CN106421781A - 肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种具有增强仔猪和肉鸡的机体免疫力、抗菌、杀菌功效的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，从猪血中分离白细胞，从分离的白细胞中通过利息破碎粗提抗菌肽，将抗菌肽用凝胶过滤层析纯化；将抗凝血离心得到血浆，通过盐析，纯化，得到免疫球蛋白；将抗菌肽和免疫球蛋白干粉混合制得微胶囊，再将微胶囊通过肠溶包衣液在微胶囊颗粒表面形成肠溶包衣缓释层，制成肠溶微丸，本发明不仅能够显著提高动物血清中IgG含量，增强仔猪机体免疫力，降低发病率，提高动物的生产性能，而且解决了由于胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶降低药物药效和生物利用度的问题，从而使药物吸收效果更好。

Description

肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种具有增强动物的机体免疫力、抗菌、杀菌功效的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法。

背景技术

我国是第一养殖业大国，第一动物保健品消费国，但与发达国家相比，兽用免疫增强剂产业落后，稳定高效、无残留、无污染的新型免疫增强剂的研制及产业化符合绿色食品、绿色生产的发展趋势，对健康畜牧具有重要意义。

针对目前我国兽用免疫增强剂的现状，项目组从屠宰场废弃猪血液中性粒细胞中分离提取出小分子抗菌肽，从猪血浆分离纯化免疫球蛋白，利用现代动物生物集成技术，在整体水平、细胞水平及分子水平上，根据不同免疫增强剂作用机制的差异，研究它们之间的协同效应，优化免疫增强剂配方，开发了抗菌肽-免疫球蛋白二联免疫增强剂，发挥两者的协同效应，从直接补充特异性抗体、促进免疫器官发育、激活免疫细胞增强细胞免疫和体液免疫、诱导产生各种细胞因子等多个方面全方位增强动物的机体免疫力提供技术保障。

抗菌肽是在诱导的条件下，动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质。抗菌肽产品具广谱抗菌作用，杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，同时抗菌肽还具有高效的抗真菌和抗病毒、抗肿瘤活性。免疫球蛋白含有大量特异性抗体，可与相应的抗原结合，凝集与沉淀抗原物质，防止病原微生物对机体细胞的侵袭，免疫球蛋白还可与抗原结合后能激活补体，进而产生一系列免疫调节作用，发挥具有免疫效应的细胞对病原微生物的吞噬、溶解和杀灭作用，显著增强机体抗病能力。正是基于这种增强免疫机理的差异以及动物的生理特点，将抗菌肽和免疫球蛋白进行合理搭配，开发出具有稳定、高效、无毒和无残留的肠溶兽用二联免疫增强剂，充分发挥两者的协同效应。此外，现有的兽用二联免疫增强剂大多因药性而带有刺激性，同时制剂往往会因胃液或者酶的作用而失效，药物的有效成分不能在胃肠道中定位释放，不仅降低了药物的生物利用度，而且造成了药物的浪费。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足而发明的一种具有增强动物的机体免疫力、抗菌、杀菌功效的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法。

本发明是这样实现的：一种肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1）抗菌肽的制备：

1.1从猪血中分离白细胞

将混合均匀的干净血液放置到无菌容器中，然后在4℃、4000rpm/min的条件下下离心10min，此时无菌容器内的变成悬液，此时悬液分为上、中、下三层，收获中间层，并将中间层放置在另一个无菌容器中，在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，然后再在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，所剩沉淀即为白细胞。

1.2抗菌肽的粗提

将步骤1.1中的产物放置在超声波细胞粉碎仪中破碎，破碎的条件为功率200W、破碎30s、间歇30s，共三十次，将破碎后的产物在4℃、12000rpm/min的条件下高速冷冻离心30min，收集底层沉淀，该沉淀即为中性颗粒细胞内的颗粒组分；将沉淀中加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10～12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液在4℃条件下保存，将沉淀中再次加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10～12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液，将两次收集的上清溶液置于55℃～60℃的条件下加热，以去除溶液中的乙酸，直至水分全部蒸发，收集干物质，所得的干物质即为抗菌肽粗提物。

1.3抗菌肽的凝胶过滤层析纯化

取Superdex 30 pg凝胶10g与去离子水100ml混匀、溶涨、洗涤后装柱待用；将抗菌肽粗提物溶于醋酸钠溶液中，平衡后将抗菌肽粗提物溶液缓慢流入柱内，尽量避免冲击凝胶，用乙酸钠洗脱，以0.2mol/L乙酸钠溶液为参照，用紫外检测仪检测其OD 280处的吸光值，收集各吸收峰，经抗菌活性检测，具有抑菌作用的吸收峰含有目的抗菌肽，将此洗脱液冷冻干燥后保存备用。

步骤2）免疫球蛋白的制备：

2.1分离血浆

将抗凝血在4000 rpm/min的条件下离心15min，获得沉降的血细胞和上清液，其中上清液为血浆。

2.2盐析

取上清液，向上清液中加入PBS缓冲液使得混合后的溶液体积至1L，混匀后加入固体硫酸铵和PBS缓冲液，边加边搅拌使硫酸铵饱和度达到20%，室温静置30min；然后在4℃ 4000r/min的条件下离心15 min，弃沉淀收集上清液。

2.3免疫球蛋白的分离

向2.2收集的上清液加入固体硫酸铵，使溶液硫酸铵饱和度达到50%，静置30min，然后在4℃ 5000 rpm/min的条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为免疫球蛋白粗品。

2.4除盐

用PBS缓冲液溶解免疫球蛋白粗品，装入透析袋，在4℃的条件下透析一天，得到脱盐后的免疫球蛋白粗品。

2.5DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白

活化处理DEAE-纤维素后装柱，用吸管将已脱盐的免疫球蛋白粗品沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床；用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的免疫球蛋白，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，并置于-20℃保存。

步骤3）配置肠溶兽用二联免疫增强剂

将抗菌肽和免疫球蛋白分别低温真空干燥后，制成干粉，将两者按1：2合并，充分混合均匀，并加入辅料甘氨酸、蔗糖和甘露醇，各种辅料按照质量分数的添加量分别为氨酸添加量4%，蔗糖添加量3%，甘露醇添加量3%。

进一步优化，在“1.2抗菌肽的粗提”中所用乙酸溶液的密度为9％。

进一步优化，在“2.2盐析”中所用PBS缓冲液为1mol/L,PH=7。

更进一步优化，步骤3）配置二联免疫增强剂的步骤还包括：将除菌的海藻酸钠溶液充分溶胀至无气泡，按1：3的芯壁材比例包埋步骤3）中所得的二联免疫增强剂，充分溶解并缓慢搅拌10小时，使其均匀；将脱气后的均匀混合液体通过内径约为 0.8 mm 的硅胶管，通过恒流泵以每分钟 60 滴的速度滴入到2℅体积分数的CaCl2 溶液中即成白色球形颗粒，在CaCl2 溶液中缓慢持续搅拌2h，成型固化成球状，强球状颗粒转至0.5℅体积分数的壳聚糖溶液中覆膜30分钟，收集后生理盐水洗涤，干燥5—6h，收获微胶囊颗粒，将制得的微胶囊置于流化床包衣机中进行肠溶包衣，通过肠溶包衣液在微胶囊颗粒表面形成肠溶包衣缓释层，制成微丸，流化床进风温度控制在50～60℃，物料温度控制在30～35℃进行包衣，微丸成品水分控制在2%-5%之间，粒度在60～80目之间。

更进一步优化，所述的肠溶包衣液是将成膜剂、增塑剂、分散剂、抗黏剂加入到90%的乙醇溶液中，通过均质机20000r/min均质10min配制而成，其中，成膜剂由羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯（5%～10%）或聚丙烯酸树脂II（3%～5%）构成，增塑剂由聚乙二醇（1%～2%）、柠檬酸三乙酯（1%～2%）、单硬脂酸甘油酯（0.5%～2%）中的一种或两种构成，分散剂由聚山梨酯-80（1%～3%）构成，抗黏剂由滑石粉（1%～2%）构成。

本发明具有以下优点：

通过本方法制备的产品中抗菌肽和免疫球蛋白的原材料来自于屠宰场排放的大量废弃猪血液，将猪的废弃物转变为价值较高的生物制品，降低了生产成本，解决了屠宰场对环境的污染问题；同时，项目产品针对动物易感染病原微生物而引起的腹泻，具有增强免疫功能外，还具有高效的抗菌、杀菌功能且不产生耐药性，可作为抗生素等药物理想替代品，为解决细菌耐药性和畜禽药物残留等问题提供了指导兽医临床科学、合理地使用的兽药，促进畜牧业的健康发展的新思路。

抗菌肽是在诱导的条件下，动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质。抗菌肽产品具广谱抗菌作用，杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，同时抗菌肽还具有高效的抗真菌和抗病毒、抗肿瘤活性。免疫球蛋白含有大量特异性抗体，可与相应的抗原结合，凝集与沉淀抗原物质，防止病原微生物对机体细胞的侵袭，免疫球蛋白还可与抗原结合后能激活补体，进而产生一系列免疫调节作用，发挥具有免疫效应的细胞对病原微生物的吞噬、溶解和杀灭作用，显著增强机体抗病能力。正是基于这种增强免疫机理的差异以及动物的生理特点，由于胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解肽类物质和大量蛋白质，为提高本制剂口服吸收的生物利用度，本发明将抗菌肽和免疫球蛋白进行合理搭配，开发出具有稳定、高效、无毒和无残留的肠溶兽用二联免疫增强剂，充分发挥两者的协同效应。

使用本发明制备出的肠溶兽用二联免疫增强剂能够显著提高动物血清中IgG含量，增强机体免疫力，降低发病率，提高动物的生产性能。

此外，本发明兽用二联免疫增强剂通过肠溶包衣，肠溶包衣缓释层对制剂的有效成分起到了保护作用，避免了药物进入胃中被破坏，同时可以使药物在胃肠道中定位释放，吸收效果更好。

具体实施方式

实施例1：

一种肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1）抗菌肽的制备：

1.1从猪血中分离白细胞

轻轻摇动三角瓶，将混合均匀的血液用多层无菌纱布过滤杂质至无菌烧杯中，将滤过血液在4℃ 4000rpm/min离心10min，此时可见离心管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层，收获中间层白细胞，移入另一个清洁的试管中，加入PBS溶液，轻轻混匀，4℃ 2000rpm/min离心20min，弃上清，重复两次，取少量沉淀镜检观察，确定为白细胞。

1.2抗菌肽的粗提

将步骤1.1中的产物放置在超声波细胞粉碎仪中破碎，破碎的条件为功率200W、破碎30s、间歇30s，共三十次，将破碎后的产物在4℃、12000rpm/min的条件下高速冷冻离心30min，收集底层沉淀，该沉淀即为中性颗粒细胞内的颗粒组分。

将沉淀中加入浓度为9％的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液在4℃条件下保存，将沉淀中再次加入浓度为9％的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10～12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液，将两次收集的上清溶液置于60℃的条件下加热，以去除溶液中的乙酸，直至水分全部蒸发，收集干物质，所得的干物质即为抗菌肽粗提物，经抗菌活性检测后在4℃保存备用。

1.3抗菌肽的凝胶过滤层析纯化

取Superdex 30 pg凝胶10g与去离子水100ml混匀、溶涨、洗涤后装柱待用；将抗菌肽粗提物溶于醋酸钠溶液中，平衡后将抗菌肽粗提物溶液缓慢流入柱内，尽量避免冲击凝胶，用乙酸钠洗脱，以0.2mol/L乙酸钠溶液为参照，用紫外检测仪检测其OD280处的吸光值，收集各吸收峰，经抗菌活性检测，具有抑菌作用的吸收峰含有目的抗菌肽，将此洗脱液冷冻干燥后保存备用。

步骤2）免疫球蛋白的制备：

2.1分离血浆：将抗凝血于4000 rpm/min离心15min，沉降血细胞，上清液即为血浆；

2.2盐析：向血浆中加入PBS缓冲液，其中PBS缓冲液为0.1mol/L，pH=7.0，补足1L，混匀后加入固体硫酸铵和PBS缓冲液，边加边搅拌使硫酸铵饱和度达到20﹪，室温静置30min；然后在4℃ 4000 r/min的条件下离心15 min，弃沉淀收集上清液，上清液中含清蛋白、球蛋白。

2.3免疫球蛋白的分离：向2.2收集的上清液加入固体硫酸铵，此时溶液硫酸铵饱和度达到50%，然后在4℃ 5000 rpm/min的条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为免疫球蛋白粗品。

2.4除盐：用PBS缓冲液溶解免疫球蛋白粗品，装入透析袋，在4℃的条件下透析一天，得到脱盐后的免疫球蛋白粗品。

2.5DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白：活化处理DEAE-纤维素后装柱，用吸管将已脱盐的免疫球蛋白沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床。用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的免疫球蛋白，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，并置于-20℃保存。

2.6纯度测定：取纯化的免疫球蛋白电泳检测；并测定浓度。

步骤3）配置二联免疫增强剂

3.1两者的混合：将抗菌肽和免疫球蛋白分别低温真空干燥后，制成干粉，将两者按1：2合并，充分混合均匀，并加入辅料甘氨酸、蔗糖和甘露醇，各种辅料按照质量分数的添加量分别为氨酸添加量4%，蔗糖添加量3%，甘露醇添加量3%。

3.2微胶囊的制备：利用微球可提高药物的稳定性，对药物有缓释及靶向作用的特点，将除菌的海藻酸钠溶液充分溶胀至无气泡，按1：3的芯壁材比例包埋步骤3.1中的产物，充分溶解并缓慢搅拌10小时，使其均匀。将脱气后的均匀混合液体通过内径约为 0.8 mm的硅胶管，通过恒流泵以每分钟 60 滴的速度滴入到2℅体积分数的CaCl2 溶液中即成白色球形颗粒。

3.3微胶囊固化：在洁净状态下2℅体积分数的CaCl2 溶液中缓慢持续搅拌2h，成型固化成球状。

3.4肠溶微丸制备：将制得的微胶囊置于流化床包衣机中进行肠溶包衣，通过肠溶包衣液在微胶囊颗粒表面形成肠溶包衣缓释层，制成肠溶微丸。

3.4.1肠溶包衣液的配制：肠溶包衣液是将成膜剂、增塑剂、分散剂、抗黏剂加入到90%的乙醇溶液中，通过均质机20000r/min均质10min配制而成，其中，成膜剂由羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯（5%～10%）或聚丙烯酸树脂II（3%～5%）构成，增塑剂由聚乙二醇（1%～2%）、柠檬酸三乙酯（1%～2%）、单硬脂酸甘油酯（0.5%～2%）中的一种或两种构成，分散剂由聚山梨酯-80（1%～3%）构成，抗黏剂由滑石粉（1%～2%）构成。

3.4.2包衣：流化床进风温度控制在50～60℃，物料温度控制在30～35℃进行包衣，微丸成品水分控制在2%-5%之间，粒度在60～80目之间。

实施例2

4.肠溶兽用二联免疫增强剂对动物生产性能的影响

4.1 试验材料

按照实施例1中的方法所生产的肠溶兽用二联免疫增强剂。

试验时间及地点： 2015年08月10日至10月23日在孟州市某养鸡场进行。

试验动物及管理：所有肉鸡日常管理相同，环境条件一致。

4.2 试验设计

试验分组方案设计如下表所示：

表1 试验分组方案设计

组别	处理组设置	处理方式（添加剂的使用时间和添加水平）
			对照	空白对照	饲喂基础日粮
1	抗菌肽实验组	8日龄开始添加抗菌肽，连续饲喂
			2	免疫球蛋白实验组	8日龄开始添加免疫球蛋白，连续饲喂
3	肠溶兽用二联免疫增强剂使用实验组	8日龄开始添加肠溶兽用二联免疫增强剂制剂，连续饲喂

本试验采用单因子完全随机化试验设计，将7日龄健康肉鸡120只，平均分4个处理组，每处理组设3个重复，每个重复10只鸡。其中，在常规日粮基础上，各试验组采用拌料的方式分别添加质量分数1℅的抗菌肽、免疫球蛋白和二联免疫增强剂。3种处理的试验方案设计，见表1。

试验期记录各组肉鸡每周的耗料量和体重，计算统计每周耗料量和料重比。

21 日龄、35日龄分别从各处理组中随机选取10只鸡，翅静脉采血，分离血清。选用免疫透射比浊法试剂盒，测定血清中IgG、IgM 以及补体 C3、C4含量。

采用SPSS软件进行统计分析，数据用平均值±标准误(X±sE)表示。

4.3 试验结果

（1）肠溶兽用二联免疫增强剂对肉鸡生产性能的影响

日粮中添加二联免疫增强剂对肉鸡每周料重比影响结果见表2。可以看出，8～14日、15～21日和22～28 日龄，添加二联制剂组料重比显著低于实验1、2组，差异显著（P＜0.05）。

表2不同处理组肉鸡料重比

注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），同列肩标小写字母相同表示差异不显著（P＞0.05）

（2） 肠溶兽用二联免疫增强剂对血清中IgG、IgM、C3、C4水平的影响

表3中可看出，35日龄时，第3组血清 IgG 水平、IgM 水平水平显著高于对照组和1、2组（P＜0.05），第1、2、3组血清补体 C3水平明显高于对照组。而二联免疫增强剂对C4水平并没有显著影响(P＞0.05)。

表3 二联制剂对肉鸡抗体和补体水平的影晌

项目	对照	第1组	第2组	第3组
					IgG	1.786±0.06 a	1.865±0.04 a	1.823±0.03 a	1.988±0.03 b
IgM	1.893±0.03 a	2.094±0.02 a	1.806±0.04 a	2.097±0.04 b
					C3	0.719±0.02 a	0.820±0.06 b	0.819±0.05 b	0.833±0.02 b
C4	0.420±0.04 a	0.423±0.02 a	0.423±0.02 a	0.418±0.02 a

（3） 结论与讨论

试验结果表明，肠溶兽用二联免疫增强剂具有较强的免疫增强功能，解决了由于胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解肽类物质和大量蛋白质，降低生物利用度的问题，不仅能显著提高肉鸡的日增重，而且还有助于提高肉鸡血清中IgG 的含量，增强机体免疫力，使药物吸收效果更好，为降低动物的死淘率，提高生产性能创造了条件。

上述实例仅为本发明的优选实例而已，并不用以限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1）抗菌肽的制备：

1.1从猪血中分离白细胞

将混合均匀的干净血液放置到无菌容器中，然后在4℃、4000rpm/min的条件下下离心10min，此时无菌容器内的变成悬液，此时悬液分为上、中、下三层，收获中间层，并将中间层放置在另一个无菌容器中，在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，然后再在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，所剩沉淀即为白细胞；

1.2抗菌肽的粗提

将步骤1.1中的产物放置在超声波细胞粉碎仪中破碎，破碎的条件为功率200W、破碎30s、间歇30s，共三十次，将破碎后的产物在4℃、12000rpm/min的条件下高速冷冻离心30min，收集底层沉淀，该沉淀即为中性颗粒细胞内的颗粒组分；

将沉淀中加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液在4℃条件下保存，将沉淀中再次加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液，将两次收集的上清溶液置于55℃—60℃的条件下加热，以去除溶液中的乙酸，直至水分全部蒸发，收集干物质，所得的干物质即为抗菌肽粗提物；

1.3抗菌肽的凝胶过滤层析纯化

取Superdex 30 pg凝胶10g与去离子水100ml混匀、溶涨、洗涤后装柱待用；将抗菌肽粗提物溶于醋酸钠溶液中，平衡后将抗菌肽粗提物溶液缓慢流入柱内，尽量避免冲击凝胶，用乙酸钠洗脱，以0.2mol/L乙酸钠溶液为参照，用紫外检测仪检测其OD280处的吸光值，收集各吸收峰，经抗菌活性检测，具有抑菌作用的吸收峰含有目的抗菌肽，将此洗脱液冷冻干燥后保存备用；

步骤2）免疫球蛋白的制备：

2.1分离血浆

将抗凝血在4000 rpm/min的条件下离心15min，获得沉降的血细胞和上清液，其中上清液为血浆；

2.2盐析

取上清液，向上清液中加入PBS缓冲液使得混合后的溶液体积至1L，混匀后加入固体硫酸铵和PBS缓冲液，边加边搅拌使硫酸铵饱和度达到20﹪，室温静置30min；然后在4℃ 4000r/min的条件下离心15 min，弃沉淀收集上清液；

2.3免疫球蛋白的分离

向2.2收集的上清液加入固体硫酸铵，使溶液硫酸铵饱和度达到50%，静置30min，然后在4℃5000 rpm/min的条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为免疫球蛋白粗品；

2.4除盐

用PBS缓冲液溶解免疫球蛋白粗品，装入透析袋，在4℃的条件下透析一天，得到脱盐后的免疫球蛋白粗品；

2.5DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白

活化处理DEAE-纤维素后装柱，用吸管将已脱盐的免疫球蛋白粗品沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床；用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的免疫球蛋白，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，并置于-20℃保存；

步骤3）配置肠溶兽用二联免疫增强剂

将抗菌肽和免疫球蛋白分别低温真空干燥后，制成干粉，将两者按1：2合并，充分混合均匀，并加入辅料甘氨酸、蔗糖和甘露醇，各种辅料按照质量分数的添加量分别为氨酸添加量4%，蔗糖添加量3%，甘露醇添加量3%。

2.根据权利要求1所述的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：在“1.2抗菌肽的粗提”中所用乙酸溶液的密度为9％。

3.根据权利要求1所述的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：在“2.2盐析”中所用PBS缓冲液为1mol/L,PH=7。

4.根据权利要求1所述的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于，步骤3）配置二联免疫增强剂的步骤还包括：将除菌的海藻酸钠溶液充分溶胀至无气泡，按1：3的芯壁材比例包埋步骤3）中所得的二联免疫增强剂，充分溶解并缓慢搅拌10小时，使其均匀；将脱气后的均匀混合液体通过内径约为 0.8 mm 的硅胶管，通过恒流泵以每分钟 60 滴的速度滴入到2℅体积分数的CaCl2 溶液中即成白色球形颗粒，在CaCl2 溶液中缓慢持续搅拌2h，成型固化成球状，强球状颗粒转至0.5℅体积分数的壳聚糖溶液中覆膜30分钟，收集后生理盐水洗涤，干燥5—6h，收获微胶囊颗粒，将制得的微胶囊置于流化床包衣机中进行肠溶包衣，通过肠溶包衣液在微胶囊颗粒表面形成肠溶包衣缓释层，制成微丸，流化床进风温度控制在50～60℃，物料温度控制在30～35℃进行包衣，微丸成品水分控制在2%-5%之间，粒度在60～80目之间。

5.根据权利要求4所述的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述的肠溶包衣液是将成膜剂、增塑剂、分散剂、抗黏剂加入到90%的乙醇溶液中，通过均质机20000r/min均质10min配制而成，其中，成膜剂由羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯（5%～10%）或聚丙烯酸树脂II（3%～5%）构成，增塑剂由聚乙二醇（1%～2%）、柠檬酸三乙酯（1%～2%）、单硬脂酸甘油酯（0.5%～2%）中的一种或两种构成，分散剂由聚山梨酯-80（1%～3%）构成，抗黏剂由滑石粉（1%～2%）构成。