JP7205964B2 - Ｐａｄｉ４を腫瘍マーカーとして製造した抗原、抗体及びその使用 - Google Patents

Description

本発明はＰＡＤＩ４を腫瘍マーカーとして製造した抗原、抗体及びその使用に関するものであり、分子バイオアッセイの技術分野に属する。

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ、ＰＡＤ又はＰＡＤＩ）は人体組織中の酵素の１種であり、現在、全部で５種類のＰＡＤ酵素（即ちＰＡＤ１、２、３、４及び６）を発見した。これらの酵素は、ヒト染色体のｌｐ３６領域に位置する遺伝子群によってコードされ、様々な組織分布を有する。カルシウムイオンの存在下で他のいくつかの組織タンパク質にポスト翻訳修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をすることができる。この酵素は、ポリペプチド鎖中のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）のアミノ基をカルボニル基に触媒することで、アルギニンをシトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）に変換することができる。シトルリンは非自然アミノ酸である。ＰＡＤにより触媒されるポリペプチド中のアルギニンをシトルリンに変換するこの過程をシトルリン化（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｉｏｎ）と呼ぶ。シトルリン化したタンパク質は、構造が変化するため、その酵素活性、代謝活性、調節機能や構造機能がすべて変化する。したがって、シトルリン化はリン酸化、アセチル化、グリコシル化、メチル化、ユビキチン化と同様に重要なタンパク質の翻訳後修飾の手段である。

近年、免疫学、細胞生化学及び分子遺伝学の研究により、ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４ Ｐｅｐｔｉｄｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ４、又はＰＡＤＩ４）はヒト関節リウマチの発病過程において非常に重要な役割を果たすことが証明され、しかも腺癌のマーカーとして、腺癌の臨床診断試薬の製造に使用することができる。組織チップなどのスクリーニング技術を用いて、ＰＡＤＩ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）は多種の悪性腫瘍組織と患者の血液中（乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮癌、卵巣癌など）の発現レベルが著しく高くなり、各種の良性腫瘍、慢性炎症（胃平滑筋腫、子宮筋腫、子宮頸部ポリープ、胆嚢炎、子宮頸部炎、滑膜炎など）及び健常人に低発現又は発現しないことを発見した。これらの結果はＰＡＤＩ４が腫瘍の発病過程と密接に関連しているだけでなく、多種の悪性腫瘍組織に発現し、広いスペクトル性と検出可能性を有する腫瘍マーカーであることを示した。

特許文献１：中国特許文献ＣＮ１０１１０１２９０Ａ（出願番号２００６１００７０３９２．４）は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４からなる腫瘍血清マーカーを開示しており、ここで、前記腫瘍とは、乳癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌の１つを指す。また、腫瘍を検出する臨床診断試薬の製造における前記腫瘍血清マーカーの使用を開示する。本発明により提案された腫瘍血清マーカーを用いて製造した腫瘍臨床診断試薬又はキットは、１つの指標のみを検出することにより、被験者が悪性腫瘍に罹患しているか否かの事前判定を可能とし、それにより、より少ない費用でより短い検出時間で検診を行うことができ、臨床診断のための信頼性の高い根拠を提供することができる。しかし、現在、中国国内ではまだ患者の血清中のＰＡＤＩ４を検出するキットが確立されておらず、主要な技術障害として、抗原としてヒト由来ＰＡＤＩ４タンパク質とし、昆虫バキュロウイルスの発現系を用いて組換え発現を行い、Ｎ末端に精製用にＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐタグを追加し、細胞としてｓｆ９細胞を用い、可溶性タンパク質を抗原として獲得する必要がある。発現精製試験をしたところ、ＰＡＤＩ４はｓｆ９細胞に発現しており、最適な発現条件は３０ｕｌウイルスプラスミド（Ｍ．Ｏ．Ｉ．～１）がＳｆ９細胞を３日間感染することであり、その技術障害は発現精製後の収率が低いことであり、収率は０．３４ｍｇ／Ｌ、純度は８０％しかなく、モノクローナル抗体を製造するのに必要な抗原量は少なくとも３．５ｍｇであり、そのため、十分な抗原を獲得するのに体積を大きく拡大する必要があり、また、抗体の製造は免疫、融合、亜クローン及びスクリーニングと株決定、抗体生産の段階を経なければならず、ＰＡＤＩ４タンパク質とＰＡＤＩ２タンパク質の相同性が高いため、スクリーニング時に交差反応を除去する必要があることも、この技術の発展を阻害する主要な難題である。

そのため、高感度、高特異性及び安定性のＰＡＤＩ４検出キットを開発し、乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮癌、卵巣癌などの癌血清中のＰＡＤＩ４の検出に用いることは、上記の腫瘍のスクリーニング、診断や治療に対して重要な意義がある。

中国特許文献ＣＮ１０１１０１２９０Ａ（出願番号２００６１００７０３９２．４）

従来技術の欠点に対して、本発明は、再現性が高く、安定性に優れ、広いスペクトル及び検出可能性を有し、腫瘍の臨床診断に有用な腫瘍診断キットの製造における、ＰＡＤＩ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）の使用を提供する。

上記目的を達成するために、本発明は以下の技術案を採用する。

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４を腫瘍マーカーとして製造した抗原であって、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されている。

上記抗原の発現遺伝子においては、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されている。

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４を腫瘍マーカーとして製造した抗体１３５－Ｂ９であって、１本の重鎖と１本の軽鎖から構成され、重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されている。

上記抗体１３５－Ｂ９の発現遺伝子においては、重鎖のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、軽鎖のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示されている。

ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４を腫瘍マーカーとして製造した抗体１９７－Ａ５であって、２本の重鎖と１本の軽鎖から構成され、重鎖のアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示されている。

上記抗体１９７－Ａ５の発現遺伝子においては、重鎖のヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示され、軽鎖のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示されている。

上記抗体１３５－Ｂ９及び抗体１９７－Ａ５の有効成分としての腫瘍検出試薬の製造における使用。

腫瘍診断キットであって、
タンパク質ＰＡＤＩ４モノクローナル抗体で被覆されたＥＬＩＳＡプレート、対照サンプル、洗浄液、停止液、希釈液、ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＨＲＰ－ＳＡ）及びワサビペルオキシダーゼ発色基質を含み、
前記タンパク質ＰＡＤＩ４モノクローナル抗体は抗体１３５－Ｂ９及び抗体１９７－Ａ５を含む。

本発明によれば、好ましくは、前記ＥＬＩＳＡプレートは９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。

本発明によれば、好ましくは、前記対照サンプルは、人工的に合成されたＰＡＤＩ４タンパク質である陽性対照を含む。

本発明によれば、好ましくは、前記希釈液は１０ｍｌのＦＢＳ（ウシ胎児血清）を９０ｍｌのＰＢＳＴ溶液に加え、均一に混合して得られる５％ＦＢＳ－ＰＢＳＴである。

本発明によれば、好ましくは、前記洗浄液はｐＨ７．４のＰＢＳ溶液にＴｗｅｅｎ－２０を０．１体積％加えて均一に混合したＰＢＳＴ溶液である。

本発明によれば、好ましくは、前記停止液は、２ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液である。

本発明によれば、好ましくは、前記ワサビペルオキシダーゼ発色基質は、濃度３０質量％の過酸化水素をクエン酸緩衝液で１０００倍希釈した発色液Ａと、濃度２０質量％のジメチルスルホキシドを含有するクエン酸緩衝液にテトラメチルベンジジンを０．４ｍｇ／ｍｌの割合で加えて製造した発色液Ｂとを含む。

本発明によれば、好ましくは、前記抗体１３５－Ｂ９は、ＥＬＩＳＡプレートに被覆され、抗体１９７－Ａ５は、ビオチン標識抗体１９７－Ａ５である。

上記の腫瘍診断キットの製造方法であって、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されている抗原を製造するステップ（１）と、
１本の重鎖と１本の軽鎖から構成され、重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されている抗体１３５－Ｂ９を製造するステップ（２）と、
２本の重鎖と１本の軽鎖から構成され、重鎖のアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示され、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示されている抗体１９７－Ａ５を製造し、ビオチンで標識し、ビオチン標識抗体１９７－Ａ５を製造するステップ（３）と、
ステップ（２）で製造した抗体１３５－Ｂ９をＥＬＩＳＡプレートに被覆した後、キットを組み立てて腫瘍診断キットを製造するステップ（４）とを含む。

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（３）の標識は、具体的には、
ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で溶解し、濃度２０ｍｇ／ｍｌのビオチン溶液を得るステップ１）と、
抗体１９７－Ａ５をＰＢＳ緩衝液に溶解し、炭酸塩緩衝液（ＣＢＳ）を用いてｐＨ８．５に調整し、濃度１～１０ｍｇ／ｍｌの抗体１９７－Ａ５溶液を得るステップ２）と、
抗体１ｍｇあたりビオチン溶液を５μｌ加える割合で、ステップ１）で製造したビオチン溶液とステップ２）で製造した抗体１９７－Ａ５溶液を混合し、室温で遮光下２時間撹拌するステップ３）と、
液体（抗体緩衝液とビオチン緩衝液の混合液）を収集し、ＰＢＳ緩衝液を用いて透析し、その過程でＰＢＳ緩衝液を３～４回交換するステップ４）とを含む。

本発明によれば、好ましくは、前記ステップ（４）の被覆は、具体的には、
このように製造した１３５－Ｂ９モノクローナル抗体を直接吸着法を用いてｐＨ９．６のＰＢＳ緩衝液で４μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルの添加量で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃の条件で２時間放置した後、洗浄液で洗浄し、脱水することにより、１３５－Ｂ９モノクローナル抗体で被覆された９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを得る。

原理の説明
ＰＡＤＩ４は腫瘍マーカーとして広いスペクトルを有する識別性を持っている。既存のマーカーは、せいぜい２～３種類の腫瘍を識別する。ＰＡＤＩ４及びその産物であるシトルリン化アンチトロンビンは乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮癌、卵巣癌などの患者の血液中に顕著に発現する。ＰＡＤＩ４をマーカーとする検出技術は低コストで腫瘍健康センサスや外来初診に用いることができる。ＰＡＤＩ４は腫瘍マーカーとしての作用機序が明確であり、腫瘍治療の進展状況を判断する理論的基礎がある。現在の腫瘍マーカーの作用機序はほとんど不明であるため、腫瘍治療効果のモニタリングに用いることができない。ＰＡＤＩ４はアンチトロンビン、細胞ケラチンや細胞フィブロネクチンを修飾することによって腫瘍毛細血管の増殖を刺激し、細胞アポトーシスを抑制することができる。試験により、高発現のＰＡＤＩ４はＰ５３癌抑制遺伝子の下流遺伝子に対する制御を妨害できることを発見した。そのため、ＰＡＤＩ４をマーカーとする本キットは臨床検査において広いスペクトル性と特異性を有する。

有益な効果
本発明は、特異的な抗原で免疫を行い、抗体１３５－Ｂ９及び抗体１９７－Ａ５を得るものであり、一般的な酵素結合免疫吸着試験を基に、ビオチンとワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンとの高い増幅作用により、被験サンプル中のタンパク質ＰＡＤＩ４の発現レベルを測定する高感度ビオチン－アビジン－酵素結合免疫検出キットを確立した。本発明のタンパク質ＰＡＤＩ４検出キットを用いると、ヒト血清中の腫瘍タンパク質ＰＡＤＩ４レベルを効果的かつ安定的に測定することができ、その特異性が高く、試験の再現性が良い。

腫瘍タンパク質のモノクローナル抗体１３５－Ｂ９と１９７－Ａ５の精製後両抗体の変性ゲル及び非変性ゲルのＰＡＧＥ図である。 腫瘍タンパク質のモノクローナル抗体１３５－Ｂ９で抗原を識別したＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析結果である。 ＥＬＩＳＡ法を用いる、乳癌、乳癌術後、乳腺線維患者及び健常人の血清の４５０ｎｍにおける吸収ピークにおけるＰＡＤＩ４の発現レベルの検出である。 ＥＬＩＳＡ法を用いる、肝癌、肝癌術後、肝海綿状血管腫患者及び健常人の血清の４５０ｎｍにおける吸収ピークにおけるＰＡＤＩ４の発現レベルの検出である。 ＥＬＩＳＡ法を用いる、卵巣癌、卵巣癌術後患者及び健常人の血清の４５０ｎｍにおける吸収ピークにおけるＰＡＤＩ４の発現レベルの検出である。 ＥＬＩＳＡ法を用いる、前立腺癌、列腺癌術後、前立腺肥大患者及び健常人の血清の４５０ｎｍにおける吸収ピークにおけるＰＡＤＩ４の発現レベルの検出である。 抗体ペアの組み合わせ１３５（４μｇ／ｍｌ）～１９７（０．５μｇ／ｍｌ）に対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５（４μｇ／ｍｌ）～１９７（０．２５μｇ／ｍｌ）に対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５（２μｇ／ｍｌ）～１９７（０．２５μｇ／ｍｌ）に対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５（１μｇ／ｍｌ）～１９７（０．２５μｇ／ｍｌ）に対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５（４μｇ／ｍｌ）～１９７（０．１２５μｇ／ｍｌ）に対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５（２μｇ／ｍｌ）～１９７（０．１２５μｇ／ｍｌ）に対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５（１μｇ／ｍｌ）～１９７（０．１２５μｇ／ｍｌ）に対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５－１９７ｂｉｏｔｉｎに対応する検量線の図である。 抗体ペアの組み合わせ１３５－１２２ｂｉｏｔｉｎに対応する検量線の図である。

以下では、本発明の技術案について、実施例及び明細書の添付図面を参照してさらに説明するが、本発明の特許範囲はこれに限定されない。

試薬由来
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート：ブランドＣｏｒｎｉｎｇ、商品番号：３５９９；
ＰＡＤＩ４抗原タンパク質：人工合成；
健常人の血清：山東省腫瘍病院健康診断人群から；
ワサビペルオキシダーゼ－ストレプトアビジン：ブランドＪａｃｋｓｏｎ、商品番号：０１６－０３０－０８４；
洗浄液と停止液はすべて普健生物科技有限公司から購入；
ワサビペルオキシダーゼ発色基質：ＴＭＢ発色液、普健生物科技有限公司から購入。

実施例１
タンパク質ＰＡＤＩ４モノクローナル抗体の製造：
（１）抗原の製造：
ａ）コドン最適化、遺伝子合成
タンパク質ＰＡＤＩ４は合計６６３ＡＡｓ、分子量７４．４７ＫＤａであり、シグナルペプチドがなく、膜貫通らせんがなく、２６５－２７１ ＡＡｓに疎水性の強い領域がある。相同性の比較結果と組み合わせたところ、可溶性タンパク質を抗原とする必要があり、大腸菌系の可溶性発現タンパク質ＰＡＤＩ４の１－２６０ ＡＡｓ（疎水領域を除去し、相同性は比較的低い）でマウスを免疫してモノクローナル抗体を製造し、ベクターとしてｐＥＴ２８ｂを採用し、Ｃ末端をベクター上の６ Ｈｉｓタグに連結し、酵素切断部位をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩとした。

ｂ）プラスミド抽出（キット名：Ｅｎｄｏ－ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｉ（５０）、ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ）：
１）一晩で培養した菌液４ｍＬを１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した後、菌体を収集した。
２）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉを２５０μＬ加えて細胞を再懸濁させた。
３）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩを２５０μＬ加え、４～６回軽く反転させて菌体を十分に分解し、室温で２ｍｉｎ放置した。
４）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩを３５０μＬ加えた直後、白色の綿状沈殿が出現するまで数回反転させて均一に混合し、１２，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。
５）前のステップで収集した上清を吸着カラムに移し、１２，０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、収集管内の廃液を廃棄した。
６）吸着カラムにＢｕｆｆｅｒ ＨＢを５００μＬ加え、１２，０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、収集管内の廃液を廃棄した。
７）吸着カラムにＤＮＡ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを７００μＬ加え、１２，０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した後、廃液を廃棄し、洗浄を１回繰り返した。
８）空のカラムを１２，０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離した。
９）吸着カラムを無菌の遠心管に置き、５０μＬの無菌水を加え、室温で２ｍｉｎ放置し、１２，０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、プラスミド溶液を遠心管に収集し、操作を１回繰り返した。

ｃ）プラスミドでＤＨ１０Ｂａｃを形質転換した。
１）ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を氷上で解凍した。
２）１００μｌ高効率ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞を予冷した１．５ｍｌのチューブに注入した。
３）細胞にステップｂ）で製造したプラスミドＤＮＡを３μｌ加え、軽く混合した。
４）氷上で３０分間インキュベートした。
５）４２℃で９０秒間熱ショックをした。
６）すぐに氷上で２分間放置した。
７）非耐性ＬＢ培地を９００μｌ加えた。
８）３７℃、１８０ｒｐｍで振とう培養を４時間した。
９）それぞれ１０μｌ、２０μｌ、３０μｌを取って異なる濃度でＬＢプレートに塗布し、濃度ごとに３枚のＬＢプレートに塗布し、ここで、ＬＢプレートは５０μｇ／ｍｌ Ｋａｎ、７μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、１０μｇ／ｍｌ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、１００μｇ／ｍｌ Ｘ－ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌ ＩＰＴＧを含む。
１０）３７℃のインキュベーターで４８時間遮光培養した。

ｄ）白青プラークスクリーニング及び検証
１）ステップｃ）で培養した白色クローンを採取し、新しいＬＢプレート（５０μｇ／ｍｌ Ｋａｎ、７μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、１０μｇ／ｍｌ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、１００μｇ／ｍｌ Ｘ－ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌ ＩＰＴＧ）に再ストリークし、３７℃で４８ｈ遮光培養した。
２）１６個の白プラーククローンを、それぞれ５０μｇ／ｍｌ Ｋａｎ、７μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉ、１０μｇ／ｍｌ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅを含有する液体５ｍｌに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。
３）ＰＣＲで組換えＢａｃｍｉｄを検証し、１～１６番号のモノクローナル菌株を選択して検証した。
４）ＰＣＲで同定された陽性クローンからキットで組換えプラスミドＤＮＡ（キット名：Ｅｎｄｏ－ｆｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｉ（５０）、ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ）を抽出した。

ｅ）組換えバキュロウイルスＰ１世代を製造した（６ウェルプレートによるＳｆ９細胞のトランスフェクション）
１）抗生物質含有ＳＦＸ培地をウェルあたり２ｍｌ含む６ウェルプレートに９×１０^５ Ｓｆ９細胞を接種し、２７℃で１時間培養した。
２）トランスフェクション試薬の準備：精製した組換えプラスミドＤＮＡ２μｇを、抗生物質を含まないＳＦＸ培地１００μｌに加え、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬を完全に混合し、５～１０回反転混合し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬を６μｌ吸い出し、抗生物質を含まないＳＦＸ培地１００μｌに加え、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬をプラスミドＤＮＡを含む培地に加え（総体積約２１０μｌ）、室温で軽く３ｍｉｎ混合し、室温で１５分間インキュベートした。
３）ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合体のインキュベーション中に、細胞から培地を除去し、抗生物質を含まない無血清培地２ｍｌで洗浄し、洗浄培地を廃棄した。
４）混合体を含有する各チューブに抗生物質を含まない無血清培地０．８ｍｌを加え、軽く均一に混合し、細胞含有ウェルに混合体を加えた。
５）２７℃で５時間培養した。
６）培養液を除去し、全培地５ｍｌ（ペニシリン５０単位／ｍｌとストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、血清５％）を細胞に加えた。
７）２７℃で１週間培養後、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清をＰ１ウイルス株（ｃｕｌｔｕｒ ｍｅｄｉｕｍ）とした。

ｆ）Ｐ１世代の発現試験
１）遠心分離により得られた細胞をＰＢＳ緩衝液１０ｍｌに加え、２ｓの間隔で２ｓ超音波処理し、合計３ｍｉｎとし、上清（ｎａｔｉｖｅ）と沈殿（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）を１２０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を８Ｍｕｒｅａ＋ＰＢＳで溶解した。
２）収集したウイルスの上清（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）、上清（ｎａｔｉｖｅ）と沈殿（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）を、それぞれ１２μｌ取ってサンプルとし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％、８０ｖ濃縮ゲル、２０ｍｉｎ、１２０ｖ分離ゲル、４５ｍｉｎ）にかけて発現を検証した。

ｇ）Ｐ２世代ウイルスの製造
１）Ｐ１世代の発現の試験結果により、目的タンパク質の発現が示され、Ｐ２世代のウイルス製造を継続した。
２）体積２００ｍｌの細胞を用意し、体積２００μｌのＰ１世代ウイルスを加えた。
３）２７℃の高湿度インキュベーターで細胞を１週間培養し、５００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離して細胞と破片を棄却し、上清を収集してＰ２世代ウイルスを得た。

ｈ）ＭＯＩ試験
１）６ウェルプレートに細胞状態の良い細胞上清３０ｍｌ（２×１０^５細胞／ｍｌ）を加えた。
２）その中にそれぞれ３０μｌ、１５０μｌ、３００ｕｌのＰ２世代ウイルス液を加え、４８ｈと７２ｈ培養した後、それぞれ１．５ｍｌをサンプリングして発現試験同定を行った。
３）収集したサンプルに２ｓの間隔で２ｓ超音波処理を行い、合計３ｍｉｎとし、上清（ｎａｔｉｖｅ）と沈殿（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）を１２０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を８Ｍｕｒｅａ＋ＰＢＳで溶解した。
４）ＳＤＳ－ＰＧＡＥ同定も同様であった。

ｉ）２００ｍｌ精製試験
１）ＭＯＩ試験結果により、Ｐ２世代ウイルスを３０μｌ選択して７２ｈ感染することを精製試験条件とした。
２）２００ｍｌの細胞を良好な状態まで培養し、検出した細胞密度が３×１０^６となると、３０μｌのＰ２世代ウイルスを加え、７２ｈ培養した後、サンプルを収集した。
３）１２０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離した後に上清を収集した。
４）精製：Ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ樹脂を用いてＳＴＲＥＰタグのアフィニティー精製を行った。

（２）モノクローナル抗体の製造：
１）動物免疫：上記で製造した抗原を用いてマウスを計４回免疫し、融合前に免疫を衝撃し、１～２回融合した。
２）細胞融合及びスクリーニング：血清免疫の結果が良いマウスを選択して細胞融合に用い、１～２回融合し、融合ごとに５～６回のＥｌｉｓａスクリーニング（交差反応を検出する必要がある）を行い、１回目にモノクローナル抗体を得て、株化して腹水を生産し、ペアリングをした。もしペア抗体が得られなかった場合は、２回目の細胞融合を行い、２回目の融合で得られた細胞株を株化して腹水を生産し、次に、１回目で得られた細胞株とともにペアリングした。これにより、タンパク質ＰＡＤＩ４モノクローナル抗体を安定的に分泌する能力を有する２つのハイブリドーマ細胞株が得られ、それぞれハイブリドーマ細胞株１３５－Ａ１－Ｂ９、ハイブリドーマ細胞株１９７－Ｃ１１－Ａ５と命名された。
３）腹水の生産及び精製：培養したハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔に注射し、１～２週間かけて腹水を生産し、ｐｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇにより腹水を精製し、精製した後にタンパク質ＰＡＤＩ４モノクローナル抗体１３５－Ｂ９と１９７－Ａ５を得た。

図１には、腫瘍タンパク質モノクローナル抗体１３５－Ｂ９と１９７－Ａ５の精製後両抗体の変性ゲル及び非変性ゲルのＰＡＧＥ図が示されており、第１レーンは１３５－Ｂ９モノクローナル抗体変性後の重鎖と軽鎖のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果、第２レーンは１９７－Ａ５モノクローナル抗体変性後の重鎖と軽鎖のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析結果、第３レーンは１３５－Ｂ９モノクローナル抗体変性前のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果、第４レーンは１９７－Ａ５モノクローナル抗体変性前のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。図２には、モノクローナル抗体１３５－Ｂ９で抗原を識別したＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ解析結果が示されており、第１レーンは１３５－Ｂ９モノクローナル抗体で０．５μｇ抗原を識別したＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析結果、第２レーンは１３５－Ｂ９モノクローナル抗体で０．２５μｇ抗原を識別したＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析結果である。
４）精製後の抗体力価の検出：モノクローナル抗体について間接ＥＬＩＳＡ法で力価を検出し、１：６４０００より大きいものは合格であり、そうでない場合は当該抗体に対応する細胞株を再培養し、細胞をマウスに注射して腹水精製抗体を生産した。
５）精製した抗体の標識（Ｂｉｏｔｉｎ）
ｉ）Ｂｉｏｔｉｎを濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＦで溶解した。
ｉｉ）抗体を最終濃度１～１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、ＣＢＳを用いてｐＨ８．５に調整した。
ｉｉｉ）抗体１ｍｇあたりビオチン溶液５μｌを加え、室温で遮光下２時間撹拌した。
ｉｖ）反応物を収集してＰＢＳを用いて一晩透析し、途中でＰＢＳを３～４回交換した。

ビオチン化モノクローナル抗体１９７－Ａ５
１）Ｂｉｏｔｉｎを濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＦで溶解した。
２）抗体を最終濃度１～１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、ＣＢＳを用いてｐＨ８．５に調整した。
３）抗体１ｍｇ当たりビオチン溶液５ｕｌを加え、室温で遮光下２時間撹拌した。
４）反応物を収集してＰＢＳを用いて一晩透析し、途中でＰＢＳを３～４回交換した。
上記の成分を従来の方法で組み立てて腫瘍診断キットとした。

９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの被覆：
直接吸着法を用いて、上記で製造した１３５－Ｂ９モノクローナル抗体をｐＨ９．６のＰＢＳ緩衝液で４μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルの添加量で加え、３７℃の条件で２時間放置した後、洗浄液で洗浄し、脱水することにより、１３５－Ｂ９モノクローナル抗体で被覆された９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを得た。

実施例２
実施例１に記載のキットの使用ステップは次のとおりである。
１）抗体固相化プレートを室温に回復して平衡化した。
２）標準サンプル希釈液（ＰＡＤＩ４）を加え、希釈液を用いて計７個の勾配で１０ｎｇ／ｍｌから０．０１５６２５ｎｇ／ｍｌに希釈し、１ウェル当たり１００μｌとし、最後のウェルを空白対照とし、希釈液１００μｌを加え、測定サンプル１００μｌ、３７℃、１．５ｈとした。
３）ＰＢＳＴ ３００μｌでプレートを５回洗浄し、液体で乾かした。
４）１９７－Ｃ１１－Ａ５－Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｂｉｏを加え、使用前に希釈液で２μｇ／ｍｌに希釈し、１ウェル当たり１００μｌ、３７℃、１ｈとした。
５）ＰＢＳＴ ３００μｌでプレートを５回洗浄し、液体で乾かした。
６）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを加え、使用前に希釈液で１：２０００に希釈し、１ウェル当たり１００μｌ、３７℃、３０ｍｉｎとした。
７）ＰＢＳＴ ３００ｕｌでプレートを５回洗浄し、液体で乾かした。
８）ＴＭＢ発色を行い、すなわち、１ウェル当たり１００μｌとし、３７℃で１０ｍｉｎ発色した。
９）２Ｍ塩酸で停止し、１ウェルあたり５０μｌとした。
３、検出結果：
停止液を添加してから１５ｍｉｎ以内に、酵素結合装置を用いて４５０ｎｍの波長条件下で各検出ウェルの光学濃度ＯＤ値を検出し、検出キットの検出基準は、被測定血清のＯＤ値が以上の場合には検出サンプルを陽性と判定し、そうでない場合には検出サンプルを陰性と判定することである。検出の結果、本発明で製造された被覆９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの変動係数ＣＶ値は２０％未満であり、同一ロット及び異なるロットの検出キットに対して試験を行い、試験の結果、ロット内及びロット間のキットのＣＶ値はいずれも２０％未満であり、このことから、本発明のＰＡＤＩ４検出キットは高い精密性を有することが示された。

実施例３ 本発明のＰＡＤＩ４検出キットを用いた臨床サンプルの検出：
実施ケース１：乳癌１１２例、乳癌術後８６例、肝細胞癌７７例、肝細胞癌術後２４例、食道癌６４例、食道癌術後２４例、胃癌９４例、胃癌術後４３例、結腸癌２ｌ例、結腸癌術後１５例、直腸癌１９例、直腸癌術後２８例、膵臓癌２１例、膵臓癌術後６例、卵巣癌２９例、卵巣癌術後１１例、及び性別と年齢が一致した正常対照群１６０例を検出し、結果を表１に示す。

すべての試験データは３回の繰り返し試験によって得られ、ｔ検定をしたところ、ＰＡＤｌ４は乳癌、肝細胞癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌の各種悪性腫瘍患者の血清中に健常対照群と比較して非常に高い発現があり、統計学的有意差があった（Ｐ＜０．０５）。乳癌、肝細胞癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌などの術後患者血清中のＰＡＤｌ４発現は明らかに低下した。

実施ケース２：ＥＬＩＳＡ法を用いて腫瘍患者の血液を検出したところ、ＰＡＤＩ４及びその産物であるシトルリン化アンチトロンビンは乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮癌、卵巣癌などの患者の血液中で顕著に発現し、一方、健常人では発現しない或いは発現量が非常に低いことを発見した。図３に示すように、ＥＬＩＳＡ法を用いて各種腫瘍患者及び術後と健常人の血清中のＰＡＤＩ４の発現レベルを測定した。棒グラフの各カラムは、患者又は健常人の血清の４５０ｎｍにおける吸収ピークを表している。結果により、一部の良性腫瘍、腫瘍切除手術後の患者血清と健常人血清とを比較すると、ＰＡＤＩ４は乳癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌などの悪性腫瘍患者血清中の発現レベルが明らかに高くなった。

比較例１
タンパク質ＰＡＤＩ４の発現レベルの検出における本発明の技術案の顕著な効果をさらに説明するために、本発明の研究開発過程において同一条件下でスクリーニングした他の抗体を選択して、本願に記載の抗体の効果と比較する。
（１）二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ検出システムの構築：スクリーニングした２６個のモノクローナル細胞株を抗体生産に供し、精製後、力価が良い抗体を２１株選択してビオチン標識を行い、チェッカーボード滴定実験を用いて、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法により２６株のモノクローナル抗体と１８株のビオチン標識抗体がペアになるかどうかを検出し、ＰＡＤＩ４タンパク質を標準タンパク質とし、ＰＡＤＩ２タンパク質を陰性対照とし、９株の捕捉抗体と９株のビオチン標識抗体を選択し、次のステップの内生性検出を行った。
（２）ペア抗体による内因性サンプルの検出：チェッカーボード滴定実験を用いて、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、スクリーニングした９株のモノクローナル抗体と９株のビオチン標識抗体のペアリングを検出し、スクリーニングしたこれらの抗体を捕捉抗体としてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、ビオチン標識抗体を検出抗体、ＰＡＤＩ４タンパク質を標準タンパク質、ＰＡＤＩ２タンパク質を陰性対照タンパク質、甲から提供された陽性血清と陰性血清を内因性サンプルとして、それぞれ２つずつペアリング検証を行った。チェッカーボード滴定実験により、Ｐ／Ｎ値が最も大きく（次の表２に示す）、反応が最も敏感な１０群の抗体ペアを選択し、次の最適化実験を行った。

（３）最適抗体ペアの予備スクリーニング：前のステップで決定された１０群の抗体ペア（表２参照）について、勾配希釈されたＰＡＤＩ２タンパク質、ＰＡＤＩ４タンパク質、陽性血清、陰性血清を検出し、結果は次のとおりである。

表３のデータから、１０群の抗体ペアはすべて陰性対照タンパク質ＰＡＤＩ２を識別せず、交差反応がないことを示している。

表４のデータから、１０群の抗体ペアはすべて陽性対照タンパク質ＰＡＤＩ４を識別できることを示している。

表５のデータから、陽性血清ＯＤ／陰性血清ＯＤが３倍より大きい５群の抗体ペアの組み合わせ（１、２、３、５及び６縦列）を選択し、次の捕捉抗体と検出抗体の条件最適化を行い、ここで、捕捉抗体１３５に３つの濃度勾配（１／２／４μｇ／ｍｌ）を設定し、５つの検出抗体にそれぞれ３つの濃度勾配（０．５／１／２μｇ／ｍｌ）を設定してＰＡＤＩ４タンパク質（濃度０．１μｇ／ｍｌ～０．００１５６２５μｇ／ｍｌ倍比希釈）、陰性血清（希釈倍数１／２／４倍）、陽性血清（希釈倍数１／２／４倍）を検出し、プレーティングを表６に示す。

データを表７（黒太字はＰＡＤＩ４データ－検量線、３、４、７及び８縦列のＤ、Ｅ、Ｆ行は陰性血清データ（１／２／４倍希釈）、残りの黒非太字は陽性血清データ）に示す。

表７のデータから分かるように、陰影充填部分のデータは、血清希釈倍数の増加に伴い、ＯＤ値が低下する傾向にあり、対応する抗体ペアの組み合わせは１３５（４μｇ／ｍｌ）～１９７（０．５μｇ／ｍｌ）であり、対応する検量線は表８及び図７に示される。

（４）抗体ペアの組み合わせ１３５（４μｇ／ｍｌ）～１９７（０．５μｇ／ｍｌ）についてさらに条件最適化をして抗体ペアの最適作動濃度を決定した。
〔１〕条件最適化：捕捉抗体１３５に３つの濃度勾配（４／２／１μｇ／ｍｌ）を設定し、検出抗体１９７にそれぞれ３つの濃度勾配（０．５／１／２μｇ／ｍｌ）を設定してＰＡＤＩ４タンパク質（濃度５０ｎｇ／ｍｌ～０．７８１２５ｎｇ／ｍｌ倍比希釈）を検出した。
〔１〕に基づいて〔２〕条件最適化を行った：捕捉抗体１３５に１つの濃度勾配（４μｇ／ｍｌ）を設定し、検出抗体１９７にそれぞれ２つの濃度勾配（０．２５／０．１２５μｇ／ｍｌ）を設定してＰＡＤＩ４タンパク質（濃度５０ｎｇ／ｍｌ－０．７８１２５ｎｇ／ｍｌ倍比希釈）を検出した。
〔２〕に基づいて、〔３〕条件最適化を継続した：捕捉抗体１３５に３つの濃度勾配（４／２／１μｇ／ｍｌ）を設定し、検出抗体１９７にそれぞれ２つの濃度勾配（０．２５／０．１２５μｇ／ｍｌ）を設定してＰＡＤＩ４タンパク質（濃度５０ｎｇ／ｍｌ～０．７８１２５ｎｇ／ｍｌ倍比希釈）を検出した。
各条件の組み合わせデータを表９～表１４及び図８～図１３に示す。

以上の６つの抗体ペアデータを総合的に比較し（Ｒ^２値、同一抗原濃度に対応するＯＤ値、検出抗体濃度値（感度））、抗体ペアの最適作用濃度は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ１３５（４μｇ／ｍｌ）－ＰＡＤＩ４タンパク質（５０ｎｇ／ｍｌ～０．７８１２５ｎｇ／ｍｌ）－１９７－ｂｉｏ（０．１２５μｇ／ｍｌ）であった。

まとめ：
プレーティング及び検出されたデータから、３つの希釈倍数（１×、２×、４×）における陽性血清、陰性血清及び空白対照のＯＤ値から、各希釈倍数における陽性血清ＯＤ／陰性血清ＯＤ値の比（空白背景値を差し引いた値）を算出し、結果を表１５に示す。

以上のデータを総合的に比較したところ、各抗体ペアはそれぞれＰＡＤＩ４タンパク質とＰＡＤＩ２タンパク質を測定し（クロススクリーニング除去）、及び陽性血清、陰性血清のＯＤ値をスクリーニングして５群の抗体ペアを決定する。この５群の抗体ペアは、同じ血清希釈度を検出した場合に、抗体ペアの陽性血清／陰性血清の比（比が高く、陽性と陰性の区別度が良い）を比較すると、１３５－１９７ｂｉｏｔｉｎと１３５－１２２ｂｉｏｔｉｎの方が良く、対応する検量線を表１６～表１７及び図１４～図１５に示す。

両抗体ペアの感度（同じ抗原濃度に対応するＯＤ値）と検量線の相関性（Ｒ^２）について比較したところ、１３５－１９７ｂｉｏｔｉｎ抗体ペアはすべて１３５－１２２ｂｉｏｔｉｎより顕著に優れていた。

Claims (3)

1. ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４を抗原として製造した抗体１３５－Ｂ９であって、
   ２本の重鎖と２本の軽鎖から構成され、前記重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、前記軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されている抗体１３５－Ｂ９。
2. 前記重鎖のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、前記軽鎖のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示され、前記重鎖と前記軽鎖が別々の鎖上に存在し、２つの遺伝子からなる組成物である請求項１に記載の抗体１３５－Ｂ９の発現遺伝子。
3. 腫瘍は、乳癌、肝細胞癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌又は卵巣癌であることを特徴とする、ＰＡＤＩ４をマーカーとする腫瘍検出試薬の製造における、請求項１に記載の抗体１３５－Ｂ９の有効成分としての使用。
   

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