JP6800211B2

JP6800211B2 - ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法、それによって調製されたブロッコリータンパク質のペプチド、および、その使用

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Publication number: JP6800211B2
Application number: JP2018507765A
Authority: JP
Inventors: 王継棟; 齊歡; 鄭暁鶴; 張輝; 王永東; 唐海玲; 林海鳴
Original assignee: Zhejiang Teley Biotechnology Co ltd; Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Teley Biotechnology Co ltd; Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-05-04
Filing date: 2016-05-03
Publication date: 2020-12-16
Anticipated expiration: 2036-05-03
Also published as: WO2016177309A1; US20180147248A1; CN107532191B; CN107532191A; JP2018518192A; US20190038694A2; US10548933B2; CN106191183A; CN106191183B

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、ブロッコリータンパク質のペプチドに関するものであり、特に、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法、および、得られたブロッコリータンパク質のペプチドの使用に関するものである。

〔背景技術〕
ブロッコリー（ブラシカ・オレラケア・ウァリエータス・イタリカ：Brassica oleracea var. italia）は、アブラナ科アブラナ属キャベツ（cruciferous Brassica cabbage）の一種であり、元々は、イタリア原産である。ブロッコリーは、生物活性物質および栄養成分に富んでおり、「野菜の王（vegetable crown）」として知られている。ブロッコリーの栄養成分は、量が多いのみならず、種類が非常に多い。ブロッコリーの栄養成分としては、主として、タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル、ビタミンＣ、および、カロテンなどが挙げられる。分析によれば、１００ｇの新鮮なブロッコリーの茎（bulb）あたり、３．５ｇ〜４．５ｇのタンパク質が含まれる。当該量は、カリフラワーに含まれるタンパク質の３倍であり、トマトに含まれるタンパク質の４倍である。特許ＺＬ２００９１００９１１３１．４には、ブロッコリーの葉のタンパク質、および、当該タンパク質の調製方法が開示されている。当該特許文献では、加熱しながら酸を加えること、または、酸と凝集剤とを加えることによって、ブロッコリーのジュースを凝集させ、これによって凝集タンパク質を得、次いで、当該凝集タンパク質を乾燥させることによって、ブロッコリーの葉のタンパク質を得ている。

栄養成分などに関する研究が深まるにつれて、タンパク質のペプチドが有する生物学的機能に対して、より多くの注目が集まりつつある。タンパク質のペプチドは、アミノ酸とタンパク質との間に位置する分子構造を有する、化合物の一種である。タンパク質のペプチドは、タンパク質の、構造的な断片および機能的な断片である。また、タンパク質のペプチドは、生体の生理的機能を制御し、かつ、生体に栄養成分を供給するという、２つの機能を有している。タンパク質のペプチは、様々な生物活性を有しており、当該生物活性としては、例えば、免疫制御、抗血栓（anti-thrombosis）、抗高血圧、コレステロール低下、バクテリアおよびウイルスの阻害、抗癌作用、抗酸化、抗スカベンジングフリーラジカル、成分吸収およびミネラル輸送の改善、および、成長促進などを挙げることができる。人体に吸収されたタンパク質は、消化管内にて酵素によって加水分解された後、主としてオリゴペプチドの形態に消化されて吸収され、そして、遊離アミノ酸の形態にて吸収されるタンパク質の割合は非常に少ないことが、近年の栄養学的な研究によって明らかになった（Li Jianrong, Feng Ping. Progress in Study of Functional Polypeptides. Food Science, 2004, 25 (11): 415-419）。ポリペプチドは、タンパク質および遊離アミノ酸よりも、より容易におよびより速く、生体によって吸収および利用され得、タンパク質は、ポリペプチドの形態にて吸収される。そして、ポリペプチドの生物活性な機能を最大限に利用することは、有益でもある。外国の市場に存在する、成熟したタンパク質のペプチド製品（mature protein peptide products）としては、日本における、トウモロコシタンパク質のペプチドの朝食用飲料、および、大韓民国における、牛乳タンパク質のペプチドの非アルコール飲料、が挙げられる。中国の市場では、上述した製品として、大豆タンパク質のペプチドの免疫調整用ヘルスケア製品、および、牛乳タンパク質のペプチドの栄養サプリメントなどが挙げられる。

ブロッコリーはタンパク質の含有量が多いという観点から、原材料としてブロッコリーを用いる、ブロッコリータンパク質のペプチドの製造は、ブロッコリーの高付加価値な利用への新たな道を提供し得る。本発明では、ブロッコリータンパク質を加水分解するために異なる酵素を選択し、高い特異性に基づいてブロッコリータンパク質の粉末を選別している。当該粉末は、抗酸化活性、コレステロール低下活性、および、脂質低下活性を有し、かつ、関連する機能を有する健康食品の開発に用いられ得る。加えて、我々が開発したブロッコリータンパク質のペプチドは、タンパク質サプリメントとしても開発され得、または、化粧品、食品添加物、若しくは飲料などの製品の原材料としても使用され得る。

〔発明の概要〕
本発明の目的の一つは、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法、および、ブロッコリータンパク質のペプチドの使用を提供することである。

本発明の一態様は、（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプ（protein pulp）を形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対して中性プロテアーゼ（原材料１ｇあたり２００〜６００ユニットの中性プロテアーゼ）を加え、当該溶液の温度を５０±１℃に制御し、得られた溶液のｐＨをＮａＯＨによって６．０〜７．０に調節し、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイ（clay）を用いた除去処理（debittering treatment）に供する工程と、（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを得る工程と、を有する、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法である。

ここで、タンパク質内のジスルフィド結合を分解するために、（ａ）の工程にて、無水亜硫酸ナトリウムが加えられる。金属イオンは、ＥＤＴＡを加えることによって、効率良く複合体化され得る。これによって、次の工程において、金属イオンがプロテアーゼ活性に及ぼす影響を低減させる。

当該方法によって調製されたブロッコリータンパク質のペプチドは、良好な抗酸化作用を有し、当該ペプチドのＤＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート（DPPH free radical scavenging rate）は、還元グルタチオンのＤＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート（ＧＳＨの略１０質量％の還元力）の１０％に達し得る。加えて、当該方法によって調製されたブロッコリータンパク質のペプチドは、また、生体内の全コレステロールを顕著に減少させ、それ故に、食品、薬、ヘルスケア製品、または、化粧品などの分野に利用され得る。

本発明の別の態様は、（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプを形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対してパパイン（原材料１ｇあたり１０００〜３０００ユニットのパパイン）を加え、当該溶液の温度を５０±１℃に制御し、得られた溶液のｐＨをＮａＯＨによって６．５〜７．０に調節し、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイを用いた除去処理に供する工程と、（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを得る工程と、を有する、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法である。

当該方法によって調製されたブロッコリータンパク質のペプチドは、良好なコレステロール低下作用、および、良好な血中脂質低下作用を有し、それ故に、食品、薬、または、ヘルスケア製品などの分野に利用され得る。

本発明の第三の態様は、（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプを形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対してアルカリプロテアーゼ（原材料１ｇあたり２００〜６００ユニットのアルカリプロテアーゼ）を加え、当該溶液の温度を５０±１℃に制御し、得られた溶液のｐＨをＮａＯＨによって９．０〜９．５に調節し、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイを用いた除去処理に供する工程と、（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを得る工程と、を有する、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法である。

本発明の第四の態様は、（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプを形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対してトリプシン（原材料１ｇあたり５〜１５ユニットのトリプシン）を加え、当該溶液の温度を５０±１℃に制御し、得られた溶液のｐＨをＮａＯＨによって８．０〜８．５に調節し、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイを用いた除去処理に供する工程と、（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを得る工程と、を有する、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法である。

本発明の第五の態様は、（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプを形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対してペプシン（原材料１ｇあたり５〜１５ユニットのペプシン）を加え、当該溶液の温度を３６〜３８℃に制御し、得られた溶液のｐＨをＮａＯＨによって１．５〜２．５に調節し、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイを用いた除去処理に供する工程と、（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを得る工程と、を有する、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法である。

ここで、タンパク質内のジスルフィド結合を分解するために、（ａ）の工程にて、無水亜硫酸ナトリウムが加えられる。複合金属イオン（complex metal ions）は、ＥＤＴＡを加えることによって、効率良く複合体化され得る。これによって、次の工程において、金属イオンがプロテアーゼ活性に及ぼす影響を低減させる。

本発明の第六の態様は、（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプを形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対してブロメライン（bromelain）（原材料１ｇあたり１０００〜５０００ユニットのブロメライン）を加え、当該溶液の温度を４０±１℃に制御し、得られた溶液のｐＨをＮａＯＨによって６．０〜７．０に調節し、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイを用いた除去処理に供する工程と、（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを得る工程と、を有する、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法である。

ここで、タンパク質内のジスルフィド結合を分解するために、（ａ）の工程にて、無水亜硫酸ナトリウムが加えられる。複合金属イオンは、ＥＤＴＡを加えることによって、効率良く複合体化され得る。これによって、次の工程において、金属イオンがプロテアーゼ活性に及ぼす影響を低減させる。

本発明の第七の態様は、（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプを形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対してプロテアーゼの複合物（compound protease）（原材料１ｇあたり５〜３６００ユニットのプロテアーゼの複合物）を加え、当該溶液の温度を５０±１℃に制御し、当該溶液のｐＨを、０．５〜１時間の間は８．０〜８．５に調節し、その後は調節せず、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイを用いた除去処理に供する工程と、（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを得る工程と、を有する、ブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法である。

ここで、上記プロテアーゼの複合物は、トリプシンおよび中性プロテアーゼの複合物、アルカリプロテアーゼおよびパパインの複合物、または、アルカリプロテアーゼおよび中性プロテアーゼの複合物からなる群より選択されるものである。

当該方法（例えば、トリプシンおよび中性プロテアーゼの、プロテアーゼの複合物を用いる方法）によって調製されたブロッコリータンパク質のペプチドは、良好な抗酸化作用を有し、当該ペプチドのＤＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート（DPPH free radical scavenging rate）は、還元グルタチオンのＤＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート（ＧＳＨの略１０質量％の還元力）の１０％に達し得る。それ故に、当該ペプチドは、食品、薬、ヘルスケア製品、または、化粧品などの分野に利用され得る。

本発明の方法において、「原材料（raw material）」、「ブロッコリータンパク質（broccoli protein）」、および、「原材料であるブロッコリータンパク質（raw material broccoli protein）」は、同じ意味である。

本発明の第八の態様は、本発明のブロッコリータンパク質のペプチドを調製する方法によって調製された、ブロッコリータンパク質のペプチドである。

本発明の方法によって調製されたブロッコリータンパク質のペプチドは、以下のような利点を有している：
（１）本発明の方法によって調製されたブロッコリータンパク質のペプチドは、純度が高く；ブロッコリータンパク質のペプチドにおける、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸：trichloroacetic acid）可溶性タンパク質の含有量は、９０％よりも多く；１００００未満の分子量分布は、９０％以上（above）であり；遊離アミノ酸は、５〜８％である、
（２）本発明における技術的解決方法は、安定であり；質量パラメータ（例えば、酸可溶性タンパク質、遊離アミノ酸の含有量）、および、調製されたブロッコリータンパク質のペプチドの分子量分布が、大きく変わることは無く；工業生産に適している。

以下の実施例に従って、本発明について更に説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではないことが、理解されるべきである。

〔実施例〕
以下の実施例に用いた試薬および器具は、本分野にて一般的に用いられるものであり、特別の定めが無い限り、化学製品／化学調合の会社、または、バイオ製品／バイオ調合の会社から購入することができる。以下の実施例に用いた方法は、本分野にて一般的に用いられる方法である。これらの実験の操作、および、対応する結果を、従来技術、または、製造業者が提供する操作マニュアルから、疑うことなく得られることは、当業者にとって明らかであろう。

＜実施例１：原材料であるブロッコリータンパク質の調製＞
（１）原材料の圧搾（crushing）：ブロッコリー全体（２０ｋｇ）を、洗浄し、乾燥させ、粉砕機を用いて破砕し、圧搾し、そして、ガーゼ（３００メッシュ）を用いて濾過することによって、９．５Ｌの圧搾ジュースを得た。

（２）加熱：最後の工程にて得られた圧搾ジュースを、底部の緑色が無くなるまで、容器の中で７０℃に加熱し、タンパク質の凝集物を、上部に浮かせた。

（３）分離：加熱されて層を形成した圧搾ジュースを濾過することによって、濾過固形物（filter cake）、および、濾過物（filtrate）を得た。

（４）噴霧乾燥：濾過によって得られた凝集したタンパク質に対して、２．８Ｌの精製水を加え、撹拌およびホモジナイズ（homogenized）を行い、次いで、噴霧乾燥（ＢＵＣＨＩ、ＳｍａｌｌＳｐｒａｙＤｒｙｅｒＢ−２９０）によって、６８２ｇの原材料であるブロッコリータンパク質を得た。

＜実施例２＞
（１）タンパク質の前処理：実施例１にて調製したブロッコリータンパク質を取り分け、５００ｍｌの精製水、０．０５ｇの無水亜硫酸ナトリウム、および、０．０２ｇのＥＤＴＡを加え、そして、撹拌することによって、ブロッコリータンパク質パルプ（broccoli protein pulp）を形成した。

（２）タンパク質分解：前処理されたブロッコリータンパク質パルプに対して、０．３ｇのトリプシン（４０００ユニット／ｇ）および０．３ｇの中性プロテアーゼ（８００，０００ユニット／ｇ）を加え、５０℃の湯浴の中で撹拌し、当該パルプのｐＨをＮａＯＨ溶液によって８．２に調節し、合計３．５時間の酵素分解を行った。

（３）酵素分解の終了、および、分離：酵素分解されたタンパク質パルプを８０℃にて５分間加熱することによって、酵素を不活性化させた。当該パルプを室温にまで冷却した後、当該パルプを、１０，０００ｒｐｍにて１０分間、高速遠心器を用いて遠心分離した。次いで、上清を、２００ｎｍの膜を通過させて濾過することによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを含有している略４００ｍｌの上清を得た。ＧＢ１２１４３．２−１９８９にしたがって、遊離窒素を標準指標（regular indicator）として用い、この段階における上清中の遊離窒素の含有量を、１４００ｍｇ／ｌと測定した。

（４）除去（debitterizing）：得られた４００ｍｌの上清に対して、０．５％（ｗ／Ｖ）の活性炭を加えた。除去の後、３０分間濾過することによって、活性炭を取り除いた。

（５）濃縮：タンパク質のペプチを含有している溶液を、３重効果下降膜蒸発器（three-effect falling film evaporato）を用いて、溶液中の固形物の含有量が１０％よりも高くなるまで濃縮した。

（６）噴霧乾燥：（４）の工程にて得られた、ブロッコリータンパク質のペプチドを含有している上清を、噴霧乾燥（ＢＵＣＨＩ、ＳｍａｌｌＳｐｒａｙＤｒｙｅｒＢ−２９０）を用いて直接乾燥させることによって、３０ｇのブロッコリータンパク質のペプチドを得た。

得られたブロッコリータンパク質のペプチドの試験および解析における様々なインデックス（index）を、表１に示す。当該試験は、大豆タンパク質のペプチドのための、国際規格の所定の試験方法を参照している。

＜実施例３＞
（１）サンプルの前処理：実施例１にて調製した６つのブロッコリータンパク質のサンプルを、各々１０ｇ計量し、各々Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦと番号付けし、これらの各々に対して、５０ｍｌの蒸留水を加えた。当該混合物をよく撹拌し、次いで、５ｍｇの無水亜硫酸ナトリウム固形物、および、２ｍｇのＥＤＴＡ固形物を加えた。

（２）タンパク質分解：前処理された６つのブロッコリータンパク質パルプのサンプルに対して、表２にしたがってプロテアーゼを加え、当該６つのサンプルのｐＨおよび温度を、表２にしたがって制御した。

合計３．５〜４．０時間の酵素分解を行った。

（３）酵素分解の終了、および、分離：酵素分解されたタンパク質パルプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦの各々を８０℃にて５分間加熱することによって、酵素を不活性化させた。温度を室温にまで下げた後、当該パルプを、４００メッシュのフィルタークロス（filter cloth）を用いて濾過し、上清を回収した。次いで、濾過された上清の各々を、２００ｎｍの膜を用いて濾過することによって、ブロッコリータンパク質のペプチドを含有している上清を得た。

（４）得られたブロッコリータンパク質のペプチドを含有している上清を凍結乾燥させることによって、異なる酵素を用いて消化した、ブロッコリータンパク質のペプチドサンプルを得た。

＜実施例４＞
実施例３にて調製してサンプルとして用いた、アルカリプロテアーゼによって消化したペプチド、トリプシンによって消化したペプチド、中性プロテアーゼによって消化したペプチド、パパインによって消化したペプチド、および、ペプシンによって消化したペプチドと同様に、実施例２にて調製した、中性プロテアーゼおよびトリプシンによって消化したペプチドの抗酸化能力を、大豆タンパク質のペプチドおよび還元グルタチオンをコントロールとして用いて決定した（ＤＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート法）。

（１）茶色の計量フラスコ内で、２５ｍｇのＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl））を正確に計量し、当該ＤＰＰＨを無水エタノール中に溶解し、体積を２５０ｍＬにした。０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＰＰＨ溶液を得るととともに、当該ＤＰＰＨ溶液を、使用するまで、暗所に保存した。

（２）異なる濃度（１００ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のサンプル溶液１．０ｍＬを計量し、当該サンプル溶液の各々を１０ｍＬの比色分析チューブ（colorimetric tube）に入れ、そこへ、４．０ｍｌのＤＰＰＨ溶液を加えた。当該混合物を、室温、および、暗所にて、３０分間反応させた。

（３）ブランクとして無水エタノールを用い、５１７ｎｍにて、吸光度を測定した。ＤＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレートは、以下の式に従って算出した：
ＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート（％）＝Ａ_０−（Ａ_Ｓ−Ａ_Ｃ）／Ａ_０×１００％
上記の式において、Ａ_０、Ａ_Ｓ、および、Ａ_Ｃは、以下のとおりである：
Ａ_０：１．０ｍＬ蒸留水＋３．０ｍＬＤＰＰＨ溶液、の吸光度、
Ａ_Ｓ：１．０ｍＬサンプル溶液＋３．０ｍＬＤＰＰＨ溶液、の吸光度、
Ａ_Ｃ：１．０ｍＬサンプル溶液＋３．０ｍＬ無水エタノール、の吸光度。

試験を３回繰り返して、スカベンジングレートの平均値を得た（溶液が混濁（turbid）した場合には、遠心分離した後で、測定を行った）。表３に、試験結果を示す。

表３から、（ｉ）中性プロテアーゼによって消化したペプチドのＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート、並びに、中性プロテアーゼおよびトリプシンによって消化したペプチドのＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレートは、他の単一の酵素によって消化したペプチドのＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレートよりも、著しく良好であること、（ｉｉ）中性プロテアーゼによって消化したペプチドのＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレート、並びに、中性プロテアーゼおよびトリプシンによって消化したペプチドのＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレートは、還元グルタチオンのＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレートの１０％に達し得ること（還元力は、ＧＳＨの略１０質量％である）、（ｉｉｉ）ＰＰＨフリーラジカルスカベンジングレートは、大豆タンパク質のペプチドよりも、著しく良好であること、が理解できる。

＜実施例５＞
高コレステロール血症であるゴールデンハムスター血中脂質に対する、実施例２および３にて得られたプロテアーゼによって消化したペプチドの影響を調べた。

（１）実験に用いた材料
（１．１）動物
ゴールデンハムスターとしては、ＢｅｉｊｉｎｇＷｅｉＴｏｎｇＬｉＨｕａＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｎｉｍａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．が提供している、雄、１２０、体重７０〜９０ｇのゴールデンハムスター（番号：ＳＣＸＫ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２００６−０００９）を用いた。

動物は、ＣｅｎｔｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅＯＦＺｈｅｊｉａｎｇＨｉｓｕｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．の薬理センターにある動物舎内で飼育した。なお、飼育環境は、２０〜２８℃の室温、４０〜７０％の湿度、１時間あたり８〜１０回の換気頻度、であった。ハムスターへの給餌は、ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅの実験アニマルセンターが提供している、標準的な給餌（マウス給餌）にしたがった。エグゼクティブスタンダード（executive standard）は、ＧＢ１４９２４−２００１であった。高脂質食としては、自家製のものを用いた（処方：０．３％コレステロール、２０％ヤシ油、７９．７％基本餌）。

（１．２）薬および試薬
試験された薬：（ｉ）実施例２にて得られた、トリプシンおよび中性プロテアーゼによって消化したペプチド、（ｉｉ）実施例３にて得られた、中性プロテアーゼによって消化したペプチド、ブロメラインによって消化したペプチド、パパインによって消化したペプチド、ペプシンによって消化したペプチド、トリプシンによって消化したペプチド、アルカリプロテアーゼによって消化したペプチド。

上述した薬は、４℃〜８℃にて保存され、１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム（sodium carboxymethylcellulose）ＣＭＣ−Ｎａ）を用いて、所望の濃度に調剤した。

試薬およびキット：
エーテル：分析用グレード、ＨａｎｇｚｈｏｕＣｈｅｍｉｃａｌＲｅａｇｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．、バッチナンバー２０１３１１１２、
総コレステロール（total cholesterol：ＴＣ）：バッチナンバー２０１４０７２５、
低密度リポプロテイン（low density lipoprotein：ＬＤＬ−Ｃ）：ＳｈａｎｇｈａｉＫｅｈｕａＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．，Ｌｔｄ．から入手。

（１．３）器具
ＸｉＳｅｎＭｅｉＫａｎｇａｕｔｏｍａｔｉｃｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｚｅｒ、モデルＣＨＥＸ−１８０。

（２）実験方法および結果
規定および文献（例えば、（ｉ）ＳｔａｔｅＦｏｏｄＡＮＤＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎＯｒｄｅｒＮｏ．２８，“ＤｒｕｇＲｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎＭａｎａｇｅｍｅｎｔＭｅａｓｕｒｅｓ”（Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ：ＳｈａｏＭｉｎｇｌｉｉｓｓｕｅｄ，Ｏｃｔｏｂｅｒ１，２００７）、および、（ｉｉ）ＮｅｗＤｒｕｇｓ（Ｗｅｓｔｅｒｎｍｅｄｉｃｉｎｅ）ＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（ＰｈａｒｍａｃｙＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ））を参考にして、ハムスターを、７日間、環境に順応させた。なお、ハムスターには、自由に飲食させ、１０ｈ／１４ｈの明期（light period）とした。８日目に動物に対して高脂質食を与え、当該高脂肪食を３週間与えた。次いで、エーテルを用いて動物に麻酔をかけ（esthetized）、体重を計測した。次いで、眼窩後部の静脈から０．５ｍＬの血液を採取した。０．５％のヘパリンを抗凝血剤として用い、５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することにより、血漿を得た（absorbed）。血漿中のＴＣおよびＬＤＬ−Ｃのレベルは、自動の生化学解析器を用いて測定した。血中脂質のレベル、および、体重に基づいて、動物を区分した。当該区分を、以下の表に示す。

モデルグループのハムスターには、同じ体積の溶剤（menstruum）が与えられた。投与の期間中、投与グループのハムスター、および、モデルグループのハムスターには、継続的に、高脂肪食が与えられた。投与してから１０日後に、エーテルを用いて動物に麻酔をかけ、体重を計測した。次いで、眼窩後部の静脈から０．５ｍＬの血液を採取した。０．５％のヘパリンを抗凝血剤として用い、５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することにより、血漿を得た（absorbed）。血漿中のＴＣおよびＬＤＬ−Ｃのレベルは、自動の生化学解析器を用いて測定した。

（２．２）データ処理
全ての実験結果は、下記の指標を用いて示され、任意の２つのグループの間の比較には、ｔ−ｔｅｓｔを用いた。Ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意であった。

（２．３）結果
表５に示すように、モデルグループと比較して、（ｉ）中性プロテアーゼによって消化したペプチド、および、パパインによって消化したペプチドは、共に、著しくＴＣを低下させることができ（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）、かつ、（ｉｉ）パパインによって消化したペプチドは、著しくＬＤＬ−Ｃを低下させることができた（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。

Claims

（ａ）原材料であるブロッコリータンパク質に対して当該ブロッコリータンパク質の重量の４〜８倍の重量の水を加えて、タンパク質パルプを形成し、更に、当該タンパク質パルプに対して、０．０５〜０．１ｇ／ｌの質量−体積比にて無水亜硫酸ナトリウムを加え、および、０．０２〜０．０５ｇ／ｌの質量−体積比にてＥＤＴＡを加える、タンパク質前処理工程と、
（ｂ）（ａ）の工程にて得られた上記タンパク質パルプに対してプロテアーゼの複合物（原材料１ｇあたり５〜３６００ユニットの、プロテアーゼの複合物）を加え、当該溶液の温度を５０±１℃に制御し、当該溶液のｐＨを、０．５〜１時間の間は８．０〜８．５に調節し、その後は調節せず、３〜４時間かけて酵素分解を行う、タンパク質分解工程と、
（ｃ）（ｂ）の工程にて得られた酵素分解液を８０〜９０℃にて５〜１５分間加熱することによって上記酵素を不活性化させ、当該溶液を室温にまで冷却する、酵素分解終了工程と、
（ｄ）任意で、（ｃ）の工程にて得られた上記溶液を、遠心分離または濾過する工程と、
（ｅ）（ｃ）の工程にて得られた溶液、または、（ｄ）の工程にて得られた溶液を、１００〜５００ｎｍのサイズの孔を有する膜を用いて濾過する工程と、
（ｆ）任意で、（ｅ）の工程にて得られた濾過物を、活性炭またはクレイを用いた除去処理に供する工程と、
（ｇ）（ｅ）の工程にて得られた溶液、または、（ｆ）の工程にて得られた溶液を、濃縮および／または乾燥させることによって、ブロッコリータンパク質のペプチド混合物を得る工程と、
を有し、
上記プロテアーゼの複合物は、トリプシンおよび中性プロテアーゼの複合物、アルカリプロテアーゼおよびパパインの複合物、または、アルカリプロテアーゼおよび中性プロテアーゼの複合物からなる群より選択されるものである、ブロッコリータンパク質のペプチド混合物を調製する方法。
抗酸化作用を有する、食品、薬、ヘルスケア製品、または、化粧品の調製における、請求項１に記載の方法にて調製されたブロッコリータンパク質のペプチド混合物の使用であって、
上記プロテアーゼの複合物が、トリプシンおよび中性プロテアーゼの複合物である、使用。