JP4803391B2 - 機能性発酵茶及びその製造方法 - Google Patents
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Description
(1)茶葉を発酵させて4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを産生する受託番号FERM BP−11296として寄託されたアスペルギルス属に属する微生物株(PK−1)または受託番号FERM BP−11297として寄託されたユーロチウム属に属する微生物株(KA−1)を茶葉に接種して発酵し、4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを含有する後発酵茶葉を産生せしめることを特徴とする機能性発酵茶の製造方法。
(2)茶葉が、青殺後の茶葉、粗柔後の茶葉、柔稔後の茶葉、中柔後の茶葉、精柔後の茶葉、または荒茶から選ばれる上記(1)に記載の機能性発酵茶の製造方法。
(3)2-エチル-1-ヘキサノール、1-エテニル-4-メトキシベンゼン、または1-エテニル-3-メトキシベンゼンを含有する上記(1)または(2)のいずれか1項に記載の機能性発酵茶の製造方法。
(4)上記(1)から(3)のいずれか1項に記載の機能性発酵茶の製造方法により製造されたことを特徴とする機能性発酵茶。
(5)4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを含有する茶葉からなることを特徴とする上記(4)に記載の機能性発酵茶。
(6)2-エチル-1-ヘキサノール、1-エテニル-4-メトキシベンゼン、または1-エテニル-3-メトキシベンゼンを含有する上記(5)に記載の機能性発酵茶。
本発明は、アスペルギルス属またはユーロチウム属に属し、茶葉を発酵して4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを産生する微生物を茶葉に接種して発酵し、4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン(Benzene,4-ethenyl-1,2-dimethoxy)、アセトオイゲノール(Aceteugenol)、またはイソオイゲノール(Isoeugenol)を含有する後発酵茶葉を生成せしめる機能性発酵茶の製造方法、及びこの方法により製造された機能性発酵茶に関するものである。
本発明のアスペルギルス属に属するPK−1は、プーアル茶から採取した微生物であり、ユーロチウム属に属するKA−1は、かつお節から採取された微生物である。
A.微生物PK−1について
1.プーアル茶からの微生物の分離
抹茶1g、寒天2gと100mLの水からなる組成の培地を、121℃で20分間オートクレーブで殺菌して使用した。プーアル茶1gを無菌水10mLに入れて、生じた液の0.1mLを上記の平面培地に塗布した。次いで、30℃で72時間培養し、生じたコロニーを抹茶寒天斜面培地に分離し、保存し、この菌株をPK−1とした。
分離したPK−1を以下の条件で培養した菌株を供試菌体とした。
・培地 ポテトデキストロース寒天培地「ダイゴ」(日本製薬、東京)(PDA)
2% Malt Agar(MA)
Bacto Oatmeal Agar(Becton Dickinson,MD,USA)(OA)
LCA(三浦培地)(LCA)
・培養温度 25℃
・培養期間 1週間
2.1 巨視的観察結果
各培養平板において、1週間培養後から巨視的観察を行い、コロニーの直径・色調(コロニー表面及び裏面)・表面性状・可溶性色素産生の有無に関して記録した。その結果、培養1週間後の各平板は表2のような特徴が認められた。
(1)栄養菌糸
菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、無色から茶褐色、有隔壁菌糸の形成が認められた。
(2) 無性生殖器官
a)分生子頭及び柄
分生子頭は暗褐色から黒色、培養初期は球形、培養時間の経過に伴い、円柱形に分裂する形状が観察された。柄(分生子柄)は栄養菌糸から直立し、非分岐、無隔壁で、表面は平滑、無色からやや着色しているのが観察された。柄の先端部分が膨らみ頂嚢の形成が認められた。頂嚢は球形から亜球形の形状を示した。柄の基部にはL字型からT字型の柄足細胞の形成が認められた。
b)分生子形成細胞
頂嚢の全縁から円筒形のメトレが一列に並んで形成され、その先に分生子形状細胞であるフィアライドが形成される2列アスペルジラムの構造を示した。フィアライドは首の短いアンプル形状を示した。
c)分生子
分生子はフィアロ型分生子で、球形から亜球形、1細胞、表面は微棘状から粗面、無色から暗褐色であった。
(3) 有性生殖器官
約1カ月の培養検体からは有性生殖器官の形成は確認できなかった。
PK−1から得られた28SrDNA−D1/D2の塩基配列は子嚢菌類の一種であるAspergillus phoenicisの基準株NRRL4851株(アクセッション番号U28822)を含むA.phoenicisの塩基配列と100%の相同性を示した(表3参照)。得られた配列をもとに作製した系統樹においても、A.phenicis、A.tubingensis、A.awamori及びA.nigerと同一の系統枝を形成した(図11参照)。また、PK−1から得られたITS−5.8SrDNA塩基配列は、子嚢菌の一種であるAsperugillus phoenicis、A.tubingensis、A.awamori及びA.nigerなどの塩基配列と100%の相同性を示した。得られた配列をもとに作成した系統樹(図12参照)においても同一系統枝を形成した。以上2種のDNA塩基配列の結果から、検体はAspergillusに属するものと判断された。
一方、コロニー性状及び形態観察の結果、PK−1は黒色コロニーを形成し、頂嚢及びフィアロ型分生子を形成するなどAspergillus属の中でもAspergillus属Nigri節の特徴が観察された。
1.分離培地(MY20培地)
分離培地として、麦芽エキス寒天培地+20%スクロースを使用して培養した。
2.カツオカビの分離
MY20平面培地に、無菌水10mLに鰹節の切片1gを懸濁し、その上澄み液0.1mLをMY20分離培地に塗布した。これを25℃72時間培養して生じた菌株を分離し、MY20斜面培地に植え、これを5℃で保存した。
3.KA−1菌株の同定
生じたコロニーは20%スクロールMY培地上、25℃で速やかに広がり、しばしば不規則、14日培養後の直径は5〜7cm、平坦、純緑色〜灰緑色の分生子頭が幅広い帯状または斑点状に生じた。コロニーの裏面は褐色、子嚢果は多数形成し、黄色〜オレンジ赤色のゆるい網目状の菌糸に覆われ、球状〜亜球状、直径は75〜100μmであった。子嚢は球形〜亜球状、直径は10〜12μm、子嚢胞子はレンズ形、4.8〜5.6×4〜5.5μm、滑面、溝や隆起を欠いていた。分生子頭は灰緑色、放射状、直径は500〜1000μm、分生子はイガグリ状卵形〜亜球形、直径4.5〜7μmであった。
以上の観察結果から、KA−1菌株は、ユーロチウム属ヘルバリオラム(Eurotium herbariorum)であると同定した。
(1)新規な香り成分を有すると共に、新規な機能性物質を含有する後発酵茶を提供することができる。
(2)従来の後発酵茶では使用されることがなかった微生物により新規な後発酵茶を製造し提供することができる。
(3)鎮静作用を有する物質である、4-メチル-1,2ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを含む後発酵茶を製造し提供することができる。
(4)香気成分として、2-エチル-1-ヘキサノール、1-エテニル-4-メトキシベンゼン、1-エテニル-3-メトキシベンゼンを含有する新しい後発酵茶を製造し提供することができる。
(5)緑茶と比較して、没食子酸、エピカテキン、エピガロカテキンの含有量が増加し、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレートの含有量が減少した後発酵茶を製造し提供することができる。
(6)プーアル茶や3年黒茶と比較して、エピガロカテキン、エピカテキンの含有量が増加した組成を有する後発酵茶を製造し提供することができる。
(7)新しい成分を含有する後発酵茶を短期間で効率よく製造し提供することができる。
静岡市市清水区の茶園(やぶきた)から一番新芽を摘採し、標準製茶法に準じて蒸熱、粗揉、揉捻、中揉まで行った後、冷蔵庫(−20℃)に約500gずつ保存した。室温中で解凍した緑茶500gに、前培養したPK−1を50g混ぜ、数日中に一度撹拌しながら約25℃で、2週間と4週間培養した(処理1)。その後、一部を凍結乾燥し、カフェイン、カテキン類の分析に供した。残りは、冷凍保存して香りの分析に供した。
なお、前培養したPK−1とは、オートクレーブで121℃、15分間殺菌した中揉緑茶50gに、PK−1を種菌して、30℃で7日間培養したものである。
微粉砕した試料約25mgにアセトニトリル5mLを加え1時間振とう抽出後、ろ過しHPLCによる分析に供した。
カフェイン含有量は、微生物により発酵させても変化はなかった。しかし、没食子酸(gallic acid)は10倍以上と大きく増加し、エピカテキンガレート(epicatechin gallate)とエピガロカテキンガレート(epigallocatechin gallate)のガレート(gallate)類は減少した。黒麹菌を発酵させて作る中国の黒茶と同様に、本実験でも発酵課程中でガレート類が分解して没食子酸が生成したと推定された。また、没食子酸の生成量は、PK−1の添加量が少なく、長期間処理した方が高くなった。さらに、焙じた場合、没食子酸の含有量は大きく減少した。このことから、没食子酸量の増加はゆっくり・じっくり培養させる方が有効で、また乾燥温度を高くしない方が適していることが分かった。
1週間培養した試料は、一部凍結乾燥し、カフェイン及びカテキン類の分析に供した。2週間培養したものは、一部は乾燥機で乾燥し、残りは和紙の上で焙じた。それぞれ一部を凍結乾燥し、カフェイン、カテキン類の分析に供した。残りは保存し、香りの分析に供した。
香気成分の採取法:
スペルコ社製のSPME(マイクロ固相抽出法)を用いて、各茶葉約150mgをサンプル瓶に入れ、レンジで温めた超純水を約3mL加えた。1分後にSPMAをセットし、サンプル瓶を60℃の温湯に5分間つけながらSPMEによるヘッドスペース法にて香気成分を採取し、GC-MS分析に供した。SPMEファイバーは、膜圧100μmポリジメチルキロキサン(=PDMS、メチルシリコン)ファイバーを使用した。
分析条件:カラム;TC−1(無極性)
気化室温度:250℃
インターフェース温度:230℃
カラム温度:40℃−(10℃/min)−200℃−(40℃/min)−290℃(2min)
分析結果は、図6〜図10に示す。
1〜16:各グラフにおけるピークの番号を示し、各番号に対応する化合物は表1に示す。
Claims (6)
- 茶葉を発酵させて4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを産生する受託番号FERM BP−11296として寄託されたアスペルギルス属に属する微生物株(PK−1)または受託番号FERM BP−11297として寄託されたユーロチウム属に属する微生物株(KA−1)を茶葉に接種して発酵し、4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを含有する後発酵茶葉を産生せしめることを特徴とする機能性発酵茶の製造方法。
- 茶葉が、青殺後の茶葉、粗柔後の茶葉、柔稔後の茶葉、中柔後の茶葉、精柔後の茶葉、または荒茶から選ばれる請求項1に記載の機能性発酵茶の製造方法。
- 2-エチル-1-ヘキサノール、1-エテニル-4-メトキシベンゼン、または1-エテニル-3-メトキシベンゼンを含有する請求項1または2に記載の機能性発酵茶の製造方法。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の機能性発酵茶の製造方法により製造されたことを特徴とする機能性発酵茶。
- 4-エテニル-1,2-ジメトキシベンゼン、アセトオイゲノール、またはイソオイゲノールを含有する茶葉からなることを特徴とする請求項4に記載の機能性発酵茶。
- 2-エチル-1-ヘキサノール、1-エテニル-4-メトキシベンゼン、または1-エテニル-3-メトキシベンゼンを含有する請求項5に記載の機能性発酵茶。
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