CN107532191B - 西兰花蛋白肽的制备方法、制备得到的西兰花蛋白肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种西兰花蛋白肽的制备方法，该方法以西兰花蛋白为原料，经过预处理、酶解、灭酶活、分离及干燥等步骤制备得到西兰花蛋白肽粉。本发明的方法工艺稳定，成本低，非常适合工业化生产。本发明还涉及所制备的西兰花蛋白肽及其在抗氧化、降胆固醇、降血脂中的用途。

Description

西兰花蛋白肽的制备方法、制备得到的西兰花蛋白肽及其 应用
技术领域
本发明涉及西兰花蛋白，具体地，涉及西兰花蛋白肽的制备方法以及制备得到的西兰花蛋白肽的用途。
背景技术
西兰花(Brassica oleracea var.italia)为十字花科芸苔属甘蓝变种，原产意大利，含有丰富的生物活性物质和营养物质，被誉为“蔬菜皇冠”。西兰花中的营养成分不仅含量高，而且十分全面，主要包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素C和胡萝卜素等。据分析，每100g新鲜西兰花的花球中，含蛋白质3.5g-4.5g，是菜花的3倍，番茄的4倍。专利ZL200910091131.4公开了一种西兰花叶蛋白及其制备方法，其通过调酸加热或调酸加絮凝剂的方法絮凝西兰花压榨汁得到絮凝蛋白，然后通过烘干絮凝蛋白得到西兰花叶蛋白。
随着营养学等研究的深入，蛋白肽的生物功能越来越受到人们的重视。蛋白肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是蛋白质的结构与功能片段，具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。蛋白肽具有多种生物活性，如：免疫调节，抗血栓，抗高血压，降胆固醇，抑制细菌、病毒，抗癌作用，抗氧化和清除自由基作用，改善元素吸收和矿物质运输，促进生长等。现代营养学研究发现人体摄入的蛋白质经消化道中的酶水解后，主要以寡肽的形式被消化吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小(励建荣，封平.功能肽的研究进展.食品科学，2004，25(11):415-419)，所以多肽能比蛋白质和游离氨基酸更易更快的被机体吸收利用，且蛋白质以多肽的形式被吸收，也有利于最大限度的利用其生物活性功能。国外市场上成熟的蛋白肽类产品有日本的玉米蛋白肽早餐饮料，韩国的牛奶蛋白肽解酒饮品，我国市场上有大豆蛋白肽免疫调节保健品，牛奶蛋白肽营养补充剂等产品。
鉴于西兰花中高的蛋白质含量，以此为原料生产西兰花蛋白肽可以为西兰花的高附加值利用提供新途径。本发明选用不同的酶来水解西兰花蛋白，筛选出具有抗氧化及降胆固醇、降血脂活性的专一性强的西兰花蛋白肽粉。
发明内容
本发明的目的在于提供一种西兰花蛋白肽的制备方法及其用途。
一方面，本发明提供了一种制备西兰花蛋白肽的方法，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入200-600单位/克原料的中性蛋白酶，控制溶液的温度在50±1℃，然后用NaOH调节所得溶液的pH至6.0-7.0，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
其中，步骤(a)中加入无水硫酸钠，目的是使蛋白中的二硫键断裂，通过加入EDTA，可以很好的络合金属离子，从而降低金属离子对后续步骤中蛋白酶活性的影响。
该方法制备得到的西兰花蛋白肽具有很好的抗氧化作用，其DPPH自由基清除率可达到还原型谷胱甘肽的10％(约等于10％质量GSH的还原力)；此外，根据该方法制备得到的西兰花蛋白肽还能够显著降低生物体内的总胆固醇，因此可以用于药品领域中。
另一方面，本发明还提供了另一种制备西兰花蛋白肽的方法，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入1000-3000单位/克原料的木瓜蛋白酶，控制溶液的温度在50±1℃，然后用NaOH调节所得溶液的pH至6.5-7.0，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
其中，步骤(a)中加入无水硫酸钠，目的是使蛋白中的二硫键断裂，通过加入EDTA，可以很好的络合金属离子，从而降低金属离子对后续步骤中蛋白酶活性的影响。
该方法制备得到的西兰花蛋白肽具有很好的降胆固醇和降血脂作用，因此可以用于药品领域中。
第三个方面，本发明进一步提供了一种西兰花蛋白肽的制备方法，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入200-600单位/克原料的碱性蛋白酶，控制溶液的温度在50±1℃，然后用NaOH调节所得溶液的pH至9.0-9.5，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
其中，步骤(a)中加入无水硫酸钠，目的是使蛋白中的二硫键断裂，通过加入EDTA，可以很好的络合金属离子，从而降低金属离子对后续步骤中蛋白酶活性的影响。
第四个方面，本发明进一步提供了一种西兰花蛋白肽的制备方法，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入5-15单位/克原料的胰蛋白酶，控制溶液的温度在50±1℃，然后用NaOH调节所得溶液的pH至8.0-8.5，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
其中，步骤(a)中加入无水硫酸钠，目的是使蛋白中的二硫键断裂，通过加入EDTA，可以很好的络合金属离子，从而降低金属离子对后续步骤中蛋白酶活性的影响。
第五个方面，本发明进一步提供了一种西兰花蛋白肽的制备方法，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入5-15单位/克原料的胃蛋白酶，控制溶液的温度在36-38℃，然后用NaOH调节所得溶液的pH至1.5-2.5，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
其中，步骤(a)中加入无水硫酸钠，目的是使蛋白中的二硫键断裂，通过加入EDTA，可以很好的络合金属离子，从而降低金属离子对后续步骤中蛋白酶活性的影响。
第六个方面，本发明进一步提供了一种西兰花蛋白肽的制备方法，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入1000-5000单位/克原料的菠萝蛋白酶，控制溶液的温度在40±1℃，然后用NaOH调节所得溶液的pH至6.0-7.0，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
其中，步骤(a)中加入无水硫酸钠，目的是使蛋白中的二硫键断裂，通过加入EDTA，可以很好的络合金属离子，从而降低金属离子对后续步骤中蛋白酶活性的影响。
第七个方面，本发明进一步提供了一种西兰花蛋白肽的制备方法，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水，形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入5-3600单位/克原料的复合蛋白酶，控制溶液的温度在50±1℃，在0.5-1小时内将溶液的pH控制在8.0-8.5，之后不再控制pH值，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
其中，步骤(a)中加入无水硫酸钠，目的是使蛋白中的二硫键断裂，通过加入EDTA，可以很好的络合金属离子，从而降低金属离子对后续步骤中蛋白酶活性的影响。
其中，所述复合蛋白酶选自胰蛋白酶和中性蛋白酶，或碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，或碱性蛋白酶和中性蛋白酶。
以该方法(例如，使用胰蛋白酶与中性蛋白酶的复合蛋白酶)制备得到的西兰花蛋白肽具有很好的抗氧化作用，其DPPH自由基清除率可达到还原型谷胱甘肽的10％(约等于10％质量GSH的还原力)，因此可以用于药品领域中。
本发明的方法中，所述“原料”、“西兰花蛋白”与“原料西兰花蛋白”具有相同的含义。
在第八个方面，本发明提供一种根据本发明的西兰花蛋白肽的制备方法制备得到的西兰花蛋白肽。
采用本发明所述方法制备得到的西兰花蛋白肽具有以下优点：
(1)本发明制备得到的西兰花蛋白肽纯度高，其TCA(三氯乙酸)酸溶性蛋白含量超过90％，分子量分布小于10000的占90％以上，游离氨基酸占5-8％。
(2)本发明的工艺方案稳定，生产制备的西兰花蛋白肽酸溶性蛋白含量、游离氨基酸、分子量分布等质量参数变化小，适于工业化生产。
以下通过实施例对本发明进行进一步说明。必须指出，这些实施例是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
具体实施方式
以下各实施例中，如无特殊说明，所使用的试剂、仪器都是本领域常用试剂、仪器，可以从化学或生物制品/制剂公司购买；以下实施例中使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据现有技术或生产商提供的操作手册可以毫无疑义地知道这些实验的操作过程并获得相应结果。
实施例1：制备原料西兰花蛋白。
(1)原料粉碎：将20kg整株西兰花洗净，晾干，用粉碎机将其打碎，然后压榨并用纱布过滤(300目)得压榨汁9.5L。
(2)加热：将上步的压榨汁放入锅中加热至70℃，蛋白絮凝浮在上层，至下层无绿色为止。
(3)分离：将加热分层的压榨汁过滤得滤饼(絮凝蛋白)和滤液。
(4)喷干：向过滤得到的絮凝蛋白中加入2.8L纯化水混合并均质，然后通过喷雾干燥(BUCHI，小型喷雾干燥仪B-290)得到682g原料西兰花蛋白。
实施例2
(1)蛋白预处理：取实施例1制得的西兰花蛋白100g，加入500ml纯化水，0.05g无水亚硫酸钠，0.02g的EDTA，搅拌形成西兰花蛋白浆。
(2)蛋白酶解：向预处理好的西兰花蛋白浆中加入0.3g的胰蛋白酶(4000U/g)和0.3g的中性蛋白酶(80万U/g)，50℃水浴搅拌，并用NaOH溶液控制浆液的pH为8.2，酶解共持续3.5h。
(3)酶解终止和分离：将完成酶解的蛋白浆加热至80℃，维持5min，使酶灭活。冷却至室温后，用高速离心机10000rpm离心10min，再将上清液用200nm的膜过滤，得到含西兰花蛋白肽的上清液约400ml。此时以游离氮为常规指标，按GB12143.2-1989测得上清液中游离氮含量为1400mg/l。
(4)脱苦：向得到的400ml上清液中加入0.5％(W/V)的活性炭，脱苦30min后过滤除去活性炭。
(5)浓缩：对蛋白肽溶液用三效降膜蒸发器浓缩，至其固体含量大于10％。
(6)喷雾干燥：将步骤(4)得到的西兰花蛋白肽上清液直接通过喷雾干燥(BUCHI，小型喷雾干燥仪B-290)，得到西兰花蛋白肽30g。
所得西兰花蛋白肽样品的检测分析各项指标如表1所示，所述检测参照大豆蛋白肽国标规定检测方法。
表1：西兰花蛋白肽样品的检测分析结果
Figure GDA0002981881480000081
实施例3
(1)样品预处理：称取实施例1制得的西兰花蛋白共6份，每份10g，编号A、B、C、D、E、F，分别添加50ml蒸馏水，摇匀，再加入5mg固体无水亚硫酸钠和2mg固体EDTA。
(2)蛋白酶解：向预处理好的6份西兰花蛋白浆液中按照表2的内容分别加入蛋白酶、控制pH值和温度，
表2：蛋白酶解配方
Figure GDA0002981881480000082
Figure GDA0002981881480000091
酶解时间共持续3.5-4.0h。
(3)酶解终止和分离：将完成酶解的蛋白浆A、B、C、D、E、F分别加热至80℃，维持5min，使酶灭活，待降至室温后，用400目滤布过滤取上清液。然后再分别用200nm的膜过滤后，得到含西兰花蛋白肽的上清液。
(4)将得到的西兰花蛋白肽上清液冻干，得到不同酶酶解的西兰花蛋白肽样品。
实施例4
按实施例2制备得到的中性蛋白酶与胰蛋白酶酶解肽，以及实施例3制备得到的碱性蛋白酶酶解肽、胰蛋白酶酶解肽、中性蛋白酶酶解肽、木瓜蛋白酶酶解肽和胃蛋白酶酶解肽作为样品，以大豆蛋白肽及还原型谷胱甘肽为对照，进行抗氧化能力测定(DPPH自由基清除率法)。
(1)精确称取DPPH(1，1-二苯基-2-苦肼基)25mg，用无水乙醇溶解并定容至250ml棕色容量瓶中，得浓度为0.1mg/ml的DPPH溶液，避光保存，备用。
(2)分别取不同浓度的各样品溶液(100mg/ml，10mg/ml，1mg/ml，0.1mg/ml)1.0ml，置10ml比色管中，加入4.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min。
(3)以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率(％)＝A0-(As-Ac)/A0×100％
公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值
As—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值
Ac—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值
将实验重复三次，求得清除率的平均值(如有浑浊，离心后再测定)。结果如表3所示。
表3：西兰花各蛋白肽抗氧化力测定结果
Figure GDA0002981881480000092
Figure GDA0002981881480000101
从表3中可以看出，中性蛋白酶酶解肽，中性蛋白酶与胰蛋白酶酶解肽的DPPH自由基清除率明显好于其它单酶酶解的清除率，可达到还原型谷胱甘肽的10％(约等于10％质量GSH的还原力)，明显优于大豆蛋白肽。
实施例5
考察实施例2和3得到的蛋白酶酶解肽对高胆固醇血症金黄地鼠血脂水平的影响。
(1)实验材料
(1.1)动物
金黄地鼠，雄性，120只，体重70-90g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证编号：SCXK(京)2006-0009。
动物饲养于浙江海正药业股份有限公司中央研究院药理中心动物房，室温20-28℃，湿度40-70﹪，通风次数8-10次/小时。喂饲饲料为浙江省实验动物中心提供的标准饲料(鼠饲料)，执行标准为GB14924-2001。高脂饲料为自制(配方：0.3％胆固醇，20％棕榈油，79.7％基础饲料)。
(1.2)药品与试剂
受试药：实施例2得到的胰蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解肽，实施例3得到的中性蛋白酶解解肽、菠萝蛋白酶解解肽、木瓜蛋白酶解解肽、胃蛋白酶解解肽、胰蛋白酶解解肽、碱性蛋白酶解解肽。
以上药物在4℃-8℃保存，以1％CMC(羧甲基纤维素钠CMC-Na)配制所需浓度。
试剂及试剂盒：
乙醚：分析纯，杭州化学试剂有限公司，批号：20131112；
总胆固醇(TC)，批号：20140725；
低密度脂蛋白(LDL-C)由上海科华生物工程股份有限公司提供。
(1.3)仪器
希森美康全自动生化仪，型号CHEX-180。
(2.)试验方法和结果
(2.1)方法
参考国家食品药品监督管理局第28号令，《药品注册管理办法》(局长：邵明立签发，2007年10月1日)和新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学)等规定及文献，适应性饲养7天，自由饮食饮水，光照周期10h/14h，第8天，动物换喂高脂饲料，喂饲3周后，将动物乙醚麻醉，称重后，眶后静脉采血0.5ml，0.5％肝素抗凝，5000rpm，离心10min，吸取血浆，用全自动生化仪测定血浆中TC、LDL-C水平，并根据动物血脂水平和动物体重分组，分组情况如下表：
表4：分组情况
Figure GDA0002981881480000111
模型组给予等体积溶媒，给药期间给药组和模型组继续喂高脂饲料，给药10天后，将动物乙醚麻醉，称重后，眶后静脉采血0.5ml，肝素抗凝，5000rpm，离心10min，吸取血浆，用全自动生化仪测定血浆中TC和LDL-C水平。
(2.2)数据处理：
全部实验结果用
Figure GDA0002981881480000112
表示，组间两两比较采用t-检验。P<0.05具有统计学意义。
(2.3)结果
如表5所示，与模型组比较，中性蛋白酶酶解肽、木瓜蛋白酶酶解肽均可显著降低TC(*P＜0.05，**P＜0.01)；木瓜蛋白酶酶解肽可以显著降低LDL-C(*P＜0.05，**P＜0.01)。
表5：西兰花各蛋白肽经口给药对高胆固醇模型金黄地鼠血脂水平的影响
Figure GDA0002981881480000121
Figure GDA0002981881480000122
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

Claims (2)

1.根据下述方法制备得到的西兰花蛋白肽在制备具有降胆固醇、降血脂作用的药品中的用途：
所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入200-600单位/克原料的中性蛋白酶，控制溶液的温度在50±1℃，然后用NaOH调节所得溶液的pH至6.0-7.0，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽。
2.一种西兰花蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)蛋白预处理：在原料西兰花蛋白中加入质量为西兰花蛋白4-8倍的水形成蛋白浆，再向蛋白浆中加入质量体积比为0.05-0.1g/l的无水亚硫酸钠和质量体积比为0.02-0.05g/l的EDTA；
(b)蛋白酶解：在步骤(a)所得浆液中加入5-3600单位/克原料的复合蛋白酶，控制溶液的温度在50±1℃，在0.5-1小时内将溶液的pH控制在8.0-8.5，之后不再控制pH值，酶解时间为3-4小时；
(c)终止酶解：将步骤(b)所得酶解液加热至80-90℃，维持5-15分钟，使酶灭活后，冷却至室温；
(d)任选的，将步骤(c)所得液体离心或过滤；
(e)将步骤(c)或(d)所得液体用孔径为100-500nm的微滤膜过滤；
(f)任选的，将步骤(e)所得滤液用活性炭或白土进行脱苦处理；
(g)将步骤(e)或(f)所得液体浓缩和/或干燥得到西兰花蛋白肽；
其中，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和中性蛋白酶。
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