CN112641920A - 一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 - Google Patents
一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112641920A CN112641920A CN202011410921.7A CN202011410921A CN112641920A CN 112641920 A CN112641920 A CN 112641920A CN 202011410921 A CN202011410921 A CN 202011410921A CN 112641920 A CN112641920 A CN 112641920A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immune cell
- solution
- polypeptide
- cell protein
- drying
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 66
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 14
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 13
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 7
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 claims description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 abstract 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
- A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法。包括制备免疫细胞，制备免疫细胞蛋白多肽溶液，对免疫细胞蛋白多肽溶液进行冷冻、干燥及粉化处理，最后得到免疫细胞多肽粉。本发明设计采用酶解及冷冻干燥技术，将免疫细胞蛋白质降解冻干为多肽粉末，在保证免疫蛋白完整的生物活性与功能的同时，兼具小分子易吸收易利用的优点，可以保证血液原料的活性，提高蛋白裂解的效率及效果，提高蛋白多肽的产量，同时可以提高冷冻的速度及效果，另外可以在保持蛋白活性的前提下，快速完成细胞蛋白的冷冻效果，降低加工过程中蛋白多肽的失活率，减少营养流失，提高药物成品的质量，从而最大程度发挥免疫细胞蛋白多肽提高机体免疫力的生物学作用和医用保健价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物加工技术领域，具体地说，涉及一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法。
背景技术
动物类中药的有效成分以蛋白多肽为主,因此活性蛋白多肽具有提高免疫力、调节免疫微环境的重要药用价值。但是，动物免疫细胞蛋白多肽在加工过程中，很多因素都会影响血液原料中蛋白多肽的含量及活性，从而导致成品药物中的活性蛋白多肽含量降低，导致成品药物的质量低下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述技术问题的解决，本发明提供一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，包括如下步骤：
S1、制备免疫细胞；
S2、制备免疫细胞蛋白多肽溶液；
S3、对免疫细胞蛋白多肽溶液进行冷冻、干燥及粉化处理，得到免疫细胞多肽粉。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1中，制备免疫细胞的方法包括如下步骤：
S1.1、取新鲜动物动脉血液，加入体积为血液体积8％～10％的4％柠檬酸钠抗凝剂抗凝，充分混合；
S1.2、将充分混合后的血液分置于离心管中，在4℃下设定离心转速2000rpm，离心12min；
S1.3、取上述离心后血液的中下层细胞，按2:1体积比加入PBS缓冲液，混匀后按1:1体积比加入淋巴细胞分离液；
S1.4、在4℃下设定离心转速2300rpm，离心20min后，将外周血单核细胞与红细胞层分离，收集单核细胞即免疫细胞后于4℃冰箱保存。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1.2中，经离心后使溶液分为上中下三层，其中上层为富含血小板的血浆层，中层为富含白细胞的外周血单核细胞层，下层为红细胞层。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2中，制备免疫细胞蛋白多肽溶液的方法包括如下步骤：
S2.1、免疫细胞按1:1体积比加入0.9％NaCl的水溶液进行洗涤，设定离心转速3000rpm离心10min，弃上清液，反复洗涤两次，取免疫沉淀；
S2.2、在免疫细胞中按1:1体积比加入蒸馏水，42℃下超声25min破碎细胞；
S2.3、将破碎后的免疫细胞溶液置于离心机中，设定离心转速4200rpm离心15min，取上层免疫细胞蛋白溶液；
S2.4、用蒸馏水调节免疫细胞蛋白溶液浓度至8.5％～9.0％，在其中加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，再加入稀NaOH溶液调节PH至9.0～9.5，设定温度为55～58℃，酶解4～6h；
S2.5、设定离心转速8200rpm，冷冻离心15min，取上清液得免疫细胞蛋白多肽溶液。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.2中，破碎细胞的操作过程中，超声波细胞破碎仪的功率为200W。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.4中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
作为本技术方案的进一步改进，所述S3中，对免疫细胞蛋白多肽溶液进行处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的免疫细胞蛋白多肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体积的75％；
S3.2、将预冷的免疫细胞蛋白多肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的免疫细胞进行低温粉碎，用50～80目筛进行过筛，得到免疫细胞多肽粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)该动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法中，由于人类免疫细胞主要包括巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞等，其裂解后可释放免疫球蛋白、细胞因子、免疫调节剂等多种免疫蛋白，如抗体、补体、白细胞介素等均具有多种免疫功能，进入人体后能够达到增强机体免疫应答，强化人体免疫力的效果。本发明采用酶解及冷冻干燥技术，将免疫细胞蛋白质降解冻干为多肽粉末，相较变性的熟食蛋白能够维持蛋白的二级三级结构，在保证免疫蛋白完整的生物活性与功能的同时，兼具小分子易吸收易利用的优点，扩大了免疫细胞蛋白质的应用范围与价值。
(2)该动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法中，通过选择合适配比的抗凝剂，可以保证血液原料的活性，其次添加合适配比的蛋白酶并调节适宜的反应条件，提高蛋白裂解的效率及效果，提高蛋白多肽的产量，同时通过预冷、敲碎再进一步冷冻的方法，可以提高冷冻的速度及效果，另外通过设置多次的真空-升温循环，可以在保持蛋白活性的前提下，快速完成细胞蛋白的冷冻效果，降低加工过程中蛋白多肽的失活率，减少营养流失，提高药物成品的质量，最大程度保持其提高机体免疫力的医用保健价值。
附图说明
图1为实施例1的整体方法流程图；
图2为实施例1中制备免疫细胞的方法流程图；
图3为实施例1中制备免疫细胞蛋白多肽溶液的方法流程图；
图4为实施例1中对免疫细胞蛋白多肽溶液进行处理的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1-4所示，本实施例的目的在于，提供一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，包括如下步骤：
S1、制备免疫细胞；
S2、制备免疫细胞蛋白多肽溶液；
S3、对免疫细胞蛋白多肽溶液进行冷冻、干燥及粉化处理，得到免疫细胞多肽粉。
本实施例中，S1中，制备免疫细胞的方法包括如下步骤：
S1.1、取新鲜动物动脉血液，加入体积为血液体积8％～10％的4％柠檬酸钠抗凝剂抗凝，充分混合；
S1.2、将充分混合后的血液分置于离心管中，在4℃下设定离心转速2000rpm，离心12min；
S1.3、取上述离心后血液的中下层细胞，按2:1体积比加入PBS缓冲液，混匀后按1:1体积比加入淋巴细胞分离液；
S1.4、在4℃下设定离心转速2300rpm，离心20min后，将外周血单核细胞与红细胞层分离，收集单核细胞即免疫细胞后于4℃冰箱保存。
其中，S1.2中，经离心后使溶液分为上中下三层，其中上层为富含血小板的血浆层，中层为富含白细胞的外周血单核细胞层，下层为红细胞层。
具体地，因钙是凝血反应中不可缺少的元素，而柠檬酸钠能与血液中的钙离子形成配位化合物，进而可以阻止血液凝结，便于对血液进行离心纯化，可以更好地保留细胞蛋白。
本实施例中，S2中，制备免疫细胞蛋白多肽溶液的方法包括如下步骤：
S2.1、免疫细胞按1:1体积比加入0.9％NaCl的水溶液进行洗涤，设定离心转速3000rpm离心10min，弃上清液，反复洗涤两次，取免疫沉淀；
S2.2、在免疫细胞中按1:1体积比加入蒸馏水，42℃下超声25min破碎细胞；
S2.3、将破碎后的免疫细胞溶液置于离心机中，设定离心转速4200rpm离心15min，取上层免疫细胞蛋白溶液；
S2.4、用蒸馏水调节免疫细胞蛋白溶液浓度至8.5％～9.0％，在其中加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，再加入稀NaOH溶液调节PH至9.0～9.5，设定温度为55～58℃，酶解4～6h；
S2.5、设定离心转速8200rpm，冷冻离心15min，取上清液得免疫细胞蛋白多肽溶液。
其中，S2.2中，破碎细胞的操作过程中，超声波细胞破碎仪的功率为200W，避免功率过大导致破碎过程中造成溶液溅出或产生泡沫。
其中，S2.4中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
具体地，以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶用于在碱性条件下水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸。
本实施例中，S3中，对免疫细胞蛋白多肽溶液进行处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的免疫细胞蛋白多肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体积的75％；
S3.2、将预冷的免疫细胞蛋白多肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的免疫细胞进行低温粉碎，用50～80目筛进行过筛，得到免疫细胞多肽粉。
其中，S3.2中，将预冷的蛋白多肽敲碎，再进行进一步降温冷冻，可以提高冷冻的速度及全面性，便于强化蛋白多肽内部冷冻的效果，进而更好地保持蛋白多肽的活性。
实施例2
本实施例中对抗凝剂作出以下三组对比实验：
实验1
抗凝剂采用体积为血液体积10％的4％柠檬酸钠抗凝剂水溶液。
实验2
抗凝剂采用体积为血液体积6.25％的4％枸橼酸钠抗凝剂水溶液。
实验3
抗凝剂采用体积为血液体积11％的草酸盐抗凝剂溶液。
将上述三组实验与不使用抗凝剂在原料价格、溶液外观、溶液毒性、抗凝效果进行对比，具体如下表所示：
| 原料价格(元/吨) | 溶液外观 | 溶液毒性 | 抗凝效果 | |
| 实验1 | 4800 | 无色透明 | 无毒性 | 较佳，保养血液活性 |
| 实验2 | 5200 | 无色澄明 | 无毒性 | 较佳，保护血液因子 |
| 实验3 | 4500 | 绿色透明 | 浓度过高时有害 | 较佳，沉淀物较多 |
| 无抗凝剂 | 无 | 无 | 无 | 极差 |
由上表可以看出，本实施例动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，通过选择抗凝剂种类与合理调配抗凝剂的配比，避免血液原料凝结，保持血液活性，保护血液中Ⅴ因子和Ⅷ因子的稳定性，保证原材料的高品质，从而便于制备出高质量、高纯度、高天然保真性的蛋白，进而可以更好地保留成品中蛋白多肽的高含量和活性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备免疫细胞；
S2、制备免疫细胞蛋白多肽溶液；
S3、对免疫细胞蛋白多肽溶液进行冷冻、干燥及粉化处理，得到免疫细胞多肽粉。
2.根据权利要求1所述的动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S1中，制备免疫细胞的方法包括如下步骤：
S1.1、取新鲜动物动脉血液，加入体积为血液体积8％～10％的4％柠檬酸钠抗凝剂抗凝，充分混合；
S1.2、将充分混合后的血液分置于离心管中，在4℃下设定离心转速2000rpm，离心12min；
S1.3、取上述离心后血液的中下层细胞，按2:1体积比加入PBS缓冲液，混匀后按1:1体积比加入淋巴细胞分离液；
S1.4、在4℃下设定离心转速2300rpm，离心20min后，将外周血单核细胞与红细胞层分离，收集单核细胞即免疫细胞后于4℃冰箱保存。
3.根据权利要求2所述的动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S1.2中，经离心后使溶液分为上中下三层，其中上层为富含血小板的血浆层，中层为富含白细胞的外周血单核细胞层，下层为红细胞层。
4.根据权利要求1所述的动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2中，制备免疫细胞蛋白多肽溶液的方法包括如下步骤：
S2.1、免疫细胞按1:1体积比加入0.9％NaCl的水溶液进行洗涤，设定离心转速3000rpm离心10min，弃上清液，反复洗涤两次，取免疫沉淀；
S2.2、在免疫细胞中按1:1体积比加入蒸馏水，42℃下超声25min破碎细胞；
S2.3、将破碎后的免疫细胞溶液置于离心机中，设定离心转速4200rpm离心15min，取上层免疫细胞蛋白溶液；
S2.4、用蒸馏水调节免疫细胞蛋白溶液浓度至8.5％～9.0％，在其中加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，再加入稀NaOH溶液调节PH至9.0～9.5，设定温度为55～58℃，酶解4～6h；
S2.5、设定离心转速8200rpm，冷冻离心15min，取上清液得免疫细胞蛋白多肽溶液。
5.根据权利要求4所述的动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2.2中，破碎细胞的操作过程中，超声波细胞破碎仪的功率为200W。
6.根据权利要求4所述的动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2.4中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
7.根据权利要求1所述的动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S3中，对免疫细胞蛋白多肽溶液进行处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的免疫细胞蛋白多肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体积的75％；
S3.2、将预冷的免疫细胞蛋白多肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的免疫细胞进行低温粉碎，用50～80目筛进行过筛，得到免疫细胞多肽粉。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011410921.7A CN112641920A (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011410921.7A CN112641920A (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112641920A true CN112641920A (zh) | 2021-04-13 |
Family
ID=75350229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011410921.7A Pending CN112641920A (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112641920A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105331667A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-02-17 | 石河子大学 | 一种以牛血红蛋白为原料制备血红蛋白多肽的方法 |
| CN106421781A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-02-22 | 河南牧业经济学院 | 肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法 |
| CN107130009A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-09-05 | 华南理工大学 | 一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法 |
-
2020
- 2020-12-03 CN CN202011410921.7A patent/CN112641920A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105331667A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-02-17 | 石河子大学 | 一种以牛血红蛋白为原料制备血红蛋白多肽的方法 |
| CN106421781A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-02-22 | 河南牧业经济学院 | 肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法 |
| CN107130009A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-09-05 | 华南理工大学 | 一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109275916A (zh) | 一种胶原蛋白多肽粉及其制备方法 | |
| CN103565839B (zh) | 一种猪胎盘素的分离提取方法 | |
| CN108929891B (zh) | 一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法 | |
| CN108567046A (zh) | 一种抗疲劳功能的牡蛎玉米多肽冲剂及其制备方法 | |
| CN109371088A (zh) | 一种海参活性肽的制备方法 | |
| CN112790392A (zh) | 一种海参肽的制备方法 | |
| CN110846366B (zh) | 一种以玉米黄粉为原料制备免疫活性肽的方法 | |
| CN109943612B (zh) | 一种酶解鲢鱼鱼鳞生产高活性鱼糜及制品抗冻剂的方法 | |
| CN113249421A (zh) | 一种金丝皇菊蛋白多肽及其制备和应用 | |
| CN101721458A (zh) | 一种人胎盘组织液的制备方法 | |
| CN112641933A (zh) | 一种动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 | |
| CN114214366B (zh) | 一种预防和治疗贫血的小肽粉和血红素之肽红复方药物及其制备方法和应用 | |
| CN110117632B (zh) | 一种超声联合双酶解提高西瓜籽多肽抗氧化稳定性的方法 | |
| CN1178672C (zh) | 羊胎多肽核酸营养液的制备方法 | |
| CN113957112A (zh) | 一种鹿血肽的制备方法及鹿血肽 | |
| CN112641920A (zh) | 一种动物免疫细胞蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 | |
| CN1314359C (zh) | 一种海参超细粉体的制备方法 | |
| CN111466576A (zh) | 一种食品添加剂 | |
| KR20040055931A (ko) | 콜라겐펩타이드의 제조방법 및 이를 이용한식품·의약품·화장품 | |
| CN111269304A (zh) | 一种大豆7s球蛋白和11s球蛋白绿色分离提取方法 | |
| CN107446980B (zh) | 一种沙棘叶多肽及其制备方法 | |
| CN114031695A (zh) | 一种具有抗肿瘤功效的高纯度鲨鱼硫酸软骨素的制备工艺 | |
| CN110841004B (zh) | 一种从叠鞘石斛中热回流低温提取叠鞘石斛提取物的工艺 | |
| CN113088549A (zh) | 一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法 | |
| CN108486201B (zh) | 一种白果生物活性多肽的提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210413 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |