CN106309372B - 一种牛骨多肽缓释剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛骨多肽缓释剂及其制备方法，属于海洋生物技术领域。本发明在前期对原料进行复合预处理，然后复合使用两种蛋白酶生产牛骨多肽，制成牛骨多肽产品。所得到的水解液的水解度为52％左右，对羟自由基清除率为37％左右，凝胶色谱测得水解液中多肽的分子量在5kD以内的占80％以上；另外，所得牛骨水解液的抗氧化性能和抗细胞增殖能力都很好，细胞增殖抑制指数IR为70％左右，对羟自由基清除率为38％左右，可见本发明方法极大地保留了牛骨的活性成分。通过在多肽提取液中添加β‑环糊精以及壳聚糖，对多肽活性物质形成保护屏障，延长释放时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛骨多肽缓释剂及其制备方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术
我国每年的肉类总产量可达5000多吨，然而，除排骨和腔骨可直接用于饮食而被大量需求外，其他骨头的利用率均不高。尤其对骨蛋白这一优质营养源的利用很落后，并且对骨中的蛋白及其它营养成分没有充分开发利用。目前，由于动物骨头价格低廉，不易储存，所以往往被加工成附加值比较低的产品或被制成饲料，导致骨的利用率大大降低。这样不仅会造成极大的浪费，还会因骨头极易腐败变质而导致一定的环境污染。
骨综合利用的形式主要有两种，一种是全骨利用，也就是整个骨头的利用，该方法能够比较全面的利用骨中的营养成分，其主要产品是骨粉、骨泥等，可以作为食品添加剂或者是肉类食品的替代物；另一种是骨提取物的利用，该方法是提取骨中的各类营养物质并加以利用，其主要产品是骨油、骨胶、骨素等。
在牛骨蛋白质的长链中，存在着比蛋白质和氨基酸抗氧化性更强的抗氧化肽。蛋白酶的水解产物中存在多种抗氧化肽，它们具有较强抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的功效。抗氧化肽以其分子量小、易吸收、活性强等特点受到重视，并在医药、化妆品、保健品和食品及饲料添加剂等方面具有广阔的前景。
此外，多肽的分子结构很不稳定，在口服使用过程中，容易被肠道中的蛋白酶分解失去活性。
发明内容
本发明首先提供了一种制备牛骨多肽缓释剂的方法。
所述方法主要包括以下步骤：
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的盐酸溶液中浸泡5～6h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：(1～3)L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6～8h得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：(2～4)L；
(3)按质量比1％加入酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；调整pH至中性，按质量比1％加入中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理1～2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加质量终浓度为0.5％的β-环糊精、质量终浓度为0.1％的壳聚糖以质量终浓度为0.005％氯化钙，搅拌均匀后，在室温下静置3～6h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物喷雾干燥得到牛骨多肽粉或者通过流化床造粒机制成颗粒。
在本发明的一种实施方式中，所述中性蛋白酶是20万U/g的酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述酸性蛋白酶是20万U/g的酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，还包括包装、检验的步骤。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)所得提取液还采用分子截留量为10kDa的超滤膜进行过滤。
本发明在前期对原料进行复合预处理，然后复合使用两种蛋白酶生产牛骨多肽，制成牛骨多肽产品。所得到的水解液的水解度为52％左右，对羟自由基清除率为37％左右，凝胶色谱测定步骤(5)水解液中多肽的分子量在5kD以内的占80％以上；另外，所得牛骨水解液的抗氧化性能和抗细胞增殖能力都很好，细胞增殖抑制指数IR为70％左右，对羟自由基清除率为38％左右，可见本发明方法极大地保留了牛骨的活性成分。通过在多肽提取液中添加β-环糊精以及壳聚糖，对多肽活性物质形成保护屏障，延长释放时间。
具体实施方式
甲醛滴定法测定氨基酸含量(ANN)：取步骤(5)得到的20ml样品置于烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准液滴定至pH为8.2。加入10mL甲醛溶液混匀，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液继续滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准的毫升数，同时取水80mL做试剂空白试验。按X＝(V1-V2)×C×0.014×100/(5×V)计算氨基氮(ANN)含量，氨基氮含量与水解度成正相关，其中，X为样品中氨基氮的含量(g/100mL)；V1为测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准(mL)；V2为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；V为样品液取用量(mL)；C为氢氧化钠标准液的浓度(mol/L)；0.014为氮的毫摩尔质量(g/mmoL)。
抗细胞增殖能力的测定：采用MTT法进行检测；配制pH值为7.2的PBS溶液和浓度为200μg/ml的步骤(5)得到的水解液；取对数生长期的前列腺癌细胞DU-145制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5％CO2，37℃贴壁4h，然后加入步骤(5)得到的水解液，设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5％CO2，37℃培养箱中孵育48h，培养结束加入180μLMTT和20μLPBS继续培养4h，吸取96孔板的液体，加入150μL的DMSO，充分混合，置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度，按IR＝[(对照组A值—药物组A值)/对照组A值]×100％计算细胞增殖抑制指数IR。
清除羟自由基能力的测定：取0.75mmol/L邻二氮菲1mL装于试管中，依次加入PBS(0.02mol/LpH 7.4)2mL，蒸馏水1mL，完全混匀后，加入0.75mmol/L的硫酸亚铁1mL，质量分数为0.12％的过氧化氢1mL，于37℃水浴反应90min，于536nm处测其吸光度，为Ap；用1mL蒸馏水代替1mL过氧化氢，为Ab；用样品取代1mL蒸馏水，为As。羟自由基清除率按样品对羟自由基清除率＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％计算。
人工肠液的配制：准确称量磷酸二氢钾6.8g，加入蒸馏水定容至500mL，然后用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，称取胰蛋白酶10g，加入适量蒸馏水溶解，将pH值为6.8的磷酸二氢钾溶液与胰蛋白酶溶液混合均匀，加蒸馏水定容至1000mL，即制成pH值为6.8的人工肠液。
实施例1
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的盐酸溶液中浸泡5h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在50℃条件下酶解2h；调整pH至中性，按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在45℃条件下酶解处理2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加质量终浓度为0.5％的β-环糊精、质量终浓度为0.1％的壳聚糖以质量终浓度为0.005％氯化钙，搅拌均匀后，在室温下静置4h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物通过流化床造粒机制成颗粒。
测得步骤(5)水解液水解度为52％，对羟自由基清除率为37％，细胞增殖抑制指数IR为71％，对羟自由基清除率为38％。向100mL人工肠液中，添加5g步骤(8)得到的颗粒，通过测定人工肠液中氨基氮的含量占氨基氮总量的百分比来反应缓释效果，结果显示：前2h累积释放率65.60％，2h后呈现缓慢释放，4h累积释放率达到96％，具有较好的缓释性能。
实施例2
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的盐酸溶液中浸泡5h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；调整pH至中性，按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理1h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加质量终浓度为0.5％的β-环糊精、质量终浓度为0.1％的壳聚糖以质量终浓度为0.005％氯化钙，搅拌均匀后，在室温下静置5h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物喷雾干燥得到牛骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为54％，对羟自由基清除率为39％，细胞增殖抑制指数IR为70％，对羟自由基清除率为38.5％。向100mL人工肠液中，添加5g步骤(8)得到的牛骨多肽粉，通过测定人工肠液中氨基氮的含量占氨基氮总量的百分比来反应缓释效果，结果显示：前2h累积释放率68.60％，2h后呈现缓慢释放，4h累积释放率达到98％，具有较好的缓释性能。
实施例3
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的盐酸溶液中浸泡5h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加质量终浓度为0.5％的β-环糊精、质量终浓度为0.1％的壳聚糖以质量终浓度为0.005％氯化钙，搅拌均匀后，在室温下静置3～6h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物喷雾干燥得到牛骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为43％，对羟自由基清除率为31％，细胞增殖抑制指数IR为36％，对羟自由基清除率为31％。
实施例4
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的盐酸溶液中浸泡5h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；调整pH至中性，按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理1h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加终浓度为0.5％的β-环糊精，搅拌均匀后，在室温下静置3～6h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物喷雾干燥得到牛骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为54％，对羟自由基清除率为39％，细胞增殖抑制指数IR为70％，对羟自由基清除率为38.5％。向100mL人工肠液中，添加5g步骤(8)得到的牛骨多肽粉，通过测定人工肠液中氨基氮的含量占氨基氮总量的百分比来反应缓释效果，结果显示：前2h累积释放率77.20％，2h后呈现缓慢释放，3h累积释放率达到99％。
实施例5
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的盐酸溶液中浸泡5h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；调整pH至中性，按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理1h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加终浓度为0.1％的壳聚糖，搅拌均匀后，在室温下静置3～6h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物喷雾干燥得到牛骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为54％，对羟自由基清除率为39％，细胞增殖抑制指数IR为70％，对羟自由基清除率为38.5％。向100mL人工肠液中，添加5g步骤(8)得到的牛骨多肽粉，通过测定人工肠液中氨基氮的含量占氨基氮总量的百分比来反应缓释效果，结果显示：前2h累积释放率88.60％，2h后呈现缓慢释放，2.5h累积释放率达到98％。
实施例6
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的盐酸溶液中浸泡5h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入水浸泡6h，得到酶解底物；牛骨与水的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；调整pH至中性，按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在45℃条件下酶解处理2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加质量终浓度为0.5％的β-环糊精、质量终浓度为0.1％的壳聚糖以质量终浓度为0.005％氯化钙，搅拌均匀后，在室温下静置4h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物通过流化床造粒机制成颗粒。
测得步骤(5)水解液水解度为26％，对羟自由基清除率为29％，细胞增殖抑制指数IR为33％，对羟自由基清除率为31％。向100mL人工肠液中，添加5g步骤(8)得到的多颗粒，通过测定人工肠液中氨基氮的含量占氨基氮总量的百分比来反应缓释效果，结果显示：前2h累积释放率58％，2h后呈现缓慢释放，4h累积释放率达到95％，具有较好的缓释性能。
实施例7
(1)将新鲜牛骨剔净轧成1cm3左右的块状，用50℃的热水冲洗去油脂；
(2)沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；调整pH至中性，按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在45℃条件下酶解处理2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)包埋：向步骤(6)所得提取液中添加质量终浓度为0.5％的β-环糊精、质量终浓度为0.1％的壳聚糖以质量终浓度为0.005％氯化钙，搅拌均匀后，在室温下静置4h；
(8)干燥：将步骤(7)所得混合物通过流化床造粒机制成颗粒。
测得步骤(5)水解液水解度为28，对羟自由基清除率为25％，细胞增殖抑制指数IR为29％，对羟自由基清除率为31％。向100mL人工肠液中，添加5g步骤(8)得到的多颗粒，通过测定人工肠液中氨基氮的含量占氨基氮总量的百分比来反应缓释效果，结果显示：前2h累积释放率58％，2h后呈现缓慢释放，4h累积释放率达到95％，具有较好的缓释性能。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种制备牛骨多肽缓释剂的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
（1）将新鲜牛骨剔净轧成1cm3的块状，用50℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1%的盐酸溶液中浸泡5~6h；牛骨与盐酸溶液的用量比例为1kg：（1~3）L；
（2）捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2%的维生素C水溶液中，浸泡6~8 h得到酶解底物；牛骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：（2~4）L；
（3）按质量比1%加入酸性蛋白酶在45~50℃条件下酶解2~3 h；调整pH至中性，按质量比1%加入中性蛋白酶在42~45℃条件下酶解处理1~2 h，其中，所述中性蛋白酶是20万U/g的酶制剂，所述酸性蛋白酶是20万U/g的酶制剂；
（4）灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
（5）过滤：加入珍珠岩、硅藻土作为助滤剂，板框过滤得到水解液；
（6）浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
（7）包埋：向步骤（6）所得提取液中添加质量终浓度为0.5%的β-环糊精、质量终浓度为0.1%的壳聚糖以质量终浓度为0.005%氯化钙，搅拌均匀后，在室温下静置3~6h；
（8）干燥：将步骤（7）所得混合物喷雾干燥得到牛骨多肽粉或者通过流化床造粒机制成颗粒，其中，步骤（6）所得提取液还采用分子截留量为10kDa的超滤膜进行过滤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括包装、检验的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（7）搅拌均匀后在室温下静置4h。
4.根据权利要求1~3任一所述方法制备得到的牛骨多肽缓释剂。
5.一种具有抗氧化功效的保健品，其特征在于，含有权利要求4所述的牛骨多肽缓释剂。
6.一种具有抗癌细胞增殖功效的药物，其特征在于，含有权利要求4所述的牛骨多肽缓释剂，其中，所述癌细胞为前列腺癌细胞DU-145。
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