차 발효 단계에 초산균은 1 x 106 CFU/mL 이상, 2 x 106 CFU/mL 이상, 3 x 106 CFU/mL 이상, 4 x 106 CFU/mL 이상, 5 x 106 CFU/mL 이상, 6 x 106 CFU/mL 이상 또는 7 x 106 CFU/mL 이상이면서 1 x 108 CFU/mL 이하, 9 x 107 CFU/mL 이하, 8 x 107 CFU/mL 이하, 7 x 107 CFU/mL 이하, 6 x 107 CFU/mL 이하, 5 x 107 CFU/mL 이하, 4 x 107 CFU/mL 이하 또는 3 x 107 CFU/mL 이하로 접종될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 2차 발효 단계에서 1차 발효 단계의 발효물에 상기 초산균과 함께 상기 유산균이 더 접종될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 초산균은 글루코노박터(Gluconobacter) 속 균주 및 아세토박터(Acetobacter) 속 균주 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 글루코노박터 속 균주는 글루코노박터 옥시단(Gluconobacter oxydan), 글루코노박터 아사이(Gluconobacter asaii), 글루코노박터 프라테우리(Gluconobacter frateurii) 및 글루코노박터 세리누스(Gluconobacter cerinus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 글루코노박터 옥시단을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 아세토박터 속 균주는 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter tropicalis), 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 아세티게눔(Acetobacter acetigenum), 아세토박터 아세토섬(Acetobacter acetosum), 아세토박터 메속시단스(Acetobacter mesoxydans), 아세토박터 오르리안스(Acetobacter orleanse), 아세토박터 슈에제네바키(Acetobacter schuezenebachii)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 아세토박터 트로피칼리스 및 아세토박터 파스테우리아누스 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 초산균은 기탁번호가 KCTC14928BP인 아세토박터 파스테우리아누스 sulloc (Acetobacter pasteurianus sulloc), 기탁번호가 KCTC14927BP인 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter troipicalis), 또는 글루코노박터 옥시단(Gluconobacter oxydan)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 기탁번호가 KCTC14928BP인 아세토박터 파스테우리아누스 sulloc (Acetobacter pasteurianus sulloc)일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 루트리(Lactobacillus reutri), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbruekii), 락토바실러스 존슨니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus leuteri)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸을 포함할 수 있다. 상기 유산균은 기탁번호가 KCCM11179P인 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261(Lactobacillus plantarum APsulloc 331261)인 것이 바람직하다.
이와 같이 2차 발효가 복합발효로 진행되는 경우, 유산균 발효는 상대적으로 높은 온도(예를 들어, 약 35 내지 40℃로 진행되는 것이 바람직한데 내열성이 우수한 아세토박터 파스테우리아누스 sulloc(기탁번호: KCTC14928BP)를 초산균으로 사용하는 경우 발효 효율을 극대화할 수 있다. 또한, 상기 유산균은 103 내지 108 CFU/mL로 접종될 수 있다. 구체적으로, 상기 유산균은 1 x 103 CFU/mL 이상, 2 x 103 CFU/mL 이상, 3 x 103 CFU/mL 이상, 4 x 103 CFU/mL 이상, 5 x 103 CFU/mL 이상, 1 x 104 CFU/mL 이상 또는 5 x 104 CFU/mL 이상이면서 1 x 108 CFU/mL 이하, 9 x 107 CFU/mL 이하, 8 x 107 CFU/mL 이하, 7 x 107 CFU/mL 이하, 6 x 107 CFU/mL 이하, 5 x 107 CFU/mL 이하, 1 x 107 CFU/mL 이하 또는 5 x 106 CFU/mL 이하로 접종될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 2차 발효 단계는 호기적 조건에서 1 내지 5일 동안 수행된 후 혐기적 조건 하에서 1 내지 12일 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 호기적 조건에서 발효는 25 내지 35℃에서 수행될 수 있으며, 혐기적 조건에서 발효는 25 내지 45℃에서 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 2차 발효 단계에서 1차 발효 단계의 발효물 균을 접종한 후 당을 첨가할 수 있다. 상기 당은, 예를 들어, 설탕, 과당, 꿀, 프락토 알리고당 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 콤부차 제조 방법은 2차 추출 단계 이후 2차 단계의 발효물을 여과하는 2차 여과 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 2차 여과 단계는 원심분리 및 진공여과 필터를 통해 수행될 수 있다. 상기 원심분리는 3000 내지 5000 x g, 1 내지 9 ℃의 조건에서 5 내지 15분 동안 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 1차 발효 단계 및 2차 발효 단계 중 어느 하나 이상은 교반 배양으로 수행될 수 있다. 교반 배양으로 수행되는 경우 콤부차의 대량 생산이 가능한 이점이 있다.
일 측면에서, 본 개시는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 콤부차를 제공할 수 있으며, 이러한 콤부차는 본 개시의 일 측면에 따른 콤부차의 제조 방법에 의해 제조된 것일 수 있다:
(1) 콤부차의 총 부피를 기준으로 23 g/L 이상의 아세트산(acetic acid) 함량;
(2) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.09 g/L 이상의 아스코르브산(ascorbic acid) 함량;
(3) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.11 g/L 이상의 젖산(lactic acid) 함량;
(4) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.06 g/L 이상의 오르니틴(ornithine) 함량;
(5) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.01 g/L 이상의 프롤린(proline) 함량;
(6) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.01 g/L 이상의 사르코신(sarcosine) 함량;
(7) 콤부차의 총 부피를 기준으로 0.06 g/L 이상의 타우린(taurine) 함량.
구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 콤부차의 특성은 하기와 같은 것일 수 있다.
(1) 콤부차의 총 부피를 기준으로 아세트산(acetic acid) 함량이 23 g/L 이상, 23.1 g/L 이상, 23.2 g/L 이상, 23.3 g/L 이상, 23.4 g/L 이상, 23.5 g/L 이상, 23.6 g/L 이상, 23.7 g/L 이상, 23.8 g/L 이상, 23.9 g/L 이상, 24 g/L 이상, 24.1 g/L 이상, 24.2 g/L 이상, 24.3 g/L 이상, 24.4 g/L 이상, 24.5 g/L 이상, 24.6 g/L 이상, 24.7 g/L 이상, 24.8 g/L 이상, 24.9 g/L 이상, 25 g/L 이상, 25.1 g/L 이상, 25.2 g/L 이상, 25.3 g/L 이상, 25.4 g/L 이상 또는 25.5 g/L 이상이거나 40 g/L 이하, 39.5 g/L 이하, 39 g/L 이하, 38.5 g/L 이하, 38 g/L 이하, 37.5 g/L 이하, 37 g/L 이하, 36.5 g/L 이하, 36 g/L 이하, 35.5 g/L 이하 또는 35 g/L 이하인 특성;
(2) 콤부차의 총 부피를 기준으로 아스코르브산(ascorbic acid) 함량이 0.09 g/L 이상, 0.091 g/L 이상, 0.092 g/L 이상, 0.093 g/L 이상, 0.094 g/L 이상, 0.095 g/L 이상, 0.096 g/L 이상, 0.097 g/L 이상, 0.098 g/L 이상, 0.099 g/L 이상, 0.1 g/L 이상 또는 0.105 g/L 이상이거나 1 g/L 이하, 0.99 g/L 이하, 0.98 g/L 이하, 0.97 g/L 이하, 0.96 g/L 이하, 0.95 g/L 이하, 0.9 g/L 이하, 0.85 g/L 이하, 0.8 g/L 이하, 0.75 g/L 이하 또는 0.7 g/L 이하인 특성;
(3) 콤부차의 총 부피를 기준으로 젖산(lactic acid) 함량이 0.11 g/L 이상, 0.12 g/L 이상, 0.13 g/L 이상, 0.14 g/L 이상, 0.15 g/L 이상, 0.16 g/L 이상, 0.17 g/L 이상, 0.18 g/L 이상, 0.19 g/L 이상, 0.2 g/L 이상, 0.25 g/L 이상, 0.3 g/L 이상, 0.35 g/L 이상, 0.4 g/L 이상, 0.45 g/L 이상 또는 0.5 g/L 이상이거나 1 g/L 이하, 0.95 g/L 이하, 0.9 g/L 이하, 0.85 g/L 이하, 0.8 g/L 이하, 0.75 g/L 이하 또는 0.7 g/L 이하인 특성;
(4) 콤부차의 총 부피를 기준으로 오르니틴(ornithine) 함량이 0.06 g/L 이상, 0.07 g/L 이상, 0.08 g/L 이상, 0.09 g/L 이상, 0.1 g/L 이상, 0.11 g/L 이상, 0.12 g/L 이상, 0.13 g/L 이상, 0.14 g/L 이상, 0.15 g/L 이상, 0.16 g/L 이상, 0.17 g/L 이상, 0.18 g/L 이상, 0.19 g/L 이상, 0.2 g/L 이상, 0.21 g/L 이상 또는 0.22 g/L 이상이거나 0.7 g/L 이하, 0.69 g/L 이하, 0.68 g/L 이하, 0.67 g/L 이하, 0.66 g/L 이하, 0.65 g/L 이하, 0.64 g/L 이하, 0.63 g/L 이하, 0.62 g/L 이하, 0.61 g/L 이하, 0.6 g/L 이하, 0.55 g/L 이하 또는 0.5 g/L 이하인 특성;
(5) 콤부차의 총 부피를 기준으로 프롤린(proline) 함량이 0.01 g/L 이상, 0.011 g/L 이상, 0.012 g/L 이상, 0.013 g/L 이상 또는 0.014 g/L 이상이거나 0.1 g/L 이하, 0.095 g/L 이하, 0.09 g/L 이하, 0.085 g/L 이하, 0.08 g/L 이하, 0.075 g/L 이하 또는 0.07 g/L 이하인 특성;
(6) 콤부차의 총 부피를 기준으로 사르코신(sarcosine) 함량이 0.01 g/L 이상, 0.011 g/L 이상, 0.012 g/L 이상, 0.013 g/L 이상, 0.014 g/L 이상, 0.015 g/L 이상, 0.016 g/L 이상, 0.017 g/L 이상, 0.018 g/L 이상, 0.019 g/L 이상, 0.02 g/L 이상, 0.021 g/L 이상, 0.022 g/L 이상, 0.023 g/L 이상 또는 0.024 g/L 이상이거나 0.1 g/L 이하, 0.09 g/L 이하, 0.08 g/L 이하, 0.07 g/L 이하, 0.06 g/L 이하 또는 0.05 g/L 이하인 특성;
(7) 콤부차의 총 부피를 기준으로 타우린(taurine) 함량이 0.06 g/L 이상, 0.07 g/L 이상, 0.08 g/L 이상, 0.07 g/L 이상, 0.08 g/L 이상, 0.09 g/L 이상, 0.1 g/L 이상, 0.11 g/L 이상, 0.12 g/L 이상, 0.13 g/L 이상 또는 0.14 g/L 이상이거나 0.7 g/L 이하, 0.69 g/L 이하, 0.68 g/L 이하, 0.67 g/L 이하, 0.66 g/L 이하, 0.65 g/L 이하, 0.6 g/L 이하, 0.55 g/L 이하 또는 0.5 g/L 이하인 특성.
일 측면에서, 본 개시는 기탁번호가 KCTC14927BP인 아세토박터 트로피칼리스 sulloc(Acetobacter tropicalis sulloc) 균주를 제공한다.
다른 측면에서, 본 개시는 기탁번호가 KCTC14928BP인 아세토박터 파스테우리아누스 sulloc (Acetobacter pasteurianus sulloc) 균주를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
본 발명에서 사용된 생물자원 Saccharomyces cerevisiae (KCTC7913), Lactobacillus plantarum (KCTC3108) 및 Gluconobacter oxydan(KCTC2749)은 KCTC로부터 제공받아 연구를 진행하였다.
[제조예 1] 아세토박터 트로피칼리스 균주의 분리
콤부차로부터 단계희석을 통해 single colony를 선별하여 초산균을 분리하였다. 모양이 크지 않고, 색이 불투명한 single colony만을 선별하여 30℃에서 48시간 배양한 후 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 16S rRNA 서열(서열번호 1, 도 5)를 확인하고, 이를 토대로 NCBI Blast에서 공지된 서열들과 비교하여 Acetobacter tropicalis와 높은 동일성을 보임을 확인하였다. 이와 같이 동정한 균주를 Acetobacter tropicalis sulloc(기탁번호: KCTC14927BP)로 명명하였다. 이와 같이 분리된 균주는 글루코스와 에탄올을 탄소원으로 이용하여 아세트산으로 전환시킬 수 있으며, 아세테이트와 락테이트를 물과 CO2로 산화시킬 수 있고 약 40℃에서도 배양될 수 있는 우수한 내열성을 가지고 있다.
[제조예 2] 아세토박터 파스테우리아누스 균주의 분리
제주 전통 시장 서귀포 올레시장에서 막걸리 3종(제주막걸리, 우도땅콩막걸리, 제주한라봉막걸리)를 구매하여 혼합한 뒤, 상온에서 10일 이상 방치하여 자연발효시킨 후 single colony를 선별하여 초산균을 분리하였다. 모양이 크지 않고, 색이 불투명한 single colony만을 선별하여 30℃에서 48 내지 72시간 배양한 후 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 16S rRNA 서열(서열번호 2, 도 6)을 확인하고, 이를 토대로 NCBI Blast에서 공지된 서열들과 비교하여 Acetobacter pasteurianus와 높은 동일성을 보임을 확인하였다. 이와 같이 동정한 균주를 Acetobacter pasteurianus sulloc(기탁번호: KCTC14928BP)로 명명하였다. 이와 같이 분리된 균주는 글루코스, 만니톨, 에탄올을 탄소원으로 사용하며, 높은 농도의 아세트산에서 잘 배양되는 우수한 내산성을 가지고 있다.
[실험예 1] 알코올-젖산 복합발효에 적합한 균주 선정
1. 발효액 제조
홍차 5 g에 100 ml의 물을 가하여 추출한 후 당도가 6 Brix가 되도록 사양벌꿀을 첨가하여 추출액을 제조하였다. 하기 표 1에 나타낸 효모와 유산균을 30℃에서 24 내지 48시간 배양하고 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용해서 흡광도 600nm에서 측정하여 측정 값이 1.0 이상되었을 때, 균주를 3회 세척 후 107 CFU/mL로 추출액에 접종하였다. 외부 공기를 차단시켜, 혐기적 조건을 형성한 후, 30℃에서 3일동안 발효하였다. 그 후 찻잎(홍차)을 체에 걸러준 후, 원심분리(4,000 Х4℃를 통해 1차 분리하고, 진공여과 필터를 이용해서 2차 분리를 진행하여 A 내지 D의 발효액을 제조하였다.
A B C D
효모 Saccharomyces cerevisiae (KCTC7913) Saccharomyces cerevisiae JTL-L1(KCCM12008P) Saccharomyces cerevisiae
(KCTC7913)		 Saccharomyces cerevisiae JTL-L1
(KCCM12008P)
유산균 - - Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P) Lactobacillus plantarum APsulloc 331261
(KCCM11179P)
2. 발효액의 물리화학적 성분 분석
A 내지 D의 발효액의 당도, pH 및 알코올 함량을 분석하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. 구체적으로, 당도는 각각의 발효액을 20℃의 항온 수조에 10~20분간 담가 놓은 후 온도가 20℃로 일정하게 되었을 때 당도계(PAL-1, ATAGO Co., Japan)를 이용하며 측정하였으며, pH는 pH meter (TR.BP3001, Trans Instruments Pte Ltd, Singapore)로 측정하였다. 알코올 함량은 비중측정법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 깨끗하게 씻고 건조시킨 비중병의 무게(W)를 마개와 뚜껑을 빼고 시료를 가득 넣은 다음 규정온도보다 1~3℃낮게 하고 거품이 남지 아니하도록 주의하여 마개를 닫고, 천천히 온도를 올려 온도계가 규정온도를 나타낼 때 상부의 시료를 측관으로부터 제거하고 측관에 뚜껑을 씌운 다음 외부를 잘 닦고 무게(W1)를 달았다. 다시 같은 비중병으로 증류수를 사용하여 위와 같이 조작하고 그 무게(W2)를 달아 다음 계산식에 따라 비중(d)을 구하였다.
d ＝(W1 - W) / (W2 - W)
A B C D
당도
(Brix)		 0 day 6.3 6.3 6.3 6.3
1 day 5.6 4.0 5.7 4.7
2 day 5.1 2.4 5.0 3.0
3 day 4.1 2.7 4.4 3.3
pH 0 day 5.2 5.2 5.2 5.2
1 day 4.9 4.4 3.7 3.7
2 day 4.4 4.3 3.5 3.6
3 day 4.1 3.9 3.6 3.7
알코올
(%)		 0 day 0.0 0.0 0.0 0.0
1 day 0.1 0.1 0.1 0.1
2 day 1.2 1.6 0.8 1.4
3 day 1.7 2.3 1.3 2.0
3. 발효액의 유기산(젖산) 분석
A 내지 D의 발효액의 유기산 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, 1260 Infinity II Agilent, Santa Clara United States)을 이용하여 수행하였다. 컬럼은 Hi-plex H(300x7.7mm)(Agilent, Santa Clara United States)를 사용하여 분리를 진행하였으며, 온도는 55℃로 설정하였다. 이동상은 5mM H2SO4를 사용하였고, 시료는 8μL를 주입하였으며, 0.6mL/min의 유속으로 진행하였다. 모든 피크는 210nm의 파장에서 검출하였으며, 이동상은 사용하기 전에 0.45 μm 필터(Millipore, Milford, MA, USA)를 통해 여과하고, 진공 하에 탈기하여 사용하였다. A 내지 D의 발효액의 젖산 분석 결과를 표 3에 나타내었다.
A B C D
젖산
(g/L)		 0 day 1.28 1.28 1.28 1.28
1 day 1.12 1.17 2.27 2.09
2 day 0.74 0.77 4.15 3.86
3 day 0.74 0.69 4.90 5.10
효모와 유산균을 동시에 접종하여 알코올-젖산 발효를 진행한 C의 경우 효모를 단독으로 접종하여 발효를 진행한 A보다 알코올 생성이 적었지만, 효모로 Saccharomyces cerevisiae JTL-L1을 사용하여 유산균과 동시에 접종하여 발효를 진행한 D의 경우 효모를 단독으로 접종하여 발효를 진행한 A보다 높은 알코올 생성을 나타냈다. 또한, 효모를 단독으로 접종하여 발효를 진행한 A 및 B에 비해 효모 및 유산균을 동시에 접종하여 발효를 진행한 D에서 젖산이 약 7배 가량 높게 생성되었다. 이를 통해, 효모로 Saccharomyces cerevisiae JTL-L1을 사용하여 유산균과 동시 접종하여 발효를 진행하는 경우 콤부차 발효 시에 필요한 알코올이 충분히 생성되면서도 젖산 생성 또한 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다.
[실시예 1] 콤부차의 제조 (알코올-젖산 복합 1차 발효)
홍차 5 g에 100 ml의 물을 가하여 추출한 후 당도가 6 Brix가 되도록 사양벌꿀을 첨가하여 추출액을 제조하였다. Saccharomyces cerevisiae JTL-L1(KCCM12008P) 및 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P)을 30℃에서 24 내지 48시간 배양하고 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용해서 흡광도 600nm에서 측정하여 측정 값이 1.0 이상되었을 때, 균주를 3회 세척 후 107 CFU/mL로 추출액에 접종하였다. 외부 공기를 차단시켜 혐기적 조건을 형성한 후, 30℃에서 3일동안 1차 발효하였다. 그 후 찻잎(홍차)을 체에 걸러준 후, 원심분리(4,000 Х4℃min)를 통해 1차 분리하고, 진공여과 필터를 이용해서 2차 분리를 진행하여 1차 발효액을 수득하였다. 1차 발효액에 Gluconobacter oxydan (KCTC2749) 및 Acetobacter tropicalis sulloc(기탁번호: KCTC14927BP)을 107 CFU/mL로 접종하였다. 외부 공기와 접촉이 되도록 호기성 조건을 형성하고 진탕배양기에서 200 rpm, 30℃조건에서 5일 동안 2차 발효한 후 진공여과 필터로 여과하여 콤부차를 제조하였다.
[실시예 2] 콤부차의 제조 (알코올-젖산 복합 1차 발효)
홍차 5 g에 100 ml의 물을 가하여 추출한 후 당도가 6 Brix가 되도록 사양벌꿀을 첨가하여 추출액을 제조하였다. Saccharomyces cerevisiae JTL-L1(KCCM12008P) 및 Lactobacillus plantarum (KCTC3108)을 30℃에서 24 내지 48시간 배양하고 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용해서 흡광도 600nm에서 측정하여 측정 값이 1.0 이상되었을 때, 균주를 3회 세척 후 107 CFU/mL로 추출액에 접종하였다. 외부 공기를 차단시켜 혐기적 조건을 형성한 후, 30℃에서 3일동안 1차 발효하였다. 그 후 찻잎(홍차)을 체에 걸러준 후, 원심분리(4,000 Х4℃를 통해 1차 분리하고, 진공여과 필터를 이용해서 2차 분리를 진행하여 1차 발효액을 수득하였다. 1차 발효액에 Gluconobacter oxydan (KCTC2749) 및 Acetobacter tropicalis sulloc(기탁번호: KCTC14927BP)을 107 CFU/mL로 접종하였다. 외부 공기와 접촉이 되도록 호기성 조건을 형성하고 진탕배양기에서 200 rpm, 30℃조건에서 5일 동안 2차 발효한 후 진공여과 필터로 여과하여 콤부차를 제조하였다.
[비교예 1]
홍차 5 g에 100 ml의 물을 가하여 추출한 후 당도가 6 Brix가 되도록 사양벌꿀을 첨가하여 추출액을 제조하였다. Saccharomyces cerevisiae JTL-L1(KCCM12008P)을 30℃에서 24 내지 48시간 배양하고 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용해서 흡광도 600nm에서 측정하여 측정 값이 1.0 이상되었을 때, 균주를 3회 세척 후 107 CFU/mL로 추출액에 접종하였다. 외부 공기를 차단시켜 혐기적 조건을 형성한 후, 30℃에서 3일동안 1차 발효하였다. 그 후 찻잎(홍차)을 체에 걸러준 후, 원심분리(4,000 Х4℃를 통해 1차 분리하고, 진공여과 필터를 이용해서 2차 분리를 진행하여 1차 발효액을 수득하였다. 1차 발효액에 Gluconobacter oxydan (KCTC2749) 및 Acetobacter tropicalis sulloc(기탁번호: KCTC14927BP)을 107 CFU/mL로 접종하였다. 외부 공기와 접촉이 되도록 호기성 조건을 형성하고 진탕배양기에서 200 rpm, 30℃조건에서 5일 동안 2차 발효한 후 진공여과 필터로 여과하여 2차 발효액을 수득하였다. 2차 발효액에 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P)을 107 CFU/mL로 접종하고 30℃에서 3일동안 3차 발효하여 콤부차를 제조하였다.
[실험예 2] 콤부차의 물리화학적 성분 분석
실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 콤부차의 당도, 산도, pH 및 알코올 함량을 분석하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. 구체적으로, 당도는 20℃에서 당도계(PAL-1, ATAGO Co., Japan)를 이용하며 측정하였으며, pH는 pH meter (TR.BP3001, Trans Instruments Pte Ltd, Singapore)로 측정하였고, 산도는 0.1 N NaOH를 이용해서 배양액의 pH가 8.4 되도록 적정하여 측정하였다(계산식: TA(%) = amount of 0.1 N NaOH (mL) Х0.009 Х 10). 알코올 함량은 비중측정법을 이용하여 정량하였다.
실시예 1 실시예 2 비교예 1
당도
(Brix)		 발효 전 6.1 6.1 6.1
1차 발효 후 3.1 3.2 2.6
2차 발효 후 2.8 3.1 2.2
3차 발효 후 - - 2.4
산도
(%)		 발효 전 0.24 0.24 0.24
1차 발효 후 1.65 1.70 2.17
2차 발효 후 2.11 2.19 2.23
3차 발효 후 - - 2.18
pH 발효 전 5.6 5.6 5.6
1차 발효 후 3.8 3.7 4.0
2차 발효 후 3.1 3.3 3.4
3차 발효 후 - - 3.2
알코올
(%)		 발효 전 0.0 0.0 0.0
1차 발효 후 1.9 2.0 2.3
2차 발효 후 0.0 0.0 0.0
3차 발효 후 - - 0.0
표 4에서 확인할 수 있듯이, 1차 발효한 결과, 알코올-젖산 복합 발효한 실시예 1 및 2가 알코올 단독 발효한 비교예 1에 비해 산도가 높게 나타나 유산균에 의해 젖산이 생성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 3차 발효를 진행한 비교예 1에서는 낮은 pH로 인해 유산균 발효 효과가 크지 않은 것을 알 수 있었다.
[실험예 3] 콤부차의 유기산 분석
실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 콤부차의 유기산 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, 1260 Infinity II Agilent, Santa Clara United States)을 이용하여 수행하였다. 컬럼은 Hi-plex H(300x7.7mm)(Agilent, Santa Clara United States)를 사용하여 분리를 진행하였으며, 온도는 55℃로 설정하였다. 이동상은 5mM H2SO4를 사용하였고, 시료는 8μL를 주입하였으며, 0.6mL/min의 유속으로 진행하였다. 모든 피크는 210nm의 파장에서 검출하였으며, 이동상은 사용하기 전에 0.45 μm 필터(Millipore, Milford, MA, USA)를 통해 여과하고, 진공 하에 탈기하여 사용하였다. 유기산 분석 결과를 표 5에 나타내었다.
유기산(g/L) 실시예 1 실시예 2 비교예 1
Acetic acid 발효 전 1.17 1.17 1.17
1차 발효 후 1.03 1.10 1.22
2차 발효 후 25.87 25.43 24.48
3차 발효 후 - - 24.33
Ascorbic acid 발효 전 0.4 0.4 0.4
1차 발효 후 0.05 0.00 0.05
2차 발효 후 0.11 0.07 0.08
3차 발효 후 - - 0.01
Citric acid 발효 전 0.11 0.11 0.11
1차 발효 후 0.28 0.49 0.78
2차 발효 후 0.40 0.13 0.61
3차 발효 후 - - 0.18
Formic acid 발효 전 0.00 0.00 0.00
1차 발효 후 0.22 0.24 0.00
2차 발효 후 0.17 0.29 0.08
3차 발효 후 - - 0.22
Lactic acid 발효 전 1.07 1.07 1.07
1차 발효 후 5.72 4.96 0.52
2차 발효 후 0.26 0.05 0.10
3차 발효 후 - - 0.03
Malic acid 발효 전 0.00 0.00 0.00
1차 발효 후 0.00 0.00 0.00
2차 발효 후 0.26 0.34 0.22
3차 발효 후 - - 0.15
Oxalic acid 발효 전 0.57 0.57 0.57
1차 발효 후 1.67 1.34 1.06
2차 발효 후 1.79 0.99 1.19
3차 발효 후 - - 2.03
표 5에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1에 비해 실시예 1에서 아세트산(Acetic acid), 시트르산(Citric acid), 젖산(Lactic acid) 함량이 높게 나타났으며, 특히 1차 발효 후를 비교하면 실시예 1 및 2에서 유산균 발효에 의해 lactic acid 함량이 많이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 비교예 1은 높은 산도로 인해 유산균이 잘 생장하지 못해 3차 발효에도 젖산 생성이 낮은 것을 알 수 있었다.
[실험예 4] 콤부차의 아미노산 분석
실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 콤부차의 아미노산 분석은 아미노산 자동분석기인 L-8900 high-speed amino acid analyser (Hitachi, Japan)을 이용하여 수행하였다. 이동상은 PF-1, PF-2, PF-3, PF-4, PG-6, PF-RG, R-3, C-1, ninhydrin solution, buffer solution (Wako, Japan)을 사용하였으며, 분석 컬럼은 ion exchange column #2622SC PH (Hitachi, Japan)을 사용하였다. 유리아미노산 표준물질은 type ANII와 type B (Wako, Japan)을 50:50(v/v)으로 혼합하여 사용하였다. 아미노산 분석 결과를 표 6에 나타내었다.
아미노산 (g/L) 실시예 1 실시예 2 비교예 1
1-methylhistidine 0.000 0.000 0.000
3-methylhistidine 0.000 0.000 0.000
alanine 0.006 0.001 0.000
ammonia 0.000 0.000 0.000
anserine 0.000 0.000 0.000
arginine 0.000 0.000 0.000
aspartic acid 0.005 0.010 0.011
carnosine 0.000 0.000 0.000
citrulline 0.000 0.000 0.016
cystathionine 0.001 0.008 0.011
cystine 0.013 0.021 0.045
ethanol amine 0.055 0.050 0.027
glutamic acid 0.000 0.000 0.000
glycine 0.001 0.001 0.000
histidine 0.000 0.000 0.000
hydroxy proline 0.000 0.000 0.000
hydroxylysine 0.001 0.000 0.000
isoleucine 0.011 0.030 0.063
leucine 0.000 0.000 0.000
lysine 0.006 0.000 0.000
methionine 0.000 0.001 0.000
ornithine 0.227 0.201 0.049
phenylalanine 0.002 0.000 0.013
phospho ethanol amine 0.025 0.031 0.048
phosphoserine 0.041 0.037 0.037
proline 0.014 0.000 0.000
sarcosine 0.025 0.015 0.000
serine 0.002 0.004 0.000
taurine 0.148 0.042 0.050
threonine 0.002 0.002 0.000
tyrosine 0.000 0.000 0.000
urea 0.799 0.758 1.016
valine 0.004 0.006 0.002
α-amino adipic acid 0.000 0.000 0.000
α-amino-n-butyric acid 0.006 0.006 0.013
β-alanine 0.011 0.008 0.016
β-amino isobutyric acid 0.009 0.003 0.008
γ-amino-n-butyric acid 0.019 0.010 0.003
표 6에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1에 비해 실시예 1에서 타우린(taurine), 사르코신(sarcosine), 오르니틴(ornithine), 프롤린(proline) 함량이 높게 나타났다.
[실험예 5] 콤부차의 항산화능 측정
실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTs 라디칼 소거능을 측정하여 그 결과를 표 7에 나타내었다. 구체적으로, DPPH 라디칼 소거능은 실시예 1 내지 2 및 비교예 1를 각각 10배로 희석하고 200 uL을 취하여 에탄올에 녹여 제조한 0.2 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 용액 800 uL를 첨가하여 혼합한 후 암소에서 20분간 반응시킨 뒤 microplate reader (Versa Max, Orleans, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도값을 측정하여 ascorbic acid 당량으로 나타냈다. ABTs 라디칼 소거능은 메탄올에 녹인 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 7.4 mM과 potassium persulphate 2.6 mM을 12시간 이상 암소에 방치하여 ABTS 양이온을 형성 시킨 후 이 용액을 735 nm에서 흡광도 값이 1.4-1.5가 되도록 증류수로 희석하고, 10배 희석 시료 100 uL 와 ABTS 용액 900 uL를 첨가하여 혼합한 뒤 암소에서 30분간 방치 후 microplate reader (Versa Max, Orleans, USA)를 사용하여 735 nm에서 측정 하여 ascorbic acid 당량으로 나타내었다.
항산화능
(μg ascorbic acid/mL)		 실시예 1 실시예 2 비교예 1
DPPH 라디칼 소거능 321±14 289±29 265±35
ABTs 라디칼 소거능 651±46 668±22 635±17
표 7에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1에 비해 실시예 1 및 2에서 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTs 라디칼 소거능이 우수하게 나타나 실시예 1 및 2가 높은 항산화 효과를 갖는 것을 알 수 있었다.
[실험예 7] 콤부차의 관능평가
실시예 1 내지 2 및 비교예 1에 대하여 관능평가를 진행하고 그 결과를 표 8 및 도 1에 나타내었다. 구체적으로, 관능평가는 전문 패널 15명을 대상으로 7점 척도법을 사용하여 색, 향, 신맛, 단맛, 전반적인 기호도의 5가지 평가항목으로 진행하였으며, 평가 항목의 선호도가 낮을수록 1점에 가깝고 선호도가 높을 수록 7점이 가깝도록 채점하게 하였다.
실시예 1 실시예 2 비교예 1
색 4.8 5.0 4.5
향 5.1 4.9 5.5
신맛 6.4 6.1 5.1
단맛 4.7 3.9 4.1
전반적 기호도 6.1 5.7 5.3
표 8 및 도 1의 결과에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1에 비해 실시예 1 및 2에서 관능평가의 점수가 전체적으로 높게 나타나 풍미가 우수함을 알 수 있었다.
[실험예 8] 초산-젖산 복합발효에 적합한 균주 선정
1. 에탄올 농도별 초산균의 생육 조사
Acetobacter pasteurianus sulloc(기탁번호: KCTC14928BP), Acetobacter tropicalis sulloc(기탁번호: KCTC14927BP), 및 Gluconobacter oxydan (KCTC2749)를 각각 2% 에탄올(AE broth)로 배양하고, 원심분리(4,000 x g, 4℃10 분)를 진행한 후 상등액을 확보하였다. 확보한 상등액 100 μL을 각각 3, 5, 및 7% 에탄올(AE broth)에 분주하였다. 그 후 30℃에서 72시간 동안 교반 배양하고, 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 660nm에서 흡광도 값을 측정하여 표 9에 나타내었다.
에탄올 농도 (%) A. pasteurianus A. tropicalis G. oxydan
3% 1.4957 1.4215 1.4687
5% 1.4878 1.2141 1.4127
7% 1.3984 1.2012 1.1546
3가지 균주 중 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP)의 에탄올 내성이 다른 초산균들보다 높아, 1차 발효에서 에탄올을 많이 생성하는 효모인 Saccharomyces cerevisiae JTL-L1(KCCM12008P)를 사용하므로, 상기 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP)를 2차 발효에 사용할 경우 가장 좋은 효과를 얻을 수 있다.
2. 온도별 초산균의 생육 조사
배양된 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP), Acetobacter tropicalis sulloc(KCTC14927BP), 및 Gluconobacter oxydan (KCTC2749)를 각각 100 μL씩 2% 에탄올(AE broth)에 분주하고, 각각 25℃30℃37℃및 42℃로 설정된 배양기에 120시간동안 배양하였다. 그 후 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 660nm에서 흡광도 값을 측정하였다(도 2). 도 2에 나타난 바와 같이, 3개의 균주 모두 온도별 생육이 일정한 것으로 나타나나, 특히 42℃온도 조건에서는 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP)가 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 토대로 상대적으로 온도가 높은 조건에서도 발효가 잘 일어난다는 것을 알 수 있다.
3. 초산균의 이화학(pH/TA) 분석 및 생균수 측정
Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP), Acetobacter tropicalis sulloc(KCTC14927BP), 및 Gluconobacter oxydan (KCTC2749)를 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P) 함께 2% 에탄올(AE broth)에 배양한 후, pH meter(TR.BP3001, Trans Instruments Pte Ltd, Singapore)로 pH를 측정하였고, TA는 pH가 8.4가 되도록 맞춘 양을 계산하여 측정하였다. 그 결과는 표 10 및 도 3에 나타내었다.
균주 일자 물리화학적 변화
pH TA (%) 생균수 (CFU/mL)
A. pasteurianus
+ L. plantarum 		0일차 5.60 0.24 1.0 X 107
1일차 3.70 10.42 2.0 X 107
2일차 3.48 14.98 2.4 X 107
3일차 3.49 15.00 2.3 X 107
4일차 3.52 15.33 2.8 X 107
A. tropicalis
+ L. plantarum 		0일차 5.60 0.24 1.0 X 107
1일차 3.87 6.95 2.0 X 107
2일차 3.40 13.90 1.9 X 107
3일차 3.29 15.72 2.2 X 107
4일차 3.29 14.59 2.3 X 107
G. oxydan
+ L. plantarum 		0일차 5.60 0.24 1.0 X 107
1일차 4.13 8.74 1.5 X 107
2일차 3.86 12.48 1.9 X 107
3일차 3.84 14.98 2.1 X 107
4일차 3.75 15.11 2.4 X 107
표 10 및 도 3에서 알 수 있듯이, pH 분석 결과 가장 낮은 값이 측정된 균은 Acetobacter tropicalis sulloc(KCTC14927BP)로 확인되었다. 반면, Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP)의 pH 값은 적정 수준이고, TA 값은 1일차부터 상승 폭이 가장 높으므로, 빠른 시간 내에 아세트산의 함량을 끌어올리는 특징이 있고, 따라서 콤부차 제조에 있어 최적의 균 조합이다. 또한, 초산-젖산 발효 공법을 활용하였을 때 공동배양으로 인한 성장 저해가 일어나지 않고 공생배양으로서 발효가 잘 일어난 것을 확인하였다.
[실시예 3 - 5] 콤부차의 제조 (초산 단독 2차 발효)
실시예 1과 동일한 방법으로 1차 발효액을 제조한 후, 상기 1차 발효액에 각각 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP), Acetobacter tropicalis sulloc(KCTC14927BP), Gluconobacter oxydan (KCTC2749)를 107 CFU/mL로 1% 단독 접종하였다. 외부 공기와 접촉이 되도록 호기성 조건을 형성하고 진탕배양기에서 200 rpm, 30℃조건에서 5일 동안 2차 발효한 후 진공여과 필터로 여과하여 콤부차를 제조하였다.
[실시예 6 - 7] 콤부차의 제조 (초산-젖산 복합 2차 발효)
실시예 1과 동일한 방법으로 1차 발효액을 제조한 뒤, 1차 발효액에 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP) 107 CFU/mL 및 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P) 106~7 CFU/mL를 각각 1%, 또는 Acetobacter tropicalis sulloc(KCTC14927BP) 107 CFU/mL 및 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P) 106~7 CFU/mL를 각각 1%로 접종하였다. 외부 공기와 접촉이 되도록 호기성 조건을 형성하고 진탕배양기에서 200 rpm, 30℃조건에서 5일 동안 2차 발효한 후 진공여과 필터로 여과하여 콤부차를 제조하였다.
실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7
1차발효 S. cerevisiae
L. plantarum
2차발효 A. pasteurianus A. tropicalis G. oxydan A. pasteurianus A. tropicalis
L. plantarum L. plantarum
[실험예 9] 콤부차의 유리 아미노산 분석
실시예 6 및 7 콤부차의 아미노산 분석은 아미노산 자동분석기인 L-8900 high-speed amino acid analyser (Hitachi, Japan)을 이용하여 수행하였다. 이동상은 PF-1, PF-2, PF-3, PF-4, PG-6, PF-RG, R-3, C-1, ninhydrin solution, buffer solution (Wako, Japan)을 사용하였으며, 분석 컬럼은 ion exchange column #2622SC PH (Hitachi, Japan)을 사용하였다. 유리 아미노산 표준물질은 type ANII와 type B (Wako, Japan)을 50:50(v/v)으로 혼합하여 사용하였다. 아미노산 분석 결과를 표 12에 나타내었다.
유리 아미노산 (g/L) 실시예 6 실시예 7
1-methylhistidine 0.000 0.000
3-methylhistidine 0.000 0.000
alanine* 0.000 0.024
ammonia 0.000 0.000
anserine 0.000 0.000
arginine* 0.000 0.000
aspartic acid* 0.000 0.000
Carnosine 0.000 0.000
Citrulline 0.000 0.000
cystathionine 0.000 0.000
cystine* 0.000 0.000
ethanol amine 0.000 0.062
glutamic acid* 0.000 0.000
glycine* 0.001 0.001
histidine* 0.000 0.000
hydroxy proline 0.000 0.000
hydroxylysine 0.000 0.000
isoleucine* 0.000 0.000
leucine* 0.000 0.000
lysine* 0.000 0.000
methionine* 0.000 0.000
Ornithine 0.470 0.370
phenylalanine* 0.000 0.000
phospho ethanol amine 0.000 0.000
phosphoserine 0.084 0.090
proline* 0.000 0.000
Sarcosine 0.260 0.000
serine* 0.000 0.000
taurine 0.172 0.210
threonine* 0.000 0.000
tyrosine* 0.000 0.000
urea 0.690 0.757
valine* 0.005 0.005
α-amino adipic acid 0.000 0.000
α-amino-n-butyric acid 0.000 0.000
β-alanine 0.006 0.006
β-amino isobutyric acid 0.000 0.000
γ-amino-n-butyric acid 0.000 0.000
초산-젖산 복합 발효공법을 적용한 두 균주 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP) 및 Acetobacter tropicalis sulloc(KCTC14927BP) 모두 오르니틴(ornithine), 타우린(taurine) 함량이 높게 나타났다. 이러한 결과는 유산균 복합 발효가 진행함에 따라 초산-젖산 두 균주의 생장 저해가 없었기 때문에 함량이 증가한 것으로 추정되며, 본 발명의 초산-젖산 2차 발효 공법의 균주의 조합을 구성하는데 있어 적합함을 알 수 있다.
[실험예 10] 콤부차의 유기산 분석
실시예 3 내지 7의 콤부차의 유기산 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, 1260 Infinity ⅡAgilent, Santa Clara United States)을 이용하여 수행하였다. 컬럼은 Hi-plex H(300x7.7mm)(Agilent, Santa Clara United States)를 사용하여 분리를 진행하였으며, 온도는 55 ℃로 설정하였다. 이동상은 5mM H2SO4를 사용하였고, 시료는 8μL를 주입하였으며, 0.6mL/min의 유속으로 진행하였다. 모든 피크는 210nm의 파장에서 검출하였으며, 이동상은 사용하기 전에 0.45 μm 필터(Millipore, Milford, MA, USA)를 통해 여과하고, 진공 하에 탈기하여 사용하였다. 유기산 분석 결과를 표 13에 나타내었다.
유기산 (g/L) 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7
Acetic acid 21.77 23.29 23.91 23.65 24.12
Propionic acid 2.74 3.56 3.85 0.72 0.94
Citric acid 0.16 0.21 0.09 1.33 0.53
Lactic acid 3.78 3.26 3.14 6.34 5.12
Malic acid 1.22 1.57 1.14 1.68 1.01
Succinic acid 0.45 0.53 0.48 0.57 0.51
표 13에서 알 수 있듯이, 초산 단독발효에 비해 초산-젖산 복합발효를 할 경우 유기산 생성이 유의적으로 높은 것을 알 수 있다. 이는 젖산균과 초산균이 대사한 유기물 함량이 초산균 단독 대사보다 많아 유기산 함량 증가한 것으로 추정된다.
[실험예 11] 초산균에 따른 관능 평가
실시예 3 내지 7에 대하여 관능평가를 진행하고 그 결과를 표 14 및 도 4에 나타내었다. 구체적으로, 관능평가는 전문 패널 15명을 대상으로 7점 척도법을 사용하여 색, 향, 신맛, 단맛, 전반적인 기호도의 5가지 평가항목으로 진행하였으며, 평가 항목의 선호도가 낮을수록 1점에 가깝고 선호도가 높을 수록 7점이 가깝도록 채점하게 하였다.
관능평가 항목 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7
색 5.4 5.1 5.2 5.7 5.5
향 5.1 4.9 5.0 6.3 5.8
신맛 5.3 5.7 4.9 5.5 5.9
단맛 5.2 5.2 4.9 6.1 5.7
전반적 기호도 5.6 5.5 5.5 6.0 5.8
표 14 및 도 4의 결과에서 확인할 수 있듯이, 초산균 단독 배양으로 제조한 실시예 3 내지 5를 비교할 때, 기존 Gluconobacter oxydan (KCTC2749)를 사용한 실시예 5 보다 실시예 3 및 실시예 4의 전반적인 기호도가 높은 것을 확인하였다. 또한, 초산-젖산 복합 발효를 이용해서 제조한 콤부차인 실시예 6가 초산 단독 발효를 한 실시예 3 내지 5 보다 깊은 바디감과 풍부한 풍미가 발현되었음을 확인하였다. 1차 발효에 콤부차 발효 중 핵심 과정인 알코올 생성능이 높은 Saccharomyces cerevisiae JTL-L1(KCCM12008P)를 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P)와 함께 복합 발효하고, 1차 발효에서 생성된 알코올에 대한 내성이 높은 Acetobacter pasteurianus sulloc(KCTC14928BP)을 Lactobacillus plantarum APsulloc 331261(KCCM11179P)와 함께 복합 발효함으로써 콤부차 최적의 균 조합 및 제조 공정을 확보하였다.
한국미생물보존센터(KCCM) KCCM12008P 20170404 한국미생물보존센터(KCCM) KCCM11179P 20110328 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14927BP 20220330 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14928BP 20220330

Claims (22)

  1. 차 추출물에 효모 및 유산균을 접종하여 발효하는 1차 발효 단계; 및
    1차 발효 단계의 발효물에 초산균을 접종하여 발효하는 2차 발효 단계를 포함하고,
    상기 효모는 기탁번호가 KCCM12008P인 사카로마이세스 세레비제 JTL-L1(Saccharomyces cerevisiae JTL-L1)을 포함하는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균주를 포함하고,
    상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 포함하는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 포함하고,
    상기 초산균은 글루코노박터(Gluconobacter) 속 균주 및 아세토박터(Acetobacter) 속 균주 중 어느 하나 이상을 포함하는, 콤부차의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 차 추출물은 녹차 추출물, 홍차 추출물 및 우롱차 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸은 기탁번호가 KCCM11179P인 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261(Lactobacillus plantarum APsulloc 331261)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 글루코노박터 속 균주는 글루코노박터 옥시단(Gluconobacter oxydan)을 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 아세토박터 속 균주는 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter troipicalis) 및 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 아세토박터 트로피칼리스는 기탁번호가 KCTC14927BP인 아세토박터 트로피칼리스 sulloc(Acetobacter tropicalis sulloc)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 아세토박터 파스테우리아누스는 기탁번호가 KCTC14928BP인 아세토박터 파스테우리아누스 sulloc (Acetobacter pasteurianus sulloc)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 1차 발효 단계는 25 내지 35℃에서 1 내지 5일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 2차 발효 단계는 25 내지 45℃에서 2 내지 13일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 1차 발효 단계 및 2차 발효 단계 중 어느 하나 이상이 교반 배양으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 2차 발효 단계에서 1차 발효 단계의 발효물에 상기 초산균과 함께 상기 유산균이 더 접종되는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 초산균은 글루코노박터 옥시단(Gluconobacter oxydan), 아세토박터 트로피칼리스(Acetobacter troipicalis) 및 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하고,
    상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 아세토박터 트로피칼리스는 기탁번호가 KCTC14927BP인 아세토박터 트로피칼리스 sulloc(Acetobacter tropicalis sulloc)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 아세토박터 파스테우리아누스는 기탁번호가 KCTC14928BP인 아세토박터 파스테우리아누스 sulloc (Acetobacter pasteurianus sulloc)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 유산균은 기탁번호가 KCCM11179P인 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261(Lactobacillus plantarum APsulloc 331261)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제1항, 제2항, 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 콤부차.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101815389B1 (ko) * 2016-08-16 2018-01-08 순천시(농업기술센터 소장) 신규 아세토박터 파스퇴리아누스 균주 및 이를 이용한 감 식초 제조 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101080322B1 (ko) * 2010-02-25 2011-11-08 경원대학교 산학협력단 신규한 초산균
KR101719197B1 (ko) 2011-06-10 2017-03-24 (주)아모레퍼시픽 차나무 잎에서 분리한 신규 락토바실러스 플란타룸
KR20190091162A (ko) * 2018-01-26 2019-08-05 (주)아모레퍼시픽 녹차잎 발효 추출물을 포함하는 피부 및 모발 상태 개선용 화장료 조성물
KR20200057328A (ko) * 2018-11-16 2020-05-26 김석중 홍삼 천연 발효식초의 제조방법
KR102176334B1 (ko) * 2018-12-03 2020-11-09 롯데칠성음료주식회사 콤부차 조성물 및 이의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101815389B1 (ko) * 2016-08-16 2018-01-08 순천시(농업기술센터 소장) 신규 아세토박터 파스퇴리아누스 균주 및 이를 이용한 감 식초 제조 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Leal, J.M., et al. CyTA - Journal of Food 16 (1):390-399(2018.02.12.)*
유수정 외 5명. 산업식품공학회지 25(2):118-124(2021.05.)*

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