CN103435682A - 小麦胚芽蛋白源抗氧化肽、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽、其制备方法及应用。所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列；其制备方法包括：将新鲜小麦胚芽制成脱脂麦胚蛋白粉后，以碱性蛋白酶水解、灭酶、高速离心后，取上清液超滤除去大分子物质，滤液冷冻干燥得麦胚蛋白酶解物，再将麦胚蛋白酶解物溶液依次过大孔吸附树脂柱、凝胶过滤色谱柱，收集抗氧化活性最强的组分，即为具有目标产物。本发明工艺简单高效，所获麦胚蛋白抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，具有较小的分子量和明确的氨基酸序列，能够清除自由基、减轻氧化应激损伤，还可用于抗氧化类膳食补充剂，具有原料来源广泛、安全性高、成本较低等优点，在食品、医药等领域具有广阔的应用前景。

Description

小麦胚芽蛋白源抗氧化肽、其制备方法及其应用

技术领域

本发明特别涉及一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽、其制备方法及其应用，属于小麦副产品精深加工技术领域。

背景技术

小麦胚芽是小麦加工的副产物，其产量随着制粉技术的提高而不断增大。目前小麦胚芽被大量地用于提取小麦胚芽油，然而提取小麦胚芽油后的麦胚粕应用范围比较局限，除了作为廉价饲料，还被用作蛋白质补充剂和食品配料添加剂。脱脂麦胚含有高达30％左右的蛋白质，且氨基酸分布均衡，八种必需氨基酸含量约占总氨基酸的34％，是重要的优质植物蛋白营养源，深度开发和利用脱脂麦胚成为国内外科研工作者的关注和研究热点，也具有很大的现实意义。例如，利用小麦胚芽提取生物活性肽已经成为当前回收利用脱脂麦胚的重要途径之一。

CN102168124A公开了一种复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，以获得不同分子量的生物活性肽粉。CN202297429U提供了一种制备小麦胚芽多肽的脱盐装置，其能有效提高多肽的纯度。CN102524514A公开了一种小麦胚芽活性多肽的制备方法，其所获小麦胚芽活性多肽对青年期小鼠营养性肥胖具有一定的预防作用。CN101513218A公开了一种从小麦胚芽中提取抗氧化活性小肽营养粉的方法，其所获小肽可在体外抑制被铁、血红蛋白、脂质氧化酶和单态氧催化的脂质氧化作用。

但是，前述技术对于小麦胚芽活性肽的研究尚较为初级，未能精确的提取获得具有确定结构和功能的活性肽，因此缺乏实际应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其实现了对氧化应激损伤具有较强保护作用的小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的精确有效提取，从而克服了现有技术中的不足。

本发明的目的之二在于提供一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽，其对氧化应激损伤具有较强保护作用。

本发明的目的之三在于提供前述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽，它包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的序列。

一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：

(i)将新鲜小麦胚芽依次经脱脂、干燥、粉碎形成脱脂麦胚粉，再经碱沉酸提方法获得脱脂麦胚蛋白粉；

(ii)将脱脂麦胚蛋白粉溶于水配置成脱脂麦胚蛋白悬液，并调节pH值8.0-8.5，在50-60℃平衡30min以上，然后加入碱性蛋白酶，在50-60℃进行水解反应，同时维持反应体系的pH值保持恒定，水解反应完毕后，将酶解液于90-100℃灭酶10min以上，迅速冷却，在4℃以8000r/min以上的速度离心30min以上，收集上清液，并以截留分子量为5000-10000Da超滤膜过滤除去大分子物质，将滤液冷冻干燥得麦胚蛋白酶解物；

(iii)将麦胚蛋白酶解物溶于水配置成样品溶液，并使样品溶液通过大孔吸附树脂柱，同时以紫外检测器记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后依次用水和体积浓度为15-75％的乙醇水溶液进行洗涤和洗脱；

(iv)步骤(iii)得到的乙醇洗脱液在温度45-55℃下蒸发浓缩，再依次进行冷冻干燥和抗氧化活性，收集抗氧化活性最强的组分；

(v)将步骤(iv)所获抗氧化活性最强的组分配置成水溶液，并通过凝胶过滤色谱柱，再用水进行洗脱，按照洗脱峰收集各组分进行冷冻干燥，并进行抗氧化活性的测定，再次收集抗氧化活性最强的组分，即为具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列的小麦胚芽蛋白源抗氧化肽。

进一步的，步骤(i)包括：将经正己烷脱脂的新鲜小麦胚芽，置于室温风干后，粉碎过60-80目筛得脱脂麦胚粉，采用碱沉酸提方法得脱脂麦胚蛋白粉。

进一步的，步骤(ii)包括：将脱脂麦胚蛋白粉溶于水形成浓度为5w/v％-10w/v％的脱脂麦胚蛋白悬液，用碱调节pH值至8.0-8.5，在50-60℃条件下平衡30-40min，然后加入0.024AU/g碱性蛋白酶，在50-60℃条件下进行水解反应4h以上，同时用酸或碱维持反应体系的pH值恒定，水解反应完毕后，将酶解液于90-100℃水浴灭酶10-15min，迅速冷却，在4℃以8000-10000r/min的转速离心30-35min，收集上清液，将上清液依次以普通滤纸和0.45μm微孔滤膜过滤，再采用截留分子量为5000-10000Da超滤膜过滤除去大分子物质，将滤液冷冻干燥，获得麦胚蛋白酶解物。

进一步的，步骤(iii)包括：将步骤(ii)所获麦胚蛋白酶解物溶于水形成浓度为20-30mg/mL的样品溶液，让样品溶液以1-2mL/min流速通过大孔吸附树脂柱，紫外检测器记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后用水以1-2mL/min流速洗涤1-2个柱体积，再用体积浓度为15-75％的乙醇水溶液以1-2mL/min流速进行洗脱。

进一步的，步骤(iv)包括：将步骤(iii)所获乙醇洗脱液在温度45-55℃下进行旋转蒸发，再将浓缩组分进行冷冻干燥，而后进行抗氧化活性的测定，并收集抗氧化活性最强的组分。

进一步的，步骤(v)包括：将步骤(iv)所获抗氧化活性最强的组分溶于水形成浓度为4-5mg/mL的溶液，以0.5-1mL/min流速通过凝胶过滤色谱柱，再用水以0.5-1mL/min流速进行洗脱，按照洗脱峰收集各组分进行冷冻干燥，再进行抗氧化活性的测定，再次收集抗氧化活性最强的组分。

进一步的，所述大孔吸附树脂可选自但不限于DA201-C型大孔吸附树脂。

所述凝胶过滤色谱柱可选用Superdex Peptide10/300GL预装柱，但不限于此。

前述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽在保护氧化损伤细胞中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于：采用有效的制备、分离纯化方法准确获得了具有确定结构和功效的麦胚蛋白抗氧化肽，所述麦胚蛋白抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，具有较小的分子量和明确的氨基酸序列，能够清除自由基、减轻氧化应激损伤，还可用于抗氧化类膳食补充剂，具有原料来源广泛、安全性高、成本较低等优点，在食品、医药等领域具有广阔的应用前景，可取得一定的经济效益。本发明为拓展脱脂麦胚的开发范围提供了研究基础，可提高麦胚深度开发的利用价值和相关产业的经济效益。

附图说明

图1是本发明一较佳实施例中的大孔吸附树脂DA201-C分离图谱；

图2是本发明一较佳实施例中的Superdex Peptide10/300GL凝胶过滤色谱分离图谱。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术中的不足，本发明的一个方面旨在提供一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法。

在本发明的一典型实施方式中，该制备方法可包括如下步骤：

(i)蛋白提取步骤：

新鲜小麦胚芽经正己烷脱脂，置于室温风干后，粉碎过筛(60-80目)得脱脂麦胚粉。配制10％-20％(w/v)脱脂麦胚粉去离子水溶液，用碱调pH至9.0-9.5，室温搅拌提取1-2h，以8000-10000r/min、4℃离心25-30min，重复上述碱溶过程，合并两次上清液。用酸将上清液pH调至4.0-4.5，静置30-45min，以8000-10000r/min、4℃离心25-30min，获得沉淀，并用pH4.0去离子水洗涤三次，用少量去离子水分散沉淀，并调pH至6.8-7.2，冷冻干燥得脱脂麦胚蛋白粉。

前述新鲜小麦胚芽可由市售等途径获得，例如，可采用由益海嘉里(昆山)食品有限公司提供的相关产品，脱脂后的小麦胚芽蛋白质含量＞30％。

前述冷冻干燥使用的实验器具亦可通过市售途径获得，比如，可采用美国LABCONCO美国公司销售的相关产品。

(ii)酶解步骤：

在酶反应器中制备浓度为5％-10％(w/v)脱脂麦胚蛋白悬液，用碱调节pH至8.0-8.5，在50-60℃条件下平衡体系30-35min，然后加入0.024AU/g碱性蛋白酶，在50-60℃条件下进行水解反应4h，同时用酸或碱维持反应介质的pH值恒定，水解反应完毕后，酶解液于90-100℃灭酶10min，迅速冷却，以8000-10000r/min，4℃离心30-35min，收集上清液。上清液用少量去离子水稀释，先用滤纸进行真空抽滤，再用0.45μm微孔滤膜过滤，最后采用截留分子量为5000-10000Da超滤膜过滤除去大分子物质，将透过液冷冻干燥得麦胚蛋白酶解物。

在本发明中，所述的蛋白酶可采用诺维信(中国)生物技术有限公司生产的碱性蛋白酶Alcalase2.4L，当然亦可采用其它类似市售产品。

本发明各个步骤中所述的酸选自无机酸(盐酸)，所述的碱选自无机碱(氢氧化钠)。

所述酸或碱的使用浓度在0.5-1.5mol/L范围内。

前述超滤系统可采用美国PALL公司以商品名小型切向流超滤装置销售的产品，膜包采用改性聚醚砜超滤膜。

(iii)大孔吸附树脂分离步骤：

将步骤(ii)得到的麦胚蛋白酶解物溶于双蒸水制备浓度为20-30mg/mL样品溶液，让样品溶液以流速1-2mL/min通过大孔吸附树脂柱，紫外检测器记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后用双蒸水以1-2mL/min流速洗涤1-2个柱体积，再用15％-75％乙醇水溶液以1-2mL/min流速进行洗脱。

在本发明中，大孔吸附树脂分离条件如下：色谱柱：2.6cm×50cm；检测波长：220nm；样品浓度：20-30mg/mL；流速：1-2mL/min。洗脱条件如下：洗脱剂：15％-75％乙醇；流速：1-2mL/min。其分离图谱见图1，用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，得到五个组分，所得组分分别命名为A、B、C、D、E。

所述大孔吸附树脂能通过分子间作用力吸附溶液中的多肽，使盐分与多肽实现分离，同时，本身的多孔性结构也使其具备一定的分子筛作用。由于该树脂与多肽之间为物理性吸附，被吸附的多肽较易洗脱，并具有低成本、高效率、树脂易回收再生等优点，因此大孔吸附树脂分离技术现已大量用于化工、食品、医药等领域。

所述大孔吸附树脂在使用前需要进行如下的预处理：先用无水乙醇浸泡过夜，然后用无水乙醇清洗至220nm无吸收峰，使用前再用双蒸水清洗。

所述大孔吸附树脂可采用江苏苏青水处理工程集团有限公司提供的DA201-C型产品。

(iv)蒸发浓缩步骤：

步骤(iii)得到的乙醇洗脱液在温度45-55℃下进行旋转蒸发，将浓缩的组分进行冷冻干燥，再进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分得到麦胚蛋白抗氧化肽-1。

前述旋转蒸发浓缩可通过上海亚荣生化仪器厂提供的RE-52A旋转蒸发器而实施，且不限于此。

冷冻干燥使用的设备如前面所述的设备。

(v)凝胶过滤色谱分离步骤：

将步骤(iv)得到的麦胚蛋白抗氧化肽-1用双蒸水制备成4-5mg/mL溶液，以0.5-1mL/min流速通过美国GE公司生产的Superdex Peptide10/300GL凝胶过滤色谱柱，再用双蒸水以0.5-1mL/min流速进行洗脱，按照洗脱峰收集各组分进行冷冻干燥，再进行抗氧化活性的测定，收集抗氧化活性最强的组分得到麦胚蛋白抗氧化肽-2。

在本发明中，凝胶过滤色谱分离条件如下：检测波长：280nm；柱温：25℃；上样流速0.5-1mL/min；进样浓度：4-5mg/mL；进样量：≤0.5mL。

洗脱条件如下：双蒸水，洗脱流速0.5-1mL/min。其分离图谱见图2，组分B经凝胶柱分离，获得五个组分，所得组分分别命名为a，b，c，d，e。。

冷冻干燥使用的设备如前面所述的设备。

(vi)质谱分析多肽氨基酸序列：

将步骤(v)得到的麦胚蛋白抗氧化肽-2以业界习用的方式测序，例如，使用超高分辨飞行时间质谱仪分析氨基酸序列，得到母离子m/z1221Da的氨基酸序列为HWPLHKVHAP和母离子m/z2168Da氨基酸序列为PKKSDRCFTLRKCAHTYN的两个肽段。

所述质谱仪是美国AB SCIEX公司生产的5800MALDI TOF/TOF超高分辨飞行时间质谱仪，其具体步骤如下：麦胚蛋白抗氧化肽-2样品与等体积基质溶液(CHC与50％乙腈水溶液配制而成，终浓度为10mg/mL)均匀混合，点0.5μL样品于MALDI靶板点样空中，自然干燥后再点0.5μLCHCA(0.5g/L)溶液，室温下自然干燥。质谱仪条件如下：OptiBeam同轴激光器，激光波长为355nm，离子加速电压为20kV，频率为1kHz，正离子反射模式采集数据，质谱扫描范围为m/z500-3000Da，测定结果显示，在谱图中，信号较强的母离子为m/z1221.5859和m/z2168.0796，由于这两个峰均为单一分子离子峰，即为单一肽，由此得出，组分B主要由分子量为1221Da和2168Da的肽段组成。。质谱分析后，将样品的一级质谱图与空白对照对比，选取有显著差异的肽段离子进行串联质谱分析，测试结果显示，图谱中主要的a型、b型和y型离子峰，并通过手动计算推测，其中分子量为1221Da的肽段由10个氨基酸残基组成，一级序列为His-Trp-Pro-Leu-His-Lys-Val-His-Ala-Pro(简称为HWPLHKVHAP)；分子量为2168Da的肽段由18个氨基酸残基组成，一级序列为Pro-Lys-Lys-Ser-Asp-Arg-Cys-Phe-Thr-Leu-Asp-Lys-Cys-Ala-His-Thr-Tyr-Asn(简称为PKKSDRCFTLRKCAHTYN)。

本发明的麦胚蛋白抗氧化肽制备方法，其特点在于采用超滤技术实现脱盐和除杂蛋白，利用大孔吸附树脂和凝胶过滤色谱分离纯化得到的麦胚蛋白抗氧化由两个氨基酸序列明确的肽段组成，其序列详见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。

前述麦胚蛋白抗氧化肽可在制备治疗氧化应激损伤中的药品、食物等之中应用，其能够显著提高H₂O₂诱导PC12氧化损伤模型的细胞存活率，当剂量为1mg/mL时，PC12细胞存活率可提高34.43±2.45％。

作为较为优选的实施方案之一，前述麦胚蛋白抗氧化肽对H₂O₂诱导PC12氧化损伤细胞模型的保护作用可按照以下方法测定：

PC12细胞的培养：PC12细胞采用高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)培养，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中。细胞单层培养，用0.25％胰蛋白酶溶液消化进行传代培养。

PC12细胞氧化损伤模型(实验模型组)的建立：PC12细胞以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于96孔板中，培养48h，每孔加入200μmol/L H₂O₂溶液(溶于细胞培养液，经0.22μm滤膜过滤除杂除菌)，培养2h。

PC12细胞存活率的测定：PC12细胞以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于96孔板中，培养24h，加入1mg/mL麦胚蛋白抗氧化肽溶液(溶于细胞培养液，经0.22μm滤膜过滤除杂除菌)，继续培养24h，每孔加入200μmol/L H₂O₂溶液，培养2h。除去培养液，每孔加入20μLMTT溶液(浓度为5mg/mL)，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养4h。除去培养液，每孔加入150μL DMSO溶液，振荡10min，酶标仪测定96孔板各孔的吸光值A_570nm。

细胞存活率(％)由以下公式计算：

式中，A-实验组的A_570nm；

A₀-对照组的A_570nm。

以下结合一较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

新鲜小麦胚芽经正己烷脱脂，置于室温风干后，粉碎过筛(60目)得脱脂麦胚粉。制备浓度为10％(w/v)的脱脂麦胚去离子水溶液，用1mol/LNaOH调pH至9.0，恒温搅拌提取1h，以8000r/min、4℃离心25min，重复上述碱溶过程，合并两次上清液。用1mol/L HCl将上清液pH调至4.0，静置30min，以8000r/min、4℃离心25min，除去上清液得沉淀，并用pH4.0去离子水洗涤三次，用少量去离子水分散沉淀，并调pH至7.0，冷冻干燥后得脱脂麦胚蛋白粉。

将浓度为6％(w/v)脱脂麦胚蛋白悬液用1mol/L NaOH调pH至8.0，于55℃恒温水浴平衡30min，加0.024AU/g碱性蛋白酶进行水解反应(反应过程中用0.5mol/L NaOH或0.5mol/L HCl维持反应pH值恒定)，水解反应240min，完毕后，酶解液于100℃水浴灭酶10min，迅速冷却，以8000r/min，4℃离心30min，收集上清液。上清液用少量去离子水稀释，先用滤纸进行真空抽滤，再用0.45μm微孔滤膜过滤，最后采用截留分子量为5000Da超滤膜过滤除去大分子物质，将透过液冷冻干燥，所得的麦胚蛋白酶解物可使H₂O₂诱导PC12氧化损伤模型的细胞存活率提高32.85％，结果如表1所示。

表1麦胚蛋白酶解物对氧化损伤PC12细胞存活率的影响

实验分组	模型组	麦胚蛋白酶解物
			细胞存活率(％)	51.54±1.51	84.39±1.61

采用江苏苏青水处理工程集团有限公司以商品名DA201-C销售的大孔吸附树脂对麦胚蛋白酶解物进行分离：大孔吸附树脂经预处理后装入规格为2.6cm×50cm层析柱中，将浓度为20mg/mL的样品溶液以1mL/min流速流经层析柱，紫外检测器记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样。用双蒸水以1mL/min流速洗涤层析柱2个柱体积，再用不同浓度的乙醇溶液(浓度分别为15％、35％、55％和75％)以2mL/min流速进行梯度洗脱，自动收集器以5min/管收集洗脱峰，采用上海亚荣生化仪器厂以商品名RE-52A旋转蒸发器销售的旋转蒸发浓缩仪对洗脱液进行真空浓缩，冷冻干燥，35％乙醇洗脱组分B对H₂O₂诱导PC12氧化损伤模型的保护作用最强，可使细胞存活率提高33.51％，结果如表2所示。

表2乙醇洗脱各组分对氧化损伤PC12细胞存活率的影响

再将获得的组分B用双蒸水制备成4mg/mL溶液，以0.5mL/min流速通过美国GE公司生产的Superdex Peptide10/300GL凝胶过滤色谱柱，再用双蒸水以0.5mL/min流速进行洗脱，按照洗脱峰收集各组分进行冷冻干燥，组分B-b对H₂O₂诱导PC12氧化损伤模型的保护作用最强，可使细胞存活率提高34.43％，结果如表3所示。

表3凝胶过滤各组分对氧化损伤PC12细胞存活率的影响

最后采用MALDI TOF/TOF MS分析麦胚抗氧化肽B-b，B-b主要由分子量为1221Da和2168Da的肽段组成。进一步用MALDI TOF/TOF分别获得相应肽片段的MS/MS图，经分析推测，其中分子量为1221Da的肽段由10个氨基酸残基组成，一级序列为His-Trp-Pro-Leu-His-Lys-Val-His-Ala-Pro(简称为HWPLHKVHAP)；分子量为2168Da的肽段由18个氨基酸残基组成，一级序列为Pro-Lys-Lys-Ser-Asp-Arg-Cys-Phe-Thr-Leu-Asp-Lys-Cys-Ala-His-Thr-Tyr-Asn(简称为PKKSD RCFTLRKCAHTYN)。

最后应说明的是，以上实施方案仅用以说明本发明装置的技术方案，而非对其限制；尽管前述方案对本发明装置进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述方案所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明装置方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽，其特征在于，它包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列。

2.一种小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(i)将新鲜小麦胚芽依次经脱脂、干燥、粉碎形成脱脂麦胚粉，再经碱沉酸提方法获得脱脂麦胚蛋白粉；

(ii)将脱脂麦胚蛋白粉溶于水配置成脱脂麦胚蛋白悬液，并调节pH值8.0-8.5，在50-60℃平衡30min以上，然后加入碱性蛋白酶，在50-60℃进行水解反应，同时维持反应体系的pH值保持恒定，水解反应完毕后，将酶解液于90-100℃灭酶10min以上，迅速冷却，在4℃以8000r/min以上的速度离心30min以上，收集上清液，并以截留分子量为5000-10000Da超滤膜过滤除去大分子物质，将滤液冷冻干燥得麦胚蛋白酶解物；

(iii)将麦胚蛋白酶解物溶于水配置成样品溶液，并使样品溶液通过大孔吸附树脂柱，同时以紫外检测器记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后依次用水和体积浓度为15-75％的乙醇水溶液进行洗涤和洗脱；

(iv)步骤(iii)得到的乙醇洗脱液在温度45-55℃下蒸发浓缩，再依次进行冷冻干燥和抗氧化活性，收集抗氧化活性最强的组分；

(v)将步骤(iv)所获抗氧化活性最强的组分配置成水溶液，并通过凝胶过滤色谱柱，再用水进行洗脱，按照洗脱峰收集各组分进行冷冻干燥，并进行抗氧化活性的测定，再次收集抗氧化活性最强的组分，即为具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列的小麦胚芽蛋白源抗氧化肽。

3.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤(i)包括：将经正己烷脱脂的新鲜小麦胚芽，置于室温风干后，粉碎过60-80目筛得脱脂麦胚粉，采用碱沉酸提方法得脱脂麦胚蛋白粉。

4.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤(ii)包括：将脱脂麦胚蛋白粉溶于水形成浓度为5w/v％-10w/v％的脱脂麦胚蛋白悬液，用碱调节pH值至8.0-8.5，在50-60℃条件下平衡30-40min，然后加入0.024AU/g碱性蛋白酶，在50-60℃条件下进行水解反应4h以上，同时用酸或碱维持反应体系的pH值恒定，水解反应完毕后，将酶解液于90-100℃水浴灭酶10-15min，迅速冷却，在4℃以8000-10000r/min的转速离心30-35min，收集上清液，将上清液依次以普通滤纸和0.45μm微孔滤膜过滤，再采用截留分子量为5000-10000Da超滤膜过滤除去大分子物质，将滤液冷冻干燥，获得麦胚蛋白酶解物。

5.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤(iii)包括：将步骤(ii)所获麦胚蛋白酶解物溶于水形成浓度为20-30mg/mL的样品溶液，让样品溶液以1-2mL/min流速通过大孔吸附树脂柱，紫外检测器记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后用水以1-2mL/min流速洗涤1-2个柱体积，再用体积浓度为15-75％的乙醇水溶液以1-2mL/min流速进行洗脱。

6.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤(iv)包括：将步骤(iii)所获乙醇洗脱液在温度45-55℃下进行旋转蒸发，再将浓缩组分进行冷冻干燥，而后进行抗氧化活性的测定，并收集抗氧化活性最强的组分。

7.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤(v)包括：将步骤(iv)所获抗氧化活性最强的组分溶于水形成浓度为4-5mg/mL的溶液，以0.5-1mL/min流速通过凝胶过滤色谱柱，再用水以0.5-1mL/min流速进行洗脱，按照洗脱峰收集各组分进行冷冻干燥，再进行抗氧化活性的测定，再次收集抗氧化活性最强的组分。

8.根据权利要求2或5所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂包括DA201-C。

9.根据权利要求2或7所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于，所述凝胶过滤色谱柱包括Superdex Peptide10/300GL预装柱。

10.权利要求1所述小麦胚芽蛋白源抗氧化肽在保护氧化损伤细胞中的应用。

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