CN101991840A

CN101991840A - 抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法及应用

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Publication number: CN101991840A
Application number: CN2010102961306A
Authority: CN
Inventors: 丁国芳; 杨永芳; 杨最素; 郁迪; 黄芳芳
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2030-09-26
Also published as: CN101991840B

Abstract

一种抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法，包括如下步骤①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并匀浆，料液比1∶2～1∶3，调节pH值至9.5～10，保温25～30℃，20～30min；②加入Alcalase，加酶量为1500～2000u/g，酶解温度为45～50℃，酶解时间6～8h，灭活，离心，取上清液，得酶解产物。本发明还公开了酶解提取物在抗前列腺癌上的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于：通过对酶的筛选，料液比、酸碱度、加酶量、温度及酶解时间的控制，得出了一个较佳的工艺，并产物对前列腺癌细胞具有良好的增殖抑制作用。

Description

抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种贻贝酶解提取物的制备方法，该提取物能用于抗前列腺癌。

背景技术

多肽在生物体内可作为神经递质、白细胞介素和细胞生长因子等活性物质，具有维持生物体生长发育、免疫调节和新陈代谢等活性功能。现有研究表明，来源于生物体的多肽具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗高血压等活性功能，尤其是抗肿瘤活性已受到各国研究人员的关注。目前，有关天然肽和合成肽的抗肿瘤活性已有大量报道，并有部分多肽作为抗肿瘤药物已应用于临床；食物蛋白来源的多肽对于其抗菌、抗氧化、抗高血压活性研究颇多，而对其抗肿瘤活性的相关报道较少。

海洋生物蛋白种类繁多，来源广泛，作为活性肽的一个重要来源，已受到越来越多的关注。贻贝作为海洋生物的一个重要组成部分，隶属于海洋软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia)贻贝目(Mytiloida)，在我国北方称海红，江浙称为淡菜，富产于浙江嵊泗周围海域。贻贝富含粗蛋白、脂肪和碳水化合物，此外还含有钙、磷、铁、维生素等多种微量元素。已有研究表明，贻贝提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝、降血压、降血脂、提高免疫力等活性功能，可参考专利号为ZL200510110096.8的中国发明专利《厚壳贻贝的提取物、制造方法及其用途》(授权公告号：CN100467030C)，该专利公开了厚壳贻贝的提取物在流感上的应用。类似的还可以参考专利号为ZL200510024391.1的中国发明专利《一种可提高免疫力功能的厚壳贻贝提取物》(授权公告号为CN100486593C)；申请号为200910101136.0的中国发明专利申请公开《厚壳贻贝脂溶性提取物及其制备方法和用途》(公开号：CN101606951A)。但至今未见有关贻贝酶解产物对前列腺癌细胞作用的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种贻贝酶解提取物在抗前列腺癌上的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤

①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并匀浆，料液比1∶3～1∶4，调节pH值至9.5～10，保温25～30℃；

②加入Alcalase(碱性蛋白酶)，加酶量为1500～2000u/g，酶解温度为45～50℃，酶解时间6-8h，灭活，离心，取上清液，得酶解产物。

作为优选，所述的Alcalase酶活力为19395～19405u/g，采用的缓冲液为pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液。

所述的贻贝可以是紫贻贝、厚壳贻贝或翡翠贻贝。

作为优选，所述的包括如下步骤

①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并匀浆，料液比1∶4，调节pH值至10，保温30℃，30min；

②加入Alcalase，加酶量为2000u/g，酶解温度为50℃，酶解时间8h，灭活，离心，取上清液。

作为优选，所述的酶解产物的氨基氮为8.3337～8.3347mg/g。

作为优选，所述的酶解产物的对前列腺癌细胞DU-145的细胞增殖抑制指数为55.36％～55.38％。

酶解产物在抗前列腺癌上的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：通过对酶的筛选，料液比、酸碱度、加酶量、温度及酶解时间的控制，得出了一个最佳的工艺，并产物对前列腺癌细胞具有良好的增殖抑制作用。

附图说明

图1为酪氨酸标准曲线图。

图2为各酶水解产物对应的ANN含量。

图3为各酶水解产物对应的IR含量。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1蛋白酶活力测定方法

酪氨酸标准曲线的绘制：精确称取烘干至恒重的酪氨酸0.10009，逐步加入6ml1M的HCl溶解，用0.2M的HCl定容至100ml，其浓度为1000μg/ml，再吸取此液10ml，以0.2M的HCI定容至100ml，即配成100μg/ml的酪氨酸溶液。将此酪氨酸溶液稀释成0-100μg/ml的不同浓度，取6支试管编号，分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4MNa₂CO₃5ml，再分别加入已稀释的福林试剂1ml。摇匀置于水浴锅中40℃保温发色20min，用分光光度计在680nm处比色测定光密度D0值。以净D0值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制成标准曲线如图1所示。

酶活力测定：取一定质量或体积的酶，用该酶最适pH的缓冲液溶解，定容。并且根据估计酶活力，将酶液稀释到适当浓度。取3支试管做平行，分别加入酶液1ml，置于40℃水浴中预热2min，再分别加入同样预热的2％酪蛋白1ml，精确保温10min，然后立即再分别加入0.4MTCA2ml，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心，取滤液1ml，加入0.4MNa₂CO₃5ml，加入已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20min，用分光光度计680nm比色测定D0值，由酪氨酸标准曲线计算相当的酪氨酸浓度，取平均值。同时取3支试管做空白，空白试验测定方法同上，只是在加酪蛋白之前先加0.4MTCA2ml，使酶失活，再加入酪蛋白

酶活力计算：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为1个蛋白酶活力单位。

活力单位＝(A×4×N)/(10×M)

式中：A__由样品的OD值查标准曲线得到的相当的酪氨酸浓度，μg/ml

4__4ml过滤液中取出1ml测定(即4倍)

N__酶液的稀释倍数

10__反应时间为10min

M__酶制剂的量，g/ml

1.1.2结果与分析

几种蛋白酶酶活力测定结果：

2最佳蛋白酶种及水解条件的选择

2.1材料和方法

2.1.1材料

贻贝，购自浙江舟山南珍市场，经鉴定为紫贻贝(Mytilus edulis)

2.1.2方法

2.1.2.1正交实验

选用Alcalase、Trypsin和Pepsin三种蛋白酶，考虑到A(料液比)、B(PH)、C(加酶量)、D(温度)和E(时间)五个因素，每个因素选四个水平进行五因素四水平的正交实验，比较三种酶在不同水解条件下的水解度和抗肿瘤活性，从而确定最佳酶种及其水解条件。水解工艺依次如下：

贻贝洗净；去壳取肉；匀浆；0.5mol/LNaOH溶液调pH值；保温；加酶水解；灭酶(90℃，加热15min)；离心(5000r/min，20min)；取上清液定容；然后一部分用于氨基氮含量(AAN)测定，另一部分冷冻干燥后用于抗肿瘤活性测定。

2.1.2.2甲醛滴定法测定AAN

取20ml酶解溶液置于烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准液滴定至pH为8.2。加入10mL甲醛溶液混匀，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液继续滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准的毫升数，同时取水80mL做试剂空白试验。按下列公式计算氨基氮(ANN)含量，氨基氮含量与水解度成正相关。

X＝(V₁-V₂)×C×0.014×100/(5×V)

式中，X为样品中氨基氮的含量(g/100mL)；V₁为测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液(mL)；V₂为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；V为样品液取用量(mL)；C为氢氧化钠标准液的浓度(mol/L)；0.014为氮的毫摩尔质量(g/mmoL)。

2.1.2.3MTT法测定抗肿瘤活性

采用MTT法进行检测。配制PBS溶液(pH值为7.2)和浓度均为200μg/ml的不同的酶解物溶液。取对数生长期的前列腺癌细胞DU-145制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5％CO₂，37℃贴壁4h，然后分别加入各酶解物溶液，每个浓度设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5％CO₂，37℃培养箱中孵育48h，培养结束加入180μLMTT和20μL PBS继续培养4h，吸弃96孔板的液体，加入150μL的DMSO，充分混合。置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度，计算细胞增殖抑制指数(IR)，按下列公式计算。

IR＝[(对照组A值-药物组A值)/对照组A值]×100％

2.2：结果与分析

2.2.1Alcalase正交实验

采用极差分析方法，从Rj值的大小可以看出，影响ANN生成量的各因素的主次关系为：C(加酶量)＞B(pH值)＞D(温度)＞E(时间)＞A(料液比)。而各因素对IR值影响的主次关系为：D(温度)＞A(料液比)＞C(加酶量)＞E(时间)＞B(pH值)。对ANN生成量影响最大的为因素A，对IR值影响最大的为D，因此，综合平衡分析各因素对各指标的影响，从而确定各因素水平的较优组合为：A₃B₄C₄D₄E₄。

2.2.2Trypsin正交实验

采用极差分析方法，从Rj值的大小可以看出，影响ANN生成量的各因素的主次关系为：B(pH值)＞E(时间)＞C(加酶量)＞D(温度)＞A(料液比)。而各因素对IR 值影响的主次关系为：D(温度)＞C(加酶量)＞B(pH值)＞A(料液比)＞E(时间)。对ANN生成量影响最大的为因素A，对IR值影响最大的为D，因此，综合平衡分析各因素对各指标的影响，从而确定各因素水平的较优组合为：A₃B₄C₃D₂E₄

2.2.3Pepsin正交实验结果

采用极差分析方法，从Rj值的大小可以看出，影响ANN生成量的各因素的主次关系为：D(温度)＞B(pH值)＞C(加酶量)＞A(料液比)＞E(时间)。而各因素对IR值影响的主次关系为：D(温度)＞B(pH值)＞A(料液比)＞E(时间)＞C(加酶量)。对ANN生成量IR值影响最大的均为因素A，其次为因素B，综合平衡分析各因素对各指标的影响，从而确定各因素水平的较优组合为：A3B3C3D2E4

从以上结果可以看出，当以ANN生成量为指标时，Alcalase、Trypsin和Pepsin三种蛋白酶水解贻贝影响最大的因素分别为C(加酶量)、B(pH值)和D(温度)；而当以IR为指标时，影响最大的因素均为D。因此，当以以上三种蛋白酶水解贻贝获取具有抗肿瘤活性的水解物时，应严格控制温度的变化。

2.2.4最佳蛋白酶筛选

如图2和图3所示，通过以上正交实验得出的三种蛋白酶最佳水解条件，分别对贻贝进行水解，测量各个ANN生成量和IR值

由上图可以看出，三种蛋白酶水解物的ANN生成量的大小关系：Trypsin＞Pepsin＞Alcalase；三种蛋白酶水解物对DU-145细胞IR的大小关系为：Alcalase＞Trypsin＞Pepsin，其中，Trypsin对贻贝水解度最大，而Alcalase对贻贝的水解物抗肿瘤活性最强。以此可以推测，蛋白酶对贻贝水解的水解度与其水解物的抗肿瘤活性没有正反相关系，可能只与水解物的组成及其结构有关。

2.3小结

通过正交实验，采用综合平衡分析的方法得出三种蛋白酶水解贻贝的最佳水解条件是：Alcalase∶料液比1∶4；pH 10.0；加酶量2000u/g肉；温度50℃；时间8h；Trypsin∶料液比1∶4；pH 8.5；加酶量1500u/g肉；温度40℃；时间8；Pepsin∶料液比1∶4；pH5.0；加酶量1500u/g肉；温度50℃；时间8；

三种蛋白酶在其最佳水解条件下对贻贝进行水解，以Trypsin对贻贝水解度最大，Alcalase水解物抗肿瘤活性最强。由于本实验主要研究目的是获得具有较强抗肿瘤活性的多肽，因此，在接下来研究中选用具有最强抗PCa活性的Alcalase水解物作为进一步分离纯化的底物。

Claims

1.一种抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤

①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并匀浆，料液比1∶3～1∶4，调节pH值至9.5～10，保温25～30℃，20-30min；

②加入Alcalase，加酶量为1500～2000u/g，酶解温度为45～50℃，酶解时间6-8h，灭活，离心，取上清液，得酶解产物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的Alcalase酶活力为19395～19405u/g，采用的缓冲液为pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的贻贝为紫贻贝、厚壳贻贝或翡翠贻贝。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的包括如下步骤

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的酶解产物的氨基氮为8.3337～8.3347mg/g。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的酶解产物的对前列腺癌细胞DU-145的细胞增殖抑制指数为55.36％～55.38％。

7.权利要求1制得的酶解产物在抗前列腺癌上的应用。