CN111378642A - 一种微生物疏水包埋物、包埋用溶液及微生物疏水包埋制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物疏水包埋物、包埋用溶液及微生物疏水包埋制备方法,属于微生物包埋技术领域。该技术方案将微生物发酵液离心所收集菌泥为待包埋芯材,将该待包埋芯材形成固化定型的凝胶颗粒后,对该凝胶颗粒采用壳聚糖一次覆膜用溶液进行一次覆膜使微生物初始具备一定的隔水能力,再用隔水能力更强的乙基纤维素二次覆膜用溶液进行二次覆膜使微生物的隔水能力大大增强,该二次包覆技术有利于微生物在水溶液中长期高比例存活,且相较于其他包埋或不包埋微生物在体外人工胃酸和人工小肠液模拟环境下存活率也更高,适用于可耐受一定加工温度的所有微生物的二次覆膜,最终形成较大疏水隔水包埋物,可在各种液体环境中及存储期内长期高比例存活。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的包埋技术,尤其涉及一种微生物疏水包埋物、包埋用溶液及微生物疏水包埋制备方法,属于微生物包埋技术领域。
背景技术
人是由自身细胞和与其共生的微生物组成的一个超级生命体。人自身细胞编码的基因约为2.3万个,而仅仅人体肠道菌群编码的基因就约有300万个。人体的健康、认知、情感、精神事实上是由人自身编码基因和与共生微生物编码基因共同决定的。研究已经表明,仅仅肠道菌群就全面参与了人体相关物质代谢、免疫、信号通路等,控制人体70%的免疫细胞,90%的毒素排出、99%的营养吸收。近年以来,人们开始对自身共生微生物及其对人体健康影响的理解逐渐深刻,对人体共生微生物的研究成为学术前沿的热门课题。2018年初,国际知名学术期刊《CELL》、《Nature》和《Science》都同时刊发了微生物组学的专刊。而可以对人体共生微生物(尤其是肠道菌群)进行干预的益生菌产品在这样的背景下正在蓬勃发展。
益生菌制剂又叫微生态制剂。但目前这类产品的形态相对比较单一,主要集中在发酵乳制品和益生菌固体饮料这两大产品类型。限制微生态制剂产品种类的主要原因是,微生态制剂属于活菌制剂,当应用于很多产品类型时会因为加工工艺或者存储条件而失活;尤其是当应用于液体产品种类时,由于水的影响,大部分益生菌在存储期会大量死亡,死亡率甚至会高于99.9%。
因此,通过疏水(或者叫隔水)包埋技术将益生菌包裹,使益生菌与水环境在一定程度上隔离开来,有利于益生菌在液体中的长期存活,对将益生菌商业化应用于液体类产品中以便制造更多的健康食品具有重要意义。
现在已有不少对益生菌进行包埋的技术方案,但这些技术方案主要倾向于将益生菌包埋以帮助益生菌实现更好的人体胃酸和小肠液耐受或者将几种益生菌包埋在一起以实现益生菌共生,比如专利申请号为201610008369.6和201810787547.9的技术方案。还尚未出现能够很好的将微生物(尤其是益生菌)进行包埋后,其包埋物能够在各种液体环境中使用,且具有良好的疏水隔水性能,并在存储期长期高比例存活的技术方案。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种微生物疏水包埋物、包埋用溶液及微生物疏水包埋制备方法,其对微生物尤其是益生菌类微生物采用二次覆膜疏水包埋技术,可以实现微生物尤其是益生菌在液体产品中的长期存活。
本发明的技术方案是:
本发明公开了一种微生物疏水包埋制备方法,该制备方法包括下述主要步骤:
S1:将微生物发酵液通过离心装置进行离心后进行菌泥的收集,将收集到的菌泥作为待包埋芯材;
S2:将上述待包埋芯材与w/v浓度为0.5-6.0%的海藻酸钠溶液混合后,将该混合溶液滴入w/v浓度为1.0-3.0%的CaCl2溶液中反应生成凝胶颗粒,并接着将该凝胶颗粒固化定型30-60min;其中海藻酸钠溶液的w/v浓度优选为2.5%,CaCl2溶液的w/v浓度优选为2.0%;
S3:将经S2步骤处理后的凝胶颗粒经过滤、水洗后,与壳聚糖一次覆膜用溶液混合,并搅拌进行覆膜30-60min待覆膜完成后,再次经过滤、洗涤后,采用真空干燥技术得到干燥的一次覆膜微生物包埋物;其中真空干燥技术可采用真空冷冻干燥技术或常规真空干燥技术;
S4:将经S3步骤处理后的干燥的一次覆膜微生物包埋物置于包衣机内,在包衣机内使用乙基纤维素二次覆膜用溶液进行包衣处理,待包衣增重3-5wt.%后停止包衣动作,继续减速转动干燥10-15min后再自然晾干10-20h,得到最终的微生物疏水包埋物。
其进一步的技术方案是:
S1步骤中所述微生物发酵液包括用于食品的益生菌发酵液、农用微生物发酵液和饲料用微生物发酵液中的一种,本申请中该微生物发酵液优选为凝结芽孢杆菌发酵液。
其进一步的技术方案是:
S2步骤中所述待包埋芯材与海藻酸钠溶液的混合质量比例为1:(1-5),优选的混合质量比例为1:(1-2),尤其优选的混合质量比例为1:2。
其进一步的技术方案是:
S3步骤中所使用的壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.0-1.5wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为0.1-3.0%。其中乙酸溶液浓度优选为1.0wt.%,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度优选为1.2wt.%。
其进一步的技术方案是:
S4步骤中所使用的乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:1-5wt.%乙基纤维素、0.2-0.8wt.%聚乙二醇6000、0.1-3.0wt.%柠檬酸三乙酯、0.5-3.0wt.%滑石粉和余量乙醇。该组分组成优选为:2.5wt.%乙基纤维素、0.5wt.%聚乙二醇6000、1.0wt.%柠檬酸三乙酯、1.0wt.%滑石粉和余量乙醇。上述组成成分中,乙基纤维素起基础隔水作用;聚乙二醇6000使覆膜有小孔以便内含微生物(尤其是益生菌)的释放;柠檬酸三乙酯起增塑剂的作用;滑石粉起到防粘作用。
其进一步的技术方案是:
S4步骤中使用乙基纤维素二次覆膜用溶液进行包衣处理时,先将包衣机预热至25-35℃,优选预热至30℃,然后利用压缩气体喷枪将所述乙基纤维素二次覆膜用溶液充分雾化后喷入包衣机内与干燥的一次覆膜微生物包埋物旋转混合,带包衣满足增重要求后关闭喷枪,并降低包衣机转速利用包衣机内温度进行初步干燥。
本发明还公开了一种用于微生物疏水包埋制备方法的包埋覆膜用溶液,该溶液包括分开使用的用于一次覆膜的壳聚糖一次覆膜用溶液和用于二次覆膜的乙基纤维素二次覆膜用溶液。
其中所述壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.0-1.5wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为0.1-3.0wt.%;其中乙酸溶液浓度优选为1.0wt.%,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度优选为1.2wt.%。
其中所述乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:1-5wt.%乙基纤维素、0.2-0.8wt.%聚乙二醇6000、0.1-3.0wt.%柠檬酸三乙酯、0.5-3.0wt.%滑石粉和余量乙醇;该组分组成优选为:2.5wt.%乙基纤维素、0.5wt.%聚乙二醇6000、1.0wt.%柠檬酸三乙酯、1.0wt.%滑石粉和余量乙醇。上述组成成分中,乙基纤维素起基础隔水作用;聚乙二醇6000使覆膜有小孔以便内含微生物(尤其是益生菌)的释放;柠檬酸三乙酯起增塑剂的作用;滑石粉起到防粘作用。
本发明还公开了一种上述制备方法制备所得的微生物疏水包埋物,该包埋物包括微生物菌泥芯材、壳聚糖覆膜中间层和乙基纤维素覆膜外层,所述壳聚糖覆膜中间层覆膜于微生物菌泥芯材的外表面上,所述乙基纤维素覆膜外层覆膜于壳聚糖覆膜中间层的外表面上。
本发明的有益技术效果是:本发明给出了一种微生物尤其是益生菌的二次覆膜疏水包埋技术,可以实现微生物尤其是益生菌在液体产品中的长期存活。本发明利用壳聚糖一次覆膜用溶液使被包埋的微生物尤其是益生菌初始具备一定的隔水能力,再用隔水能力更强的乙基纤维素二次覆膜用溶液再次覆膜使包被包埋的微生物尤其是益生菌的隔水能力大大增强,有利于微生物在水溶液中长期高比例存活;并且相较于其他包埋或者不包埋的微生物在通过体外人工胃酸和人工小肠液的模拟环境下,存活率也更高。本发明适用于可耐受一定加工温度(0℃-90℃)的所有微生物进行二次覆膜,最终形成较大疏水和隔水的包埋物,这些经过包埋的微生物可以用于各种液体环境,在存储期长期高比例的存活。
附图说明
图1是本发明所述制备方法的技术路线流程图;
图2是本发明采用不同包埋技术对凝结芽孢杆菌的存储期活菌数的影响结果图;
图3是本发明具体实施例和对比例采用不同包埋技术对凝结芽孢杆菌经过人工胃液和小肠液存活率的影响结果图。
具体实施方式
为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述,以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
下面通过具体实施例对本发明进行详细描述。
具体实施例1:
采用下述制备方法和包埋覆膜用溶液进行本申请所述微生物疏水包埋物,其中微生物发酵液采用凝结芽孢杆菌发酵液。
S1:将凝结芽孢杆菌发酵液通过离心装置进行离心后进行菌泥的收集,将收集到的菌泥作为待包埋芯材;
S2:将上述待包埋芯材与w/v浓度为2.5%的海藻酸钠溶液按照混合质量比例为1:2混合后,将形成的混合溶液滴入w/v浓度为2.0%的CaCl2溶液中反应生成凝胶颗粒,并接着将该凝胶颗粒固化定型40min;
S3:将经S2步骤处理后的凝胶颗粒经过滤、水洗2-3遍后,与壳聚糖一次覆膜用溶液混合,并搅拌进行覆膜60min待覆膜完成后,再次经过滤、洗涤2-3遍后,采用真空冷冻干燥技术或常规真空干燥技术得到干燥的一次覆膜微生物包埋物,此时在待包埋芯材表面形成第一层覆膜;
其中所使用的壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.0wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为1.2%;
S4:将经S3步骤处理后的干燥的一次覆膜微生物包埋物置于包衣机内,将包衣机预热至30℃,然后利用压缩气体喷枪将乙基纤维素二次覆膜用溶液充分雾化后喷入包衣机内与上述干燥的一次覆膜微生物包埋物旋转混合进行包衣处理,待包衣增重3-5wt.%后停止包衣动作,关闭喷枪后,继续减速转动干燥10min后再自然晾干10-20h,得到最终的微生物疏水包埋物,此时在第一层覆膜上形成第二层覆膜;
其中所使用的乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:2.5wt.%乙基纤维素、0.5wt.%聚乙二醇6000、1.0wt.%柠檬酸三乙酯、1.0wt.%滑石粉和余量乙醇。
具体实施例2:
采用下述制备方法和包埋覆膜用溶液进行本申请所述微生物疏水包埋物,其中微生物发酵液采用凝结芽孢杆菌发酵液。
S1:将凝结芽孢杆菌发酵液通过离心装置进行离心后进行菌泥的收集,将收集到的菌泥作为待包埋芯材;
S2:将上述待包埋芯材与w/v浓度为3.0%的海藻酸钠溶液按照混合质量比例为1:3混合后,将形成的混合溶液滴入w/v浓度为1.5%的CaCl2溶液中反应生成凝胶颗粒,并接着将该凝胶颗粒固化定型60min;
S3:将经S2步骤处理后的凝胶颗粒经过滤、水洗2-3遍后,与壳聚糖一次覆膜用溶液混合,并搅拌进行覆膜40min待覆膜完成后,再次经过滤、洗涤2-3遍后,采用真空冷冻干燥技术或常规真空干燥技术得到干燥的一次覆膜微生物包埋物,此时在待包埋芯材表面形成第一层覆膜;
其中所使用的壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.5wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为2.0%;
S4:将经S3步骤处理后的干燥的一次覆膜微生物包埋物置于包衣机内,将包衣机预热至32℃,然后利用压缩气体喷枪将乙基纤维素二次覆膜用溶液充分雾化后喷入包衣机内与上述干燥的一次覆膜微生物包埋物旋转混合进行包衣处理,待包衣增重3-5wt.%后停止包衣动作,关闭喷枪后,继续减速转动干燥15min后再自然晾干10-20h,得到最终的微生物疏水包埋物,此时在第一层覆膜上形成第二层覆膜;
其中所使用的乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:3.0wt.%乙基纤维素、0.8wt.%聚乙二醇6000、1.4wt.%柠檬酸三乙酯、0.8wt.%滑石粉和余量乙醇。
具体实施例3:
采用下述制备方法和包埋覆膜用溶液进行本申请所述微生物疏水包埋物,其中微生物发酵液采用凝结芽孢杆菌发酵液。
S1:将凝结芽孢杆菌发酵液通过离心装置进行离心后进行菌泥的收集,将收集到的菌泥作为待包埋芯材;
S2:将上述待包埋芯材与w/v浓度为2.0%的海藻酸钠溶液按照混合质量比例为1:2.5混合后,将形成的混合溶液滴入w/v浓度为3%的CaCl2溶液中反应生成凝胶颗粒,并接着将该凝胶颗粒固化定型45min;
S3:将经S2步骤处理后的凝胶颗粒经过滤、水洗2-3遍后,与壳聚糖一次覆膜用溶液混合,并搅拌进行覆膜50min待覆膜完成后,再次经过滤、洗涤2-3遍后,采用真空冷冻干燥技术或常规真空干燥技术得到干燥的一次覆膜微生物包埋物,此时在待包埋芯材表面形成第一层覆膜;
其中所使用的壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.2wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为1.8%;
S4:将经S3步骤处理后的干燥的一次覆膜微生物包埋物置于包衣机内,将包衣机预热至30℃,然后利用压缩气体喷枪将乙基纤维素二次覆膜用溶液充分雾化后喷入包衣机内与上述干燥的一次覆膜微生物包埋物旋转混合进行包衣处理,待包衣增重3-5wt.%后停止包衣动作,关闭喷枪后,继续减速转动干燥10min后再自然晾干10-20h,得到最终的微生物疏水包埋物,此时在第一层覆膜上形成第二层覆膜;
其中所使用的乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:2.0wt.%乙基纤维素、0.5wt.%聚乙二醇6000、1.6wt.%柠檬酸三乙酯、1.2wt.%滑石粉和余量乙醇。
以下以具体实施例1制备所得的微生物疏水包埋物与空白对照例、进行一层覆膜的微生物疏水包埋物进行存储期内活菌存活性能对比。
空白对照例:将凝结芽孢杆菌不经任何包埋处理配置于含果葡糖浆10g、葡萄汁10ml、低聚果糖10g、水苏糖10g、山梨糖醇10g和纯水500mL的营养溶液中,经过长期常温存储,其中不经任何包埋处理的凝结芽孢杆菌的数量为200亿。
一次覆膜微生物疏水包埋物具体例:将经具体实施例1中S1、S2和S3步骤制备得到的干燥的一次覆膜微生物包埋物,配置于含果葡糖浆10g、葡萄汁10ml、低聚果糖10g、水苏糖10g、山梨糖醇10g和纯水500mL的营养溶液中,经过长期常温存储,其中被一次包埋的凝结芽孢杆菌的数量为200亿。
二次覆膜微生物疏水包埋物具体例:将具体实施例1制备所得的微生物疏水包埋物,配置于含果葡糖浆10g、葡萄汁10ml、低聚果糖10g、水苏糖10g、山梨糖醇10g和纯水500mL的营养溶液中,经过长期常温存储,其中被二次包埋的凝结芽孢杆菌的数量为200亿。
上述采用不同包埋技术对凝结芽孢杆菌的存储期活菌数的影响结果参见附图2中所示。结果表明,与不做任何处理的空白对照例相比,经过一次包埋和二次包埋的凝结芽孢杆菌在存储期内的活菌下降率明显下降。当常温保存至240天时,采用一层覆膜包埋的活菌含量比空白对照例高12倍,而采用二层覆膜包埋的活菌含量比空白对照例高约26倍,说明采用本申请所述二次包埋覆膜技术所包埋的益生菌的确能在储存期隔绝水分,大大提高益生菌在存储期内的存活比例。
以下以具体实施例1制备所得的微生物疏水包埋物与空白对照例经过不同液体环境存活率对比。
空白对照例:参见前述空白对照例。
二次覆膜微生物疏水包埋物具体例:参见前述二次覆膜微生物疏水包埋物具体例。
将上述空白对照例和二次覆膜微生物疏水包埋物具体例连续通过人工胃酸(pH2.0,加胃蛋白酶)3小时和人工小肠液(pH6.8,加胰蛋白酶和胆盐)3小时,进行活菌存活率测定。
上述采用不同包埋技术对凝结芽孢杆菌经过人工胃液和小肠液存活率的影响结果参见附图中所示。结果表明,将凝结芽孢杆菌进行二次覆膜以后,连续通过人工胃酸(pH2.0,加胃蛋白酶)3小时和人工小肠液(pH6.8,加胰蛋白酶和胆盐)3小时,活菌存活率达到92%,比空白对照例高了约41%,说明采用本申请所述二次包埋覆膜技术所包埋的凝结芽孢杆菌更加有利于凝结芽孢杆菌经过胃酸和小肠液存活。
本发明给出了一种微生物尤其是益生菌的二次覆膜疏水包埋技术,可以实现微生物尤其是益生菌在液体产品中的长期存活。本发明利用壳聚糖一次覆膜用溶液使被包埋的微生物尤其是益生菌初始具备一定的隔水能力,再用隔水能力更强的乙基纤维素二次覆膜用溶液再次覆膜使包被包埋的微生物尤其是益生菌的隔水能力大大增强,有利于微生物在水溶液中长期高比例存活;并且相较于其他包埋或者不包埋的微生物在通过体外人工胃酸和人工小肠液的模拟环境下,存活率也更高。本发明适用于可耐受一定加工温度(0℃-90℃)的所有微生物进行二次覆膜,最终形成较大疏水和隔水的包埋物,这些经过包埋的微生物可以用于各种液体环境,在存储期长期高比例的存活。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种微生物疏水包埋制备方法,其特征在于,包括下述主要步骤:
S1:将微生物发酵液通过离心装置进行离心后进行菌泥的收集,将收集到的菌泥作为待包埋芯材;
S2:将上述待包埋芯材与w/v浓度为0.5-6.0%的海藻酸钠溶液混合后,将该混合溶液滴入w/v浓度为1.0-3.0%的CaCl2溶液中反应生成凝胶颗粒,并接着将该凝胶颗粒固化定型30-60min;
S3:将经S2步骤处理后的凝胶颗粒经过滤、水洗后,与壳聚糖一次覆膜用溶液混合,并搅拌进行覆膜30-60min待覆膜完成后,再次经过滤、洗涤后,采用真空干燥技术得到干燥的一次覆膜微生物包埋物;
S4:将经S3步骤处理后的干燥的一次覆膜微生物包埋物置于包衣机内,在包衣机内使用乙基纤维素二次覆膜用溶液进行包衣处理,待包衣增重3-5wt.%后停止包衣动作,继续低速转动干燥10-15min后再自然晾干10-20h,得到最终的微生物疏水包埋物。
2.根据权利要求1所述的微生物疏水包埋制备方法,其特征在于,S1步骤中所述微生物发酵液包括用于食品的益生菌发酵液、农用微生物发酵液和饲料用微生物发酵液中的一种。
3.根据权利要求2所述的微生物疏水包埋制备方法,其特征在于,S1步骤中所述微生物发酵液为凝结芽孢杆菌发酵液。
4.根据权利要求1所述的微生物疏水包埋制备方法,其特征在于,S2步骤中所述待包埋芯材与海藻酸钠溶液的混合质量比例为1:(1-5)。
5.根据权利要求1所述的微生物疏水包埋制备方法,其特征在于,S3步骤中所使用的壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.0-1.5wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为0.1-3.0%。
6.根据权利要求1所述的微生物疏水包埋制备方法,其特征在于,S4步骤中所使用的乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:1-5wt.%乙基纤维素、0.2-0.8wt.%聚乙二醇6000、0.1-3.0wt.%柠檬酸三乙酯、0.5-3.0wt.%滑石粉和余量乙醇。
7.根据权利要求1所述的微生物疏水包埋制备方法,其特征在于,S4步骤中使用乙基纤维素二次覆膜用溶液进行包衣处理时,先将包衣机预热至25-35℃,然后利用压缩气体喷枪将所述乙基纤维素二次覆膜用溶液充分雾化后喷入包衣机内与干燥的一次覆膜微生物包埋物旋转混合,带包衣满足增重要求后关闭喷枪,并降低包衣机转速利用包衣机内温度进行初步干燥。
8.一种用于微生物疏水包埋制备方法的包埋覆膜用溶液,其特征在于,包括分开使用的壳聚糖一次覆膜用溶液和乙基纤维素二次覆膜用溶液,
其中所述壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.0-1.5wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为0.1-3.0wt.%;
其中所述乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:1-5wt.%乙基纤维素、0.2-0.8wt.%聚乙二醇6000、0.1-3.0wt.%柠檬酸三乙酯、0.5-3.0wt.%滑石粉和余量乙醇。
9.根据权利要求8所述的用于微生物疏水包埋制备方法的包埋覆膜用溶液,其特征在于,
所述壳聚糖一次覆膜用溶液由壳聚糖与1.0wt.%的乙酸溶液混合形成,所形成的壳聚糖一次覆膜用溶液的w/v浓度为1.2wt.%;
所述乙基纤维素二次覆膜用溶液主要由按该溶液总质量百分比计的下述组分组成:2.5wt.%乙基纤维素、0.5wt.%聚乙二醇6000、1.0wt.%柠檬酸三乙酯、1.0wt.%滑石粉和余量乙醇。
10.一种权利要求1至7中任一权利要求所述制备方法制备所得的微生物疏水包埋物,其特征在于,包括微生物菌泥芯材、壳聚糖覆膜中间层和乙基纤维素覆膜外层,所述壳聚糖覆膜中间层覆膜于微生物菌泥芯材的外表面上,所述乙基纤维素覆膜外层覆膜于壳聚糖覆膜中间层的外表面上。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200707 |
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