CN107130009A - 一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法 - Google Patents

一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法 Download PDF

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CN107130009A CN201710572326.5A CN201710572326A CN107130009A CN 107130009 A CN107130009 A CN 107130009A CN 201710572326 A CN201710572326 A CN 201710572326A CN 107130009 A CN107130009 A CN 107130009A
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Abstract

本发明公开了一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法。该方法如下：取麦胚球蛋白为原料，通过碱性蛋白酶水解3h，经过DEAE‑Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G15凝胶渗透层析筛选出一种具有高免疫活性的多肽。此外该多肽还具有抗红细胞溶血的功效。该多肽在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL‑6和TNF‑α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。

Description

一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备 方法
技术领域
本发明属于农产品深加工及其副产品综合利用的技术领域，具体涉及一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法。
背景技术
麦胚球蛋白在脱脂小麦胚芽中占的比例约为15.6%。球蛋白的氨基酸含量均衡，必需氨基酸占总氨基酸的比例（E/T）在麦胚各蛋白中最高，其中苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量较高。除蛋氨酸外，其它必需氨基酸与FAO/WHO推荐模式相符。球蛋白的蛋白消化率在麦胚各蛋白中最高，是非常有价值的天然蛋白质。目前已发现碱性蛋白酶水解球蛋白可以获得高免疫活性肽，但是对它的氨基酸序列以及其它生物活性尚属未知领域。因此以小麦胚芽球蛋白为原料，发现新型多肽，并研究它的多种生理功能，对小麦胚芽蛋白尤其是球蛋白的开发利用具有深远意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法。本发明所得多肽同时兼具免疫和抗红细胞溶血两种活性。
本发明以小麦胚芽球蛋白为原料制备的新型活性肽，其分子量是656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。该多肽具有免疫活性和抗红细胞溶血活性，在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，取麦胚球蛋白为原料，用碱性蛋白酶水解，冷冻干燥后，用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G15凝胶渗透层析筛选出免疫活性较高的多肽，再经过半制备RP-HPLC和MALDI-TOF-MS质谱分析得出该肽的分子量为656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala，该肽是首次被发现的新型多肽；所述多肽同时还具有抗红细胞溶血功效。
本发明具体包括如下步骤：
（1）麦胚球蛋白提取：将过100-300目的脱脂小麦胚芽粉以1：10-1:30 （w/v）的比例加入水，在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10-1:30w/v的比例添加50-100mM Tris-HCl，所述Tris-HCl中含0.3-0.5M NaCl的溶液，所述Tris-HCl 的pH 为7.5-8.5，同样在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min；获得的上清液用0.1-1M的HCl调pH至4.0，6000-9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调pH至6.5-7.5，然后透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白；
（2）酶解：将上述所得麦胚球蛋白配成质量百分比为4%-5%的蛋白溶液，在90-95℃保温5-10min，再冷却至50℃，用0.1-1M NaOH调节pH,使pH值至7.5-8.0，加入碱性蛋白酶，在45-55℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入0.1-1M的NaOH，使pH保持不变，水解完成后，调节pH至6.5-7.5，95-100℃灭酶5-10min，冷却后，6000-9000r/min离心5-10min，保留上清液并冷冻干燥，得到粗肽；
（3）分离纯化及结构鉴定：将得到的粗肽按2.5：1-5:1（w/v）的比例加入水，取5-10mL加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中；所述填料体积为柱子体积的1/3或1/2，依次用水、0.05、0.1、0.3和0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度3-4h，流速30-35转/min，在220nm有吸收峰的洗脱液透析和冷冻干燥后，取0.3M NaCl洗脱组分；将免疫活性最高的组分按5：1-10:1（w/v）的比例加入水，取1-1.5mL加入装填了Sephadex G15填料的层析柱；所述填料体积占柱子体积的90%-95%，以10-15转/min的流速收集样品，在220nm共有两个吸收峰，冻干后，得到两种组分，取免疫活性最高的组分，按10:1-20:1的比例加入超纯水，每次取0.2-1mL上半制备RP-HPLC柱，流动相为乙腈/超纯水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），只有单一的一个峰被洗脱出来，收集并冻干后，按1：1-2:1比例加入超纯水，取1μL点在MALDI靶板上自然晾干放入MALDI-TOF-MS质谱仪的样品室进行测定，累加10次单次扫描信号为最终一级质谱图；完成一级质谱后，将信号较强的肽段进行提取，获得二级质谱；标注出主要的a、b、y和z系列由母离子碎裂后得到的子离子，人工推测氨基酸序列，得到具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽。
上述方法中，所述麦胚球蛋白的蛋白含量在85%以上。
上述方法中，用碱性蛋白酶水解后，水解度在19%-20%。
上述方法中，所述具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的分子量为656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。
上述方法中，该多肽在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。
上述方法中，该多肽在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。
一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽，所述多肽分子量为656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
（1）本发明得到的多肽是一种新型多肽，同时兼具免疫和抗红细胞溶血两种活性。
（2）所获得的多肽为一种六肽，分子量低，较易被机体吸收。
附图说明
图1是本发明提供的新型活性肽的工艺流程图；
图2A为新型活性肽的一级质谱图；
图2B为新型活性肽的二级质谱图;
图3A是新型活性肽对刺激RAW 264.7细胞分泌NO的影响图；
图3B是新型活性肽对刺激RAW 264.7细胞分泌IL-6的影响；
图3C是新型活性肽对刺激RAW 264.7细胞分泌TNF-α的影响图；
图4A是新型活性肽的人血红细胞的溶血率；图4B是人血红细胞的正常组电镜扫描；图4C是人血红细胞的创伤组电镜扫描；图4D是人血红细胞的饱和组电镜扫描。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本发明工艺方法流程图见图1，本发明中的免疫学评价分析包括测定RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的浓度。
实施例1
将过200目的脱脂小麦胚芽粉以1：10（kg/L）的比例加入水，在20℃下搅拌1h，7000r/min低温离心10min后，将沉淀继续以1：10的比例添加50mM Tris-HCl（pH 8.0），含0.5MNaCl的溶液，同样在25℃下搅拌1h，7000r/min低温离心10min。获得的上清液用0.1M的HCl调pH至4.0，7000r/min低温离心10min后，复溶并调pH至6.5，然后用蒸馏水透析72h并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白。其蛋白含量为85.3%。将上述所得麦胚球蛋白配成质量百分比浓度为4%的蛋白溶液，在90℃保温10min，再冷却至45℃，用0.1M NaOH调节pH,使pH值至7.5，加入碱性蛋白酶，在45℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入0.1M的NaOH，使pH保持不变，水解完成后，调节pH至6.5，95℃灭酶10min，冷却后 7000r/min离心5min，保留上清液并冷冻干燥，得到粗肽。将得到的粗肽按2.5:1（w/v）的比例加入水，取10mL加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中（填料一般装柱子的1/3或1/2），依次用超纯水、0.05、0.1、0.3和0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度3h，流速35转/min，将在220nm有吸收峰的洗脱液透析和冷冻干燥后，通过免疫学评价得出0.3M NaCl洗脱组分P3免疫活性最高，因此用该组分继续分离纯化。将P3组分按5：1（w/v）的比例加入水，取1.5mL加入装填了SephadexG15填料的层析柱（填料占柱子的90%-95%）,以15转/min的流速收集样品，在220nm共有两个吸收峰，冻干后通过免疫学评价得出P3-1的免疫活性最高。将P3-1按10:1的比例加入水，每次取1mL上半制备RP-HPLC柱，流动相为乙腈/超纯水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），其中三氟乙酸可以换成其它强酸，其中只有单一的一个峰被洗脱出来，收集并冻干后，按2:1比例加入超纯水，取1μL点在MALDI靶板上自然晾干放入MALDI-TOF-MS质谱仪的样品室进行测定，累加10次单次扫描信号为最终一级质谱图（见图2A）。完成一级质谱后，将信号较强的肽段进行提取，获得二级质谱（见图2B）。标注出主要的a、b、y和z系列由母离子碎裂后得到的子离子，人工推测氨基酸序列。得到的新型多肽分子量是655.97Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。该多肽具有免疫活性和抗红细胞溶血活性，在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍（如图3A~图3C，新型活性肽的免疫活性，A是对刺激RAW 264.7细胞分泌NO的影响，B是对刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响，C是对刺激RAW 264.7细胞分泌TNF-α的影响）；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态（如图4A~图4D新型活性肽的抗红细胞溶血，A是人血红细胞的溶血率，B是人血红细胞的电镜扫描）。
实施例2
将过200目的脱脂小麦胚芽粉以1：20（kg/L）的比例加入水，在30℃下搅拌2h，8000r/min低温离心15min后，将沉淀继续以1：20的比例添加80mM Tris-HCl（pH 8.0），含0.5MNaCl的溶液，同样在30℃下搅拌2h，8000r/min低温离心15min。获得的上清液用0.5M的HCl调pH至4.0，8000r/min低温离心15min后，复溶并调pH至7.0，然后用蒸馏水透析72h并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白。其蛋白含量为85.3%。将上述所得麦胚球蛋白配成质量百分比浓度为4.5%的蛋白溶液，在95℃保温5min，再冷却至50℃，用0.5M NaOH调节pH,使pH值至7.5，加入碱性蛋白酶，在50℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入0.5M的NaOH，使pH保持不变，水解完成后，调节pH至7.0，95℃灭酶10min，冷却后 8000r/min离心10min，保留上清液并冷冻干燥，得到粗肽。将得到的粗肽按5:1（w/v）的比例加入水，取5mL加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中（填料一般装柱子的1/3或1/2），依次用超纯水、0.05、0.1、0.3和0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度4h，流速30转/min，将在220nm有吸收峰的洗脱液透析和冷冻干燥后，通过免疫学评价得出0.3M NaCl洗脱组分P3免疫活性最高，因此用该组分继续分离纯化。将P3组分按10：1（w/v）的比例加入水，取1mL加入装填了SephadexG15填料的层析柱（填料占柱子的90%-95%）,以10转/min的流速收集样品，在220nm共有两个吸收峰，冻干后通过免疫学评价得出P3-1的免疫活性最高。将P3-1按15:1的比例加入水，每次取0.5mL上半制备RP-HPLC柱，流动相为乙腈/超纯水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），其中三氟乙酸可以换成其它强酸，其中只有单一的一个峰被洗脱出来，收集并冻干后，按1:1比例加入超纯水，取1μL点在MALDI靶板上自然晾干放入MALDI-TOF-MS质谱仪的样品室进行测定，累加10次单次扫描信号为最终一级质谱图（见图2A）。完成一级质谱后，将信号较强的肽段进行提取，获得二级质谱（见图2B）。标注出主要的a、b、y和z系列由母离子碎裂后得到的子离子，人工推测氨基酸序列。得到的新型多肽分子量是655.97Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。该多肽具有免疫活性和抗红细胞溶血活性，在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍（如图3A~图3C，新型活性肽的免疫活性，A是对刺激RAW 264.7细胞分泌NO的影响，B是对刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响，C是对刺激RAW 264.7细胞分泌TNF-α的影响）；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态（如图4A~图4D新型活性肽的抗红细胞溶血，A是人血红细胞的溶血率，B是人血红细胞的电镜扫描）。
实施例3
将过200目的脱脂小麦胚芽粉以1：30（kg/L）的比例加入水，在35℃下搅拌3h，9000r/min低温离心10min后，将沉淀继续以1：30的比例添加100mM Tris-HCl（pH 8.0），含0.5MNaCl的溶液，同样在35℃下搅拌3h，9000r/min低温离心10min。获得的上清液用1.0M的HCl调pH至4.0，9000r/min低温离心10min后，复溶并调pH至7.5，然后用蒸馏水透析72h并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白。其蛋白含量为85.3%。将上述所得麦胚球蛋白配成质量百分比浓度为5%的蛋白溶液，在95℃保温5min，再冷却至55℃，用1M NaOH调节pH,使pH值至8.0，加入碱性蛋白酶，在55℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入1M的NaOH，使pH保持不变，水解完成后，调节pH至7.5，95℃灭酶10min，冷却后 9000r/min离心5min，保留上清液并冷冻干燥，得到粗肽。将得到的粗肽按5:1（w/v）的比例加入水，取5mL加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中（填料一般装柱子的1/3或1/2），依次用超纯水、0.05、0.1、0.3和0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度4h，流速30转/min，将在220nm有吸收峰的洗脱液透析和冷冻干燥后，通过免疫学评价得出0.3M NaCl洗脱组分P3免疫活性最高，因此用该组分继续分离纯化。将P3组分按10：1（w/v）的比例加入水，取1mL加入装填了Sephadex G15填料的层析柱（填料占柱子的90%-95%）,以10转/min的流速收集样品，在220nm共有两个吸收峰，冻干后通过免疫学评价得出P3-1的免疫活性最高。将P3-1按20:1的比例加入水，每次取0.2mL上半制备RP-HPLC柱，流动相为乙腈/超纯水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），其中三氟乙酸可以换成其它强酸，其中只有单一的一个峰被洗脱出来，收集并冻干后，按1:1比例加入超纯水，取1μL点在MALDI靶板上自然晾干放入MALDI-TOF-MS质谱仪的样品室进行测定，累加10次单次扫描信号为最终一级质谱图（见图2A）。完成一级质谱后，将信号较强的肽段进行提取，获得二级质谱（见图2B）。标注出主要的a、b、y和z系列由母离子碎裂后得到的子离子，人工推测氨基酸序列。得到的新型多肽分子量是655.97Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。该多肽具有免疫活性和抗红细胞溶血活性，在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍（如图3A~图3C，新型活性肽的免疫活性，A是对刺激RAW 264.7细胞分泌NO的影响，B是对刺激RAW 264.7细胞分泌IL-6的影响，C是对刺激RAW 264.7细胞分泌TNF-α的影响）；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态（如图4A~图4D新型活性肽的抗红细胞溶血，A是人血红细胞的溶血率，B是人血红细胞的电镜扫描）。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Cys Phe Ser Thr Ala
1 5

Claims (6)

1.一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，其特征在于，取麦胚球蛋白为原料，用碱性蛋白酶水解，冷冻干燥后，用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G15凝胶渗透层析筛选出免疫活性较高的多肽，再经过半制备RP-HPLC和MALDI-TOF-MS质谱分析得出该肽的分子量为656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala；
具体包括如下步骤：
（1）麦胚球蛋白提取：将过100-300目的脱脂小麦胚芽粉以1：10-1:30 （w/v）的比例加入水，在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10-1:30w/v的比例添加50-100mM Tris-HCl，所述Tris-HCl中含0.3-0.5M NaCl的溶液，所述Tris-HCl 的pH 为7.5-8.5，同样在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min；获得的上清液用0.1-1M的HCl调pH至4.0，6000-9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调pH至6.5-7.5，然后透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白；
（2）酶解：将上述所得麦胚球蛋白配成质量百分比为4%-5%的蛋白溶液，在90-95℃保温5-10min，再冷却至50℃，用0.1-1M NaOH调节pH,使pH值至7.5-8.0，加入碱性蛋白酶，在45-55℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入0.1-1M的NaOH，使pH保持不变，水解完成后，调节pH至6.5-7.5，95-100℃灭酶5-10min，冷却后，6000-9000r/min离心5-10min，保留上清液并冷冻干燥，得到粗肽；
（3）分离纯化及结构鉴定：将得到的粗肽按2.5：1-5:1（w/v）的比例加入水，取5-10mL加入装填了DEAE-Sepharose阴离子填料的柱子中；所述填料体积为柱子体积的1/3或1/2，依次用水、0.05、0.1、0.3和0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度3-4h，流速30-35转/min，在220nm有吸收峰的洗脱液透析和冷冻干燥后，取0.3M NaCl洗脱组分；将免疫活性最高的组分按5：1-10:1（w/v）的比例加入水，取1-1.5mL加入装填了Sephadex G15填料的层析柱；所述填料体积占柱子体积的90%-95%，以10-15转/min的流速收集样品，在220nm共有两个吸收峰，冻干后，得到两种组分，取免疫活性最高的组分，按10:1-20:1的比例加入超纯水，每次取0.2-1mL上半制备RP-HPLC柱，流动相为乙腈/超纯水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），只有单一的一个峰被洗脱出来，收集并冻干后，按1：1-2:1比例加入超纯水，取1μL点在MALDI靶板上自然晾干放入MALDI-TOF-MS质谱仪的样品室进行测定，累加10次单次扫描信号为最终一级质谱图；完成一级质谱后，将信号较强的肽段进行提取，获得二级质谱；标注出主要的a、b、y和z系列由母离子碎裂后得到的子离子，人工推测氨基酸序列，得到具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽。
2.根据权利要求1所述具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，其特征在于，所述麦胚球蛋白的蛋白含量在85%以上。
3.根据权利要求1所述具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，其特征在于，用碱性蛋白酶水解后，水解度在19%-20%。
4.根据权利要求1所述具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，其特征在于，所述具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的分子量为656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。
5.根据权利要求1所述具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，其特征在于，该多肽在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。
6.由权利要求1~5任意一项所述制备方法制备得到具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽，所述多肽分子量为656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。
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