CN114369635B - 一种番鸭血浆源ace抑制肽的酶法制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法，采用碱性蛋白酶酶解番鸭血浆制备ACE抑制肽，包括调节番鸭血浆初始pH至10‑11，60‑70℃恒温水浴10min，加入碱性蛋白酶，加酶量为2200‑2500 U/g，60‑70℃水浴进行酶解反应5‑6h，反应结束后调节pH至7，并于95℃水浴10min灭酶，10000‑12000 g、4℃、10min离心，取上清冻干得番鸭血浆源ACE抑制肽，测得ACE抑制率为65.46±1.15%。本发明方法提高了番鸭血经济价值，节约了资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种ACE抑制肽的制备方法，具体涉及一种番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法。
背景技术
我国是肉鸭生产和消费大国，每年肉鸭的生产消费量占全球产销量70%以上。番鸭原产于南美洲，在我国主要分布于长江以南大部分地区，是优良的肉鸭品种，由于其瘦肉率高、肉质鲜美，深受越来越多消费者的喜爱和青睐。鸭血作为鸭肉制品加工产生的主要副产物之一，含有丰富的蛋白质，微量元素含量高，易于消化吸收，同时含有多种生物活性物质，营养组成丰富。但是由于血液蛋白具有强烈的颜色和味道，用于人类直接消费的数量有限，除部分用于做饲料外，其他未经恰当处理便排放到环境中，易造成环境污染。
高血压是常见的慢性病，也是影响心脑血管疾病的危险因素之一。ACE抑制肽是从体外摄取的功能性肽，可作为高血压药物治疗的补充或替代物，有助于预防或治疗心血管疾病，由于其直接或间接来源于食物蛋白，被认为比药物更安全，并且没有一些与药物相关的副作用。酶解法是合成ACE抑制肽最普遍的方法，该方法利用蛋白酶的特异性和高效性将蛋白水解为小分子肽段。该种方法制备的多肽稳定性好、安全性高，且制备效率高，但是蛋白酶的选择及酶解工艺参数（温度、pH、酶解时间等）对产物的影响较大。Food ResearchInternational（2018, 106: 589–597. DOI:10.1016/j.foodres.2018.01.030)公开Guo等使用海藻酸钠固定化的瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）LB 10蛋白酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽，发现在酶解8 h时，ACE抑制率最高达到43.00±1.50%，随着酶解时间增加，ACE抑制率反而下降。Food Chemistry（2017,220: 190–197. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.09.183）公开Fan等使用9种单酶水解淘汰蛋鸡肌肉，结果表明胃蛋白酶酶解产物ACE抑制效果最好（IC50=23±0.9 µg/mL）。此外还有学者从海洋小球藻、大豆、罗非鱼、泥鳅和鸭肉]等中分离出多种具有ACE抑制作用的生物活性肽，但是禽血中鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以提高番鸭血经济价值且节约资源的番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法，其步骤包括：
调节番鸭血浆初始pH至10-11，60-70℃恒温水浴10min，加入碱性蛋白酶，加酶量以番鸭血浆重量计为2200-2500 U/g， 酶解温度60-70℃，酶解反应时间5-6h，酶解反应过程每隔0.5h调节pH至初始，反应结束后调节pH至7，并于95℃水浴10min灭酶，灭酶后10000-12000 g、4℃、10min离心，取上清冻干得番鸭血浆源ACE抑制肽。
作为本发明的一种优选，所述的碱性蛋白酶的单位酶活为200 U/mg。
作为本发明的进一步优选，所述的酶解温度65℃，酶解反应时间5.85 h，加酶量2500 U/g 。
作为本发明的进一步优选，所述的调节番鸭血浆初始pH为10.5。
本发明采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胃蛋白酶酶解番鸭血浆制备ACE抑制肽，确定碱性蛋白酶酶解产物ACE抑制活性最强。进行碱性蛋白酶单因素试验，结果表明酶解时间、酶解温度、pH和加酶量对酶解产物水解度和ACE抑制率都会产生影响。在此基础上，进一步进行Box-Behnken响应面试验对酶解条件进行优化，试验分析结果显示各因素对ACE抑制率的影响顺序为：酶解时间>酶解温度>加酶量>pH，最优酶解条件为酶解时间5.85 h，酶解温度65℃，加酶量2500 U/g，pH 10.5，其理论抑制率为66.97％，在此条件下，测得ACE抑制率为65.46±1.15%。本发明为酶法制备番鸭血浆源ACE抑制肽，提高了番鸭血经济价值，节约了资源。
附图说明
图1是本发明番鸭血浆源ACE抑制肽制备工艺流程。
图2是不同蛋白酶对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度的影响（n=3）。
图3 是蛋白酶种类对番鸭血浆蛋白酶解产物ACE抑制率的影响（n=3）。
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
图4是酶解时间对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响（n=3）
注：不同小写字母表示水解度差异显著，不同大写字母表示ACE抑制率差异显著（P<0.05）。
图5是酶解温度对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响（n=3）。
注：不同小写字母表示水解度差异显著，不同大写字母表示ACE抑制率差异显著（P<0.05）。
图6是 pH对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响（n=3）。
注：不同小写字母表示水解度差异显著，不同大写字母表示ACE抑制率差异显著（P<0.05）。
图7 是加酶量对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响（n=3）
注：不同小写字母表示水解度差异显著，不同大写字母表示ACE抑制率差异显著（P<0.05）。
图8 是.酶解时间与酶解温度交互作用图。
图9 是.酶解时间与pH交互作用图。
图10 是酶解时间与加酶量交互作用图。
图11是.酶解温度与pH交互作用图。
图12 是酶解温度与加酶量交互作用图。
图13 是pH与加酶量交互作用图。
具体实施方式
一、材料与试剂
番鸭血：活体番鸭采自安庆永强农业科技股份有限公司，在屠宰场宰杀接血，4℃条件下运送到实验室，立即在10000 g、4°C下离心10 min后，将上清液和沉淀分装冻存在-20℃，备用。
碱性蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、胃蛋白酶（猪胃粘膜，1∶3000），均购自源叶生物；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Biosharp公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hippuryl-Histidine-Leucine，HHL），血管紧张素转换酶（ACE，来源于兔肺，0.1 UN），均购自美国Sigma公司；甲酸、三乙胺、乙腈均为色谱纯，购自南京晚晴化玻仪器有限公司；硼砂、邻苯二甲醛、十二烷基硫酸钠（SDS）、β-巯基乙醇、硼酸、盐酸、氢氧化钠、氯化钠等其他试剂均为分析纯。
二、仪器与设备
HH系列数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司；FE20台式pH计，瑞士MettleToledo公司；Avanti J-E落地式高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；Alpha2-4LSC plus冷冻干燥机，德国Christ公司；Spark多功能酶标仪，Tecan Austria公司；VM-03RU迷你涡旋混匀器，美国Crystal公司；Acquity H-Class 超高效液相色谱仪，美国Waters公司。
三、指标测定方法如下：
（1）水解度的测定
水解度的测定方法参考Church等（Journal of Dairy Science, 1983, 66(6):1219–1227. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(83)81926-2）的方法并稍加修改。配置OPA反应液（避光）：25 mL 100 mmol/L硼砂，2.5 mL 20%（w/w）SDS，100 µL β-巯基乙醇，40 mg邻苯二甲醛溶于0.5 mL甲醇（避光），去离子水定容至50 mL。取15 µL样品和200 µL OPA反应液混合室温避光2 min，在340 nm处测量吸光值。配置0-1 mg/mL胰酪蛋白胨作为标品。
（2）体外ACE抑制活性测定
多肽液的体外ACE抑制活性的测定参考Cushman和Cheung等[20]的方法并稍加修改。配制0.1 mol/L硼酸盐缓冲液（pH=8.3，含有0.3 mol/L NaCl），用硼酸盐缓冲液分别配制5 mmol/L HHL溶液、0.1 U/mL ACE 和1 mg/mL样品。将200 µL HHL和80 µL样品混合于2mL离心管中，37℃水浴10 min，加入20 µL ACE，在37℃水浴条件下反应1 h，加入150 µL 1mol/L HCl终止反应。反应液过0.22 µm水系滤膜进行HPLC上样分析。用硼酸盐缓冲液代替样品作为空白对照。
高效液相色谱分析的条件：色谱柱：C18 液相色谱柱（φ4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温30℃；进样量：10 µL；检测器：PDA检测器；检测波长：228 nm；流速1 mL/min；洗脱时间：15 min；洗脱程序：85%洗脱液A（超纯水，含0.1%甲酸及三乙胺），15%洗脱液B（乙腈，含0.1%甲酸及三乙胺），等度洗脱。
样品对ACE抑制活性计算公式如下：
式中：Ablank代表空白对照组生成的马尿酸峰面积；Asample代表样品组生成的马尿酸峰面积。
数据分析采用SAS 8.1软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan’smultiple-range test进行多重比较，显著性水平P<0.05表示有显著差异。所有试验重复3次，试验结果表示为平均值±标准差。采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应曲面设计。采用Origin 9.0绘制数据图。
参见图1，本发明番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法，其步骤为：
冷冻番鸭血浆于25℃解冻，用1mol/L HCl 或1mol/L NaOH调节番鸭血浆pH至10-11， 60-70℃恒温水浴10min，加入碱性蛋白酶，加酶量以番鸭血浆重量计为2200-2500 U/g， 酶解温度60-70℃水浴，酶解反应时间5-6h，酶解反应过程每隔0.5h调节pH至初始，反应结束后调节pH至7，并于95℃水浴10min灭酶，灭酶后10000-12000 g、4℃、10min离心，取上清冻干得番鸭血浆源ACE抑制肽。
实施例1 ，蛋白酶的选择
使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定番鸭血浆蛋白浓度。经测定，番鸭血浆蛋白浓度为40.11±1.31 mg/mL，蛋白浓度高，是优质动物蛋白来源，适用于制备功能性肽。
调节pH至最佳，恒温（与酶解温度相同）保持10 min后，分别加入3000 U/g的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，分别在其最适pH和温度下反应1、2、3、4、5、6、7、8 h。各蛋白酶最适反应条件为：碱性蛋白酶65℃，pH=10；木瓜蛋白酶55℃，pH=6.5；胃蛋白酶37℃，pH=2。
参见图2，水解度是衡量蛋白质水解程度的重要参数。碱性蛋白酶酶解产物水解度随着酶解时间的延长快速增加，在4 h时，水解度达到最高30.15±1.56%，酶解4 h后，水解度在波动中降低并保持平稳；在0-1 h内，可能由于酶浓度较高，过量的蛋白酶将已形成的短肽过度水解成游离氨基酸，水解度降低[22]。与碱性蛋白酶相比，胃蛋白酶酶解产物水解度次之，在酶解5 h时，达到最高13.80±1.52%；木瓜蛋白酶酶解产物水解度最低，在酶解7h时，达到最高水平10.15±1.21%
参见图3，选取酶解时间4 h的不同蛋白酶酶解产物，测定其ACE抑制活性。三种蛋白酶酶解产物ACE抑制活性均显著高于对照组（P<0.05），ACE抑制率由高到低依次为碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，且三种蛋白酶间ACE抑制活性差异显著（P<0.05）。碱性蛋白酶酶解产物ACE抑制活性最高为58.63±1.63%（P<0.05）。
综合考虑水解度及ACE抑制率，选取酶解番鸭血浆效果最好的碱性蛋白酶用于后续单因素试验和响应面优化试验。
实施例2， 碱性蛋白酶单因素试验
由实施例1试验结果，选用碱性蛋白酶作为制备番鸭血浆源ACE抑制肽单因素试验最适蛋白酶，考察酶解时间、酶解温度、pH、加酶量对酶解产物水解度及ACE抑制率的影响。通过单因素试验优化，旨在获得酶解条件工艺参数范围，为后续响应面试验做准备。
单因素试验初始条件为：酶解时间5 h、酶解温度65℃、pH=10、加酶量3000 U/g。分别选取酶解时间（1、2、3、4、5、6 h）、酶解温度（55、60、65、70、75℃）、pH（8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）、加酶量（1000、2000、3000、4000、5000 U/g）进行试验，每组试验改变一个因素，其他因素保持初始水平。
2.1、 酶解时间对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响
酶解时间对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响见图4，由图4可见酶解时间对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制活性有显著影响（P<0.05）。从水解度来看，0-4 h内，酶解产物水解度随酶解时间的延长而升高，在4 h达到最高，随后缓慢下降；从酶解产物ACE抑制率来看，在酶解前5 h内，酶解产物ACE抑制率随着酶解时间的延长快速升高，在5 h时显著高于其他酶解时间，达到63.61±3.54%（P<0.05）。由以上结果可知，酶解产物水解度和ACE抑制率变化趋势相似但并不完全一致。酶解产物水解度和ACE抑制率均呈现先升高后降低的趋势，可能是由于酶解初期，底物浓度充足，酶发挥最大活力，随着反应时间的延长，产物增多；酶解后期，产物积累，底物浓度降低，抑制了反应的发生，同时，酶将已生成的短肽分解，水解度和ACE抑制率降低，该结果与Hanafi等的研究结果一致。因此，选择酶解5 h作为番鸭血浆蛋白最佳酶解时间。
2.2、 酶解温度对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响
酶解温度对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响见图5，由图5可见，在温度55-65℃范围内，酶解产物水解度逐渐升高，在65℃达到最高42.56±4.73%，之后随着温度的上升而降低。ACE抑制率随着温度的升高先上升后降低，在60℃时，达到最高65.27±4.73%。这是可能是由于温度会影响酶的活性，温度过低，反应体系内分子运动缓慢，蛋白酶与底物接触率降低，反应速率下降；温度过高，蛋白酶活性会降低甚至失活。综合考虑水解度和ACE抑制率两因素，选取65℃作为最适酶解温度。
2.3、 pH对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响
由图6可见在pH 8-12范围内，水解度和ACE抑制率都呈现先升高后降低的趋势，水解度在pH 9时达到最高，ACE抑制率在pH 10时达到最高63.61±3.54%。这是由于在低pH和高pH时，酶活力都会降低，从而会对酶促反应产生影响。因此，选取pH 10作为最佳pH。
2.4、加酶量对番鸭血浆蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率的影响
由图7可见，不同加酶量对水解度和ACE抑制率有显著影响（P<0.05）。在加酶量为1000-5000 U/g范围内，水解度随着加酶量的增加而升高。ACE抑制率在该范围内，先升高后下降，在加酶量4000 U/g时，达到最高为66.38±4.35%。这可能是因为底物充足，随着加酶量的增加，酶解得到的水解度增加；但是酶解产生的ACE抑制肽可能会被过量的酶水解成氨基酸，使ACE抑制率降低。因此，选取加酶量为4000 U/g作为最适加酶量。
实施例3 ，响应面优化试验
在单因素试验基础上，以ACE抑制率（Y）作为唯一的响应值，选取酶解时间（X1）、酶解温度（X2）、pH（X3）、加酶量（X4）四个因素，进行Box-Behnken响应面优化试验设计（表1），并建立合适的回归模型方程，最终确定酶解番鸭血浆蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺参数。
表1 响应曲面法因素水平表
根据单因素试验结果，以ACE抑制率（Y）为唯一响应值，选取酶解时间（X1）、酶解温度（X2）、pH（X3）和加酶量（X4）四个因素作为自变量，分别选取-1、0、1三个水平，采用响应面（RSM）法进行四因素三水平试验设计，优化番鸭血浆蛋白的酶解工艺条件（表2）。
响应面试验共包括29个试验点，其中5个零点试验以估计误差。采用DesignExpert 8.0.6软件对响应面试验结果进行回归拟合分析，得到ACE抑制率（Y）对酶解时间（X1）、酶解温度（X2）、pH（X3）和加酶量（X4）二次多项回归模拟方程：
Y=65.78+2.15X 1-1.61X 2+0.15X 3-0.78X 4+1.96X 1 X 2+5.69X 1 X 3-5.34X 1 X 4-0.66X 2 X 3-0.53X 2 X 4+1.10X 3 X 4-4.93X 1 2-1.18X 2 2-3.99X 3 2-4.04X 4 2
表2 响应面设计与试验结果
由方差分析表（表3）可知，该回归模型F值为46.53，P<0.0001，该模型极显著；失拟项P=0.1405>0.05，不显著，表明该模型误差不显著，模型可靠。决定系数R2=0.9790，表明该模型拟合度高；校正拟合度 R2Adj=0.9579，说明该模型能解释95.79%响应值的变化；变异系数CV=1.64%，表明试验重复性好。综上所述，该模型可以用于番鸭血浆蛋白的酶解条件优化的理论预测。
回归模拟方程中各项系数绝对值的大小，表明各单因素对响应值的影响程度，因此，各因素对响应值的贡献率由大到小依次为X1、X2、X4、X3，即酶解时间、酶解温度、加酶量、pH，其中酶解时间和加酶量对ACE抑制率有极显著影响（P<0.01），pH影响不显著（P>0.05）。交互项X1X2、X1X3和X1X4和X3X4对Y有显著影响，其中X1X2、X1X3和X1X4对Y有极显著影响，二次项均对Y均有显著影响。说明各酶解因素之间存在交互作用，且与ACE抑制率之间不是简单的线性关系。李莹（南京农业大学, 2012[2021-06-07]）采用菠萝蛋白酶酶解泥鳅蛋白，以ACE抑制率为指标，对时间、温度和酶/底物进行响应面优化，结果表明，各因素与响应值之间不是简单的线性关系，而是呈二次关系，且因素之间存在交互作用，与本试验结果一致。
表3 方差分析表
注：* 在 0.05 水平上显著；**在 0.01 水平上显著；***在 0.001 水平上显著。
响应面分析3D图和等高线图分别反应了两因素交互作用对响应值的影响。响应曲面投影在水平方向上形成等高线图，如图11、图12等高线形状近似圆形表示两因素间交互作用影响不显著，如图8、图9、图10、图13等高线图近似椭圆形则表示两因素间交互作用影响显著。由3D曲面图可知，对ACE抑制率影响显著的因素，曲线较陡，响应值变化较大；对ACE抑制率影响不显著的因素，曲线较缓，响应值变化较小。如图8所示，固定加酶量和pH为中心水平，酶解产物ACE抑制率随着酶解时间的增加呈现先上升后下降的趋势，图9、图10、图13结果相同。两因素交互作用对ACE抑制率的贡献率为X1X3> X1X4> X1X2> X3X4> X2X3>X2X4。
经响应面优化结果分析，碱性蛋白酶酶解番鸭血浆蛋白最佳酶解条件为：酶解时间5.85 h，酶解温度65℃，加酶量2415.91 U/g，pH 10.54，ACE抑制率理论值为66.97%。实际验证试验酶解条件为：酶解时间5.85 h，酶解温度65℃，加酶量2500 U/g，pH 10.5，验证试验结果为65.46±1.15%。预测值与验证值没有显著差异（P>0.05），模型可靠，该优化工艺可行。
Claims (4)
1.一种番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法，其步骤包括：
调节番鸭血浆初始pH至10-11，60-70℃恒温水浴10min，加入碱性蛋白酶，加酶量以番鸭血浆重量计为2200-2500 U/g， 酶解温度60-70℃，酶解反应时间5-6h，酶解反应过程每隔0.5h调节pH至初始，反应结束后调节pH至7，并于95℃水浴10min灭酶，灭酶后10000-12000 g、4℃、10min离心，取上清冻干得番鸭血浆源ACE抑制肽。
2.根据权利要求1所述的番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法，其特征是：所述的碱性蛋白酶的单位酶活为200 U/mg。
3.根据权利要求1所述的番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法，其特征是：所述的酶解温度65℃，酶解反应时间5.85 h，加酶量2500 U/g 。
4.根据权利要求1所述的番鸭血浆源ACE抑制肽的酶法制备方法，其特征是：所述的调节番鸭血浆初始pH为10.5。
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