CN106148467B - 一种贻贝活性肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贻贝活性肽的制备方法，属于海洋生物技术领域。本发明在前期对原料进行复合预处理，然后复合使用两种蛋白酶生产贻贝多肽，制成贻贝多肽产品。所得到的产品中氨基氮含量为15g/100mL左右，便于人体吸收，大大提高了原料的吸收利用率；另外，所得贻贝多肽水解液的抗氧化性能和抗细胞增殖能力都很好，细胞增殖抑制指数IR为70％左右，对羟自由基清除率为38％左右，可见本发明方法极大化地保留了贻贝的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种贻贝活性肽的制备方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术
贻贝是一种高蛋白、低脂肪的食物。据分析，每100g干贻贝肉含粗蛋白高达52g，碳水化合物13g，脂肪7g。此外，还含有多种维生素及人体必需的钙、磷、铁、锰、锌、硒、碘等多种微量元素。具有抗疲劳、降血压、抗炎、增强免疫力等功效，被誉为“海中鸡蛋”。
贻贝国内养殖产量巨大，新鲜贻贝肉水分含量高，不易保存。故常制成“淡菜”保存，即将贻贝煮熟、去壳后晒干，这种方法比较原始，而且在晾晒过程中贻贝肉易发生质变，一般做普通食品被消费者食用。
将新鲜贻贝去壳洗净后经过冷冻干燥、粉碎制成贻贝冻干粉也是目前贻贝后加工的一个方向。因其使用的唯一原料是新鲜贻贝肉，在产品生产过程中未添加其他物质，保存了原有物质和抗炎成分，是一种比较优质的产品，但是冷冻干燥对设备投入要求高，且干燥成本较高，不适于大规模生产。另外，贻贝冻干粉为不溶解状态，难以制成冲剂等。也就是说上述冷冻干燥实质是一种原料的粗加工，虽然较直接晾晒干燥质量可控，但是并不能有效改变服用时营养成分的吸收效果，实质是大大增加了原料的附加成本。
此外，可采用植物萃取的方式进行贻贝成分的提取，制成贻贝提取物。将新鲜贻贝洗净后，采用溶解提取水溶性成分或脂溶性物质，然后辅以淀粉或糊精等包埋吸附制成产品。鉴于动植物活性成分存在的差异，该方法对营养活性成分提取率低，原料利用率较低。
发明内容
本发明提供了一种贻贝活性肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)前处理：选取新鲜贻贝，去除泥沙、壳后洗净沥干，将贻贝肉加入到浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌均匀并浸泡2～3h，捞出清水冲洗2～3遍后沥干，再加入到质量分数为0.2％的维生素C水溶液中搅拌均匀并浸泡20～30min，捞出清水冲洗2～3遍后沥干；贻贝肉与氢氧化钠溶液的质量体积比为1kg：(1～1.5)L，贻贝肉与维生素水溶液的质量体积比为1kg：(1～2)L；
(2)匀浆：每kg贻贝肉加0.5L水后，用胶体磨将贻贝磨浆得到贻贝肉浆液；
(3)酶解：按质量比1％加入中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理1～2h；用质量分数10％的氢氧化钠溶液调节pH至8.5～9，按质量比1％加入碱性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到贻贝多肽粉。
在本发明的一种实施方式中，所述中性蛋白酶是20万U/g的酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述碱性蛋白酶是20万U/g的酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，还包括包装、检验的步骤。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)所得提取液还采用分子截留量为10kDa的超滤膜进行过滤。
本发明在前期对原料进行复合预处理，然后复合使用两种蛋白酶生产贻贝多肽，制成贻贝多肽产品。所得到的产品中氨基氮含量为15g/100mL左右，便于人体吸收，大大提高了原料的吸收利用率；另外，所得贻贝多肽水解液的抗氧化性能和抗细胞增殖能力都很好，细胞增殖抑制指数IR为70％左右，对羟自由基清除率为38％左右，可见本发明方法极大化地保留了贻贝的活性成分。本发明制得的产品为全水溶性，可制成冲剂等直接服用。在生产过程中添加全为食品级试剂，安全、可靠。产品质量便于把控，有利于大规模工业化生产。
具体实施方式
甲醛滴定法测定氨基酸含量(ANN)：取步骤(5)得到的20ml水解液置于烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准液滴定至pH为8.2。加入10mL甲醛溶液混匀，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液继续滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准的毫升数，同时取水80mL做试剂空白试验。按X＝(V1-V2)×C×0.014×100/(5×V)计算氨基氮(ANN)含量，氨基氮含量与水解度成正相关，其中，X为样品中氨基氮的含量(g/100mL)；V1为测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准(mL)；V2为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；V为样品液取用量(mL)；C为氢氧化钠标准液的浓度(mol/L)；0.014为氮的毫摩尔质量(g/mmoL)。
抗细胞增殖能力的测定：采用MTT法进行检测；配制pH值为7.2的PBS溶液和浓度为200μg/ml的步骤(5)得到的水解液；取对数生长期的前列腺癌细胞DU-145制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5％CO2，37℃贴壁4h，然后加入步骤(5)得到的水解液，设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5％CO2，37℃培养箱中孵育48h，培养结束加入180μLMTT和20μLPBS继续培养4h，吸取96孔板的液体，加入150μL的DMSO，充分混合，置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度，按IR＝[(对照组A值—药物组A值)/对照组A值]×100％计算细胞增殖抑制指数IR。
清除羟自由基能力的测定：取0.75mmol/L邻二氮菲1mL装于试管中，依次加入PBS(0.02mol/LpH 7.4)2mL，蒸馏水1mL，完全混匀后，加入0.75mmol/L的硫酸亚铁1mL，质量分数为0.12％的过氧化氢1mL，于37℃水浴反应90min，于536nm处测其吸光度，为Ap；用1mL蒸馏水代替1mL过氧化氢，为Ab；用样品取代1mL蒸馏水，为As。羟自由基清除率按样品对羟自由基清除率＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％计算。
实施例1
(1)前处理：选取新鲜贻贝，去除泥沙、壳后洗净沥干，将贻贝肉加入到浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌均匀并浸泡2h，捞出清水冲洗3遍后沥干，再加入到质量分数为0.2％的维生素C水溶液中搅拌均匀并浸泡30min，捞出清水冲洗3遍后沥干；贻贝肉与氢氧化钠溶液的质量体积比为1kg：1L，贻贝肉与维生素水溶液的质量体积比为1kg：2L；
(2)匀浆：每kg贻贝肉加0.5L水后，用胶体磨将贻贝磨浆得到贻贝肉浆液；
(3)酶解：按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理2h；用质量分数10％的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，按质量比1％加入20万U/g的碱性蛋白酶在48℃条件下酶解2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到贻贝多肽粉。
测得步骤(5)水解液中氨基氮的含量为15.52g/100mL，细胞增殖抑制指数IR为71％，对羟自由基清除率为38％。
实施例2
(1)前处理：选取新鲜贻贝，去除泥沙、壳后洗净沥干，将贻贝肉加入到浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌均匀并浸泡3h，捞出清水冲洗3遍后沥干，再加入到质量分数为0.2％的维生素C水溶液中搅拌均匀并浸泡20min，捞出清水冲洗3遍后沥干；贻贝肉与氢氧化钠溶液的质量体积比为1kg：1L，贻贝肉与维生素水溶液的质量体积比为1kg：1.5L；
(2)匀浆：每kg贻贝肉加0.5L水后，用胶体磨将贻贝磨浆得到贻贝肉浆液；
(3)酶解：按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在42℃条件下酶解处理2h；用质量分数10％的氢氧化钠溶液调节pH至9，按质量比1％加入20万U/g的碱性蛋白酶在45℃条件下酶解2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到贻贝多肽粉。
测得步骤(5)水解液中氨基氮的含量为14.88g/100mL，细胞增殖抑制指数IR为70％，对羟自由基清除率为38.5％。
实施例3
(1)前处理：选取新鲜贻贝，去除泥沙、壳后洗净沥干；
(2)匀浆：每kg贻贝肉加0.5L水后，用胶体磨将贻贝磨浆得到贻贝肉浆液；
(3)酶解：按质量比1％加入中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理1～2h；用质量分数10％的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，按质量比1％加入碱性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到贻贝多肽粉。
测得步骤(5)水解液中氨基氮的含量为7.61g/100mL，细胞增殖抑制指数IR为36％，对羟自由基清除率为31％。
实施例4
(1)前处理：选取新鲜贻贝，去除泥沙、壳后洗净沥干，将贻贝肉加入到浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌均匀并浸泡2～3h，捞出清水冲洗2～3遍后沥干，再加入到质量分数为0.2％的维生素C水溶液中搅拌均匀并浸泡20～30min，捞出清水冲洗2～3遍后沥干；贻贝肉与氢氧化钠溶液的质量体积比为1kg：(1～1.5)L，贻贝肉与与维生素水溶液的质量体积比为1kg：(1～2)L；
(2)匀浆：每kg贻贝肉加0.5L水后，用胶体磨将贻贝磨浆得到贻贝肉浆液；
(3)酶解：用质量分数10％的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，按质量比1％加入碱性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到贻贝多肽粉。
测得步骤(5)水解液中氨基氮的含量为8.53g/100mL，细胞增殖抑制指数IR为47％，对羟自由基清除率为27％。
实施例5
(1)前处理：选取新鲜贻贝，去除泥沙、壳后洗净沥干，将贻贝肉加入到浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌均匀并浸泡3h，捞出清水冲洗3遍后沥干，再加入到质量分数为0.2％的维生素C水溶液中搅拌均匀并浸泡20min，捞出清水冲洗3遍后沥干；贻贝肉与氢氧化钠溶液的质量体积比为1kg：1L，贻贝肉与与维生素水溶液的质量体积比为1kg：1.5L；
(2)匀浆：每kg贻贝肉加0.5L水后，用胶体磨将贻贝磨浆得到贻贝肉浆液；
(3)酶解：按质量比1％加入20万U/g的中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到贻贝多肽粉。
测得步骤(5)水解液中氨基氮的含量为10.39g/100mL，细胞增殖抑制指数IR为42％，对羟自由基清除率为31％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种贻贝活性肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)前处理：选取新鲜贻贝，去除泥沙、壳后洗净沥干，将贻贝肉加入到浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液中搅拌均匀并浸泡2～3h，捞出清水冲洗2～3遍后沥干，再加入到质量分数为0.2％的维生素C水溶液中搅拌均匀并浸泡20～30min，捞出清水冲洗2～3遍后沥干；贻贝肉与氢氧化钠溶液的质量体积比为1kg：(1～1.5)L，贻贝肉与维生素水溶液的质量体积比为1kg：(1～2)L；
(2)匀浆：每kg贻贝肉加0.5L水后，用胶体磨将贻贝磨浆得到贻贝肉浆液；
(3)酶解：按质量比1％加入中性蛋白酶在42～45℃条件下酶解处理1～2h；用质量分数10％的氢氧化钠溶液调节pH至8.5～9，按质量比1％加入碱性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到贻贝多肽粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶是20万U/g的酶制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶是20万U/g的酶制剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括包装、检验的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所得提取液还采用分子截留量为10kDa的超滤膜进行过滤。
6.根据权利要求1～5任一所述方法制备得到的贻贝活性肽。
7.一种具有抗氧化功效的保健品，其特征在于，含有权利要求6所述的贻贝活性肽。
8.一种具有抗癌细胞增殖功效的药物，其特征在于，含有权利要求6所述的贻贝活性肽。
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