CN105092844A - 胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒及检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，包括CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗，以及用于形成双抗夹心的酶标二抗。本发明还提出一种包括有上述检测试剂盒的胰腺癌检测系统。本发明的检测芯片和检测试剂盒以用针对本发明通过“差减法”的方式筛选得到的CRP、ICAM-1、OPG和CA19-9这四种胰腺癌蛋白生物标记物，进行免疫制备特异性CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗为基础，并且结合双抗夹心的酶标二抗，通过抗原-抗体的特异性结合并联合双抗夹心的二抗从而对上述生物标记蛋白进行检测，具有比较高的准确性和特异性。

Description

胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒及检测系统

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒及检测系统。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。通常发病后的患者，5年生存率<1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。

导致胰腺癌预后生存率如此低的重要原因在于胰腺癌早期无任何症状，难以在胰腺癌发病潜伏期或者初期被检测发现，从而贻误最佳的治疗时间。主要难以被检测发现是因为在发病初期无任何症状，而且目前所能采用的检测精确度最好的CA19-9、CEA、CA242胰腺癌检测标记物进行检测时，有一定的阳性率，且不具备高特异性。根据统计数据显示，采用上述标记物在胰腺癌孕育期检测(癌变之前)敏感性较低，如发病前1年，有68％的敏感性，发病前两年，敏感性为53％。而采用其他的常规临床技术检测，如B超、CT、MRI、ERCP、PTCD、血管造影、腹腔镜等检查到发现癌变时已处于癌症中晚期，极大耽误了诊断和治疗。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够准确性和特异性更好的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，包括CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗，以及用于形成双抗夹心的酶标二抗。

在上述双抗夹心的试剂盒的基础上，本发明进一步还提出一种包括上述胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒的检测系统。

本发明的检测试剂盒和检测系统，以针对本发明通过“差减法”的方式筛选得到的CRP、ICAM-1、OPG和CA19-9这四种胰腺癌蛋白生物标记物，进行免疫制备特异性CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗为基础，并且结合双抗夹心的酶标二抗，通过抗原-抗体的特异性结合并联合双抗夹心的二抗从而对上述生物标记蛋白进行检测，具有比较高的准确性和特异性。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例检测芯片中固相基质上的点样孔的排布示意图；

图2为本发明实施例胰腺癌蛋白生物标记物的检测芯片封装之后的整体形状示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提出一种胰腺癌蛋白生物标记物，包括CRP(C反应蛋白)、ICAM-1(细胞间黏附分子-1)、OPG(骨保护素)和CA19-9(糖链抗原19-9)。

本发明根据对胰腺癌的检测和检查，提出上述生物标记物，相比现有临床分析的手段和通常用的CA19-9、CEA、CA242胰腺癌检测标记物，本发明的标记物更加准确。本发明的上述生物标记物组合的发现和提出基于本身生物标记物是反映疾病存在和状态的一种可测量的指示物，在疾病、应激和康复的过程中，任何的生理变化最终都能在蛋白水平上得到体现，是疾病研究最直观的手段；并且多个蛋白生物标志物组群与慢性病患者的临床及预后密切相关，表明同步联合测定多个蛋白因子有助于更全面的了解疾病进程。

上述提出的生物标记物组合中的蛋白，属于疾病所特有的调节性蛋白。由于组织液，如血浆中蛋白种类过千，浓度范围跨度高达10¹⁰，用最先进性的仪器也只能测到浓度范围跨度10³；为攻克健康背景蛋白对疾病特有的调剂蛋白的干扰。在本发明采用差异分析的方法筛选到以上标志蛋白，并进行了验证。具体筛选过程如下：

(1)选取已知身体状况的受试者共210例，其中健康对照55例，胰腺癌初期患者(未转移)65例，发生转移胰腺癌患者90例。(本研究已被伦理审核机构批准，所有受试者均签署知情同意书。)

分别取受试者血液样本2ml，加入1％肝素，于4度，3500RPM离心15min后将血浆分装分别根据患病与否分为健康对照血浆样本、胰腺癌初期(未转移)患者血浆样本和发生转移胰腺癌患者血浆样本；

(2)然后用健康对照血浆样本作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体；并用该制备的多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱；

(3)将胰腺癌初期患者样本，发生转移胰腺癌患者样本分别用上述亲和层析柱上样过柱子，收集流穿液。

由于体液如血浆中蛋白种类过千，浓度范围跨度高达10¹⁰，目前最先进性的仪器也只能测到浓度范围跨度10³；目前用抗体亲和去除样品中20到100多个高丰度蛋白，尽管提高了对低丰度蛋白的检出率，当相对于血浆中1000多个蛋白来说，残留的相对高丰度蛋白对目前癌症所用标志物的ng浓度和癌症发生发展孕育期相关标志物的pg浓度的分析信号仍然存在严重的淹没效果。基于以上原因，本发明采用差减法技术，用健康对照的血浆样本作为抗原免疫家兔，制备抗健康对照血浆蛋白的多克隆抗体，采用这一抗体作为亲和吸附介质制备层析柱，便能将患者血浆样本中的大量健康相关蛋白特异性吸附去除，从而尽可能多地获得疾病相关，排除健康相关高丰度蛋白的干扰。

低丰度差异表达蛋白在富集之后，由于去除了大量的高丰度蛋白的背景干扰，而且在量进行了富集之后，便能用SDS-PAGE和质谱的手段分析和检测出来了。

(4)将上述收集到的流穿液用质谱技术鉴定及定量蛋白

前期筛选阶段，健康对照组、胰腺癌初期患者(未转移)、发生转移胰腺癌患者分别进行质谱鉴定，重复三次，每组蛋白三次重复中共同鉴定到的蛋白分别鉴定到210、320和378个蛋白。

因本发明旨在寻找胰腺癌早期生物标志物，其中仅在胰腺癌初期患者(未转移)、发生转移胰腺癌患者中均出现，但在健康对照中未出现的蛋白有45个。在健康对照组、胰腺癌初期患者(未转移)、发生转移胰腺癌患者均出现的蛋白有179个。本试验主要针对仅在胰腺癌初期患者(未转移)、发生转移胰腺癌患者中共同出现的45个蛋白进行分析。

通过文献报道和生物信息学分析(GeneOntology和KEGGPathway分析)对在建康对照中未出现，但在胰腺癌患者血浆中出现的45种进行分析，功能注释。发现CRP(C反应蛋白)，ICAM-1(细胞间黏附分子-1)、OPG(骨保护素)、CA19-9在胰腺癌发生、发展过程中发挥着非常重要的作用。

(5)ELISA法验证

利用ELISA确认上述差异蛋白在正常对照和各疾病组血液中的表达量。具体地说，利用稀释缓冲液将血浆1：100稀释，然后利用针对不同蛋白生物标志物的ELISA板测量不同疾病组血液中生物标志物的含量，每个样本重复测量三次。ELISA技术检测的结果数据用SPSS14.0软件处理，以平均值±标准差表示。用ANOVA进行正态分布数据的组间比较；用受试者工作特性曲线(ROC)分析各种生物标志物预测的准确性、特异性及灵敏性。检测的结果如下表1，从表1的结果显示，胰腺癌组血浆中CRP(C反应蛋白)、ICAM-1(细胞间黏附分子-1)、OPG(骨保护素)、CA19-9的表达量显著高于健康对照，且随着患者病情的严重(蛋白尿增加)而增加。

表1ELISA验证4种胰腺癌早期标志物

注：ND:NoDifference；*p<0.001vs.健康对照；

进一步利用受试者工作特性曲线(ROC)分析胰腺癌患者和健康对照血液中的四种生物标志物，结果表明CRP(C反应蛋白)，ICAM-1(细胞间黏附分子-1)、OPG(骨保护素)、CA19-9曲线下面积(AUC)分别为0.892(p<0.01)、0.858(p<0.01)、0.907(p<0.01)和0.901(p<0.01)。敏感性和特异性分析显示，当选取最高“youden”指数时，血液中四种生物标志物的灵敏度、特异度和浓度截断值的结果见下表2，从表2结果表明这4种蛋白分子可能参与了胰腺癌发生发展过程，为可信的胰腺癌早期生物标记物。

表2胰腺癌患者和健康对照中各生物标记物的ROC分析对比结果

差异蛋白	灵敏度	特异度	浓度截断值
				CRP(C反应蛋白)	80.8％	76.2％	65mg/ml
ICAM-1	71.2％	60.5％	456ng/ml
				OPG	79.6％	55.2％	721pg/ml
CA19-9	84.7％	85.8％	39U/ml

(6)以上述四种蛋白标记物对另100名胰腺癌早期检查验证

对另100名胰腺癌早期患者，通过健康对照的测定结果及四种蛋白分子浓度截断值来确定这4种蛋白标志物相对含量参考正常范围，结合四种生物标志物测量结果来判断。对各种组合进行统计处理，比较不同组合的灵敏度和特异度，其结果参见下表3。其中，表3中符号“∩”表示的组合中，该组合所含的所有生物标志物均为阳性(即高于截断值)时，计算灵敏度和特异度。在符号“∪”表示的组合中，该组合所含的生物标志物有一个为阳性时即判断为阳性，计算灵敏度和特异度。

表3用于诊断早期胰腺癌蛋白生物标志物组合灵敏度和特异性：

组合	灵敏度	特异度
			CA19-9∪OPG	0.933	0.665
CA19-9∩OPG	0.55	0.942
			CA19-9∪CRP	0.92	0.594
CA19-9∩CRP	0.547	0.983
			CA19-9∪ICAM-1	0.968	0.615
CA19-9∩ICAM-1	0.527	0.941
			ICAM-1∪OPG	0.923	0.505
ICAM-1∩OPG	0.541	0.969
			ICAM-1∪CRP∪OPG	0.989	0.4707
ICAM-1∩CRP∩OPG	0.532	0.983
			ICAM-1∪CRP∪OPG∪CA19-9	0.989	0.475
ICAM-1∩CRP∩OPG∩CA19-9	0.536	0.983

根据上表3的组合检测的结果表明，这表示根据实验目的选择生物标志物的组合，能高效、特异的用于疾病诊断；而且还可以进一步确定，灵敏度高的组合(CA19-9∪OPG；CA19-9∪CRP；CA19-9∪ICAM-1；ICAM-1∪OPG；ICAM-1∪CRP∪OPG；ICAM-1∪CRP∪OPG∪CA19-9)适合于初次筛查；相反，特异度高的组合(CA19-9∩OPG；CA19-9∩CRP；CA19-9∩ICAM-1；ICAM-1∩OPG；ICAM-1∩CRP∩OPG；ICAM-1∩CRP∩OPG∩CA19-9)适合二次检查或三次检查等需要进行可靠性更高的判断检查。例如，若在初次筛查时出现阳性，此时通过特异度较高的组合方法对初次检查结果进行二次判定，最终给出有效且可靠的早期胰腺癌诊断参考结果。

本发明在上述胰腺癌蛋白生物标记物组合的基础上，进一步提出胰腺癌蛋白生物标记物的检测芯片，检测芯片包括：固相载体，以及固定在该固相载体上的CRP单抗，ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗。

本发明的胰腺癌蛋白生物标记物的检测芯片，通过在固相载体上固定上述蛋白质生物标记物的单克隆抗体，通过对应的单抗捕获能与之特异性结合的待测蛋白，从而实现对存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等待测样品中的目的标记蛋白进行分离；之后再经洗涤、纯化、确认和生化分析；即可得到待测样品中的这些生物标记蛋白的差异表达结果。

其中，上述胰腺癌蛋白生物标记物的检测芯片中所包含的4种生物标记蛋白的单抗，在本发明中采用家兔作为免疫体进行免疫制备单克隆抗体，比如以CRP单抗的制备为例，具体包括：

(1)选用4个月左右的雌性小白鼠进行CRP蛋白的免疫注射，注射后该CRP蛋白作为抗原通过血液循环或淋巴循环进入家兔外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞；

(2)在免疫达到目标程度时处死家兔，取家兔脾脏；细碎之后酶消化法消化成单细胞悬液，并用肿瘤细胞进行细胞融合杂交；

(3)细胞融合之后用HAT选择性培养基进行选择性培养，筛选成功融合的杂交细胞；

(4)再将成功融合的细胞有限稀释法进行杂交细胞的克隆培养；培养之后采用免疫方法，筛选出能产生CRP蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞；并将该阳性杂交瘤细胞进行体外培养，培养的过程中适时诱导其表达，结束后分离培养液即可得到CRP单抗。

分别制备得到上述CRP单抗，ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗之后，然后采用共价交联或者非共价交联的方式将其固定至固相载体上即可。

在实施中作为蛋白质芯片的固相载体一般可以从硝酸纤维素膜、尼龙膜、金膜、平板或者玻璃基片中进行选用。在本发明中基于上述单抗所要进行低丰度差异蛋白特异性吸附的目的，优选采用硝酸纤维素膜或玻璃基片。其原因在于，硝酸纤维素膜自身是渗透滤膜，而且经过硝基化的纤维素微孔薄膜，为空结构的容量较大，而且对蛋白质有很强的结合力。

而其中采用玻璃基片主要是方便、廉价、处理简便，而且具有足够的稳定性和惰性，能非常适于本发明产品的大规模商业化生产。但是，在使用中需要针对本发明的特点对该玻璃基片进行处理，因为作为蛋白载体的玻璃基片是玻璃片多采用表面羟基先用N，N-二乙氧基氨丙基三乙氧基硅烷做表面处理；然后偶联抗体蛋白，但是玻璃基片有非常强的非特异性吸附，容易造成很严重的背景干扰，尤其是在本发明中所要检测的上述4种目的蛋白都是低丰度蛋白时，大量的高丰度蛋白的干扰程度会更为强烈。所以本发明采用玻璃基片作为固相载体使用时，用PEG(聚乙二醇)对玻璃基片进行表面处理，用PEG处理的表面比硅化表面信号强度更好，能提高大分子分析元件(如配体)与其结合的能力，并可以减弱非特异性结合；这是因为PEG的空间结构大，从而降低了蛋白质之间的空间位阻，可以提升亲和吸附的特异性。

为了便于本发明上述蛋白芯片检测的对比，本发明的上述蛋白芯片上还固定有阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照可以采用IgG单克隆抗体，这个阳性对照的IgG单克隆抗体最好采用上述相同免疫机体制备，比如上述CRP单抗采用家兔为免疫体制备，那么该IgG单克隆抗体也最好对应以家兔为免疫体制备；采用该阳性对照，检测目的蛋白的结合情况。当然，对应上述阳性对照，阴性对照可以采用样品上样的点样稀释液，其不含有任何可结合的蛋白，正好作为空白对照。

为了方便结果对比并防止交叉污染等情况，本发明的上述蛋白芯片的固相载体上设置点样孔，且这些点样孔可以按照矩阵式或者阵列式的方式设置于固相载体的表面上，然后将对应用于检测生物标记蛋白的单抗固定在这些点样孔中。采用该点样孔的结构进行操作检测，一方面点样孔中的蛋白质可以很好地分离，而使交叉污染降到最小；另一方面，孔的凹陷结构可以利于添加和保存点样缓冲液等等，避免点样之后的样品在孵育时出现干化等问题；第三，可以对点样孔的规则和尺寸进行标准化设定，从而利于对点样的量进行横向比对，即可精确控制点样量，还更加利于横向对比及结果的计算。

出于与上述胰腺癌蛋白生物标记物的检测芯片更加便捷的进行情况，本发明还提出一种胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒；试剂盒中包括用于特异性检测上述胰腺癌蛋白生物标记物的CRP单抗，ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗。用与上述蛋白生物标记物对应的单克隆抗体制备试剂盒，进行特异性的检测。用该试剂盒检测可以多种方法实现，比如将上述4种单抗分别作为层析介质制成层析柱，然后对待测样品进行过柱，之后再辅助电泳、质谱等手段进行检测。或者也可以采用酶标抗原的方式进行，将待测的样品蛋白进行酶标之后与上述4种单抗分别进行亲和反应，反应之后对各自单抗结合的酶标抗原进行信号检测。

但是上述两种检测的方法均不方便，因为了更进一步提升检测的便利性和准确性，本发明的上述试剂盒参考双抗夹心法辅助搭配辅助试剂，进一步辅助试剂包括样品稀释缓冲液，本发明中采用含有1.5％～2％BSA(牛血清白蛋白)稳定剂的30～70mM的PBS磷酸盐缓冲液作为该样品稀释缓冲液；采用该样品稀释缓冲液进行样品稀释和洗涤，其中BSA是蛋白的稳定剂，防止蛋白的分解和非特异性吸附；且BSA还能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素，从而减轻检测过程中有些蛋白的变性。

为了提升试剂盒试剂检测中的结果检测和灵敏性分析，本发明的上述试剂盒进一步按照双抗夹心法的原理还需辅助搭配酶标二抗；在对待测样品点样之后，各目的蛋白会被对应的单抗捕获而亲和吸附结合，此时再添加过量酶标二抗用于与目的蛋白结合，生成夹心体结构；那么结合上的酶标二抗的量就能反应待测样品中目的蛋白的表达情况，通过计算酶标二抗所携带的信号就可得到目的蛋白的结果数据。其中在本发明实施中，上述酶标二抗可以采用比较通用的含HRP(辣根过氧化物酶)的酶标二抗进行，在满足准确性的情形下，也省去了自行设计制造的麻烦。

同时，为了便于对之后酶标二抗信号的检测，在试剂盒中进一步还可以包含有浓缩洗涤液含有1～2％BSA、0.03～0.07％吐温-20的PBS，用于浓缩酶标二抗和信号检测的显色成分。当然，对应需要在之后添加显色剂，TMB(四甲基联苯胺)底物液。

当然，为了便于双夹心法进行检测，在试剂盒中还可以提供固相基质，该固相基质在实施中是类似于上述芯片的基质，充当载体和反应介质的功能。具体的形状和形态也可以参见上述芯片中的描述，在使用的过程中，根据试剂盒说明书的指示将对应的单抗固定至固相基质的点样孔中，然后进行待测样品的检测；当然如果本发明试剂盒中不提供该固相基质载体，实施中也可以借用ELISA试剂盒的点样板进行。

同时，为了便于结果的对比分析，试剂盒中可以提供标准品、阳性对照和阴性对照。对照的设置可以参见上述芯片中的描述，而其用法与待测样样品相同，使用时与待测样品同步进行操作，之后将结果进行比对，提供对比参照。

基于上述胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，本发明还提出一种包括有上述胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒的胰腺癌检测系统。本发明的检测系统是基于试剂盒使用时，无法单独直接得到直观的结果，因此进行添加与该试剂盒配合的检测装置设备如CCD检测仪等同类似的这些检测信号设备进行组合；这些装置和仪器可以对试剂盒使用中的试剂的结合变化信号进行检测，最终直接输出明确的直观数据结果，制成一个整体。

本发明的这一包括检测试剂盒的检测系统，将试剂盒产品和与试剂盒能配套使用的设备等等一并组合，通过抗原-抗体的特异性结合从而对上述生物标记蛋白进行检测，最终能完整直接得出检测的直观数据结果，更加便利和直观、准确。

为说明本发明所采用的生物标记物的准确性和应用试剂盒进行检测结果的真实性，以及使上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，以下通过具体的实施例和实际分析数据进行举例说明。

实施例1

实施例1用于说明采用本发明的上述生物标记物进行胰腺癌检测的准确性和应用试剂盒进行检测结果的真实性。

S11，制备固相基质载体(以硝酸纤维素膜为例进行)：

获取基质硝酸纤维素膜，并按照设计的(点阵形式为5*5阵列，如图1所示，图1中标示1为定位点、2为阳性对照点样孔、7为阴性对照点样孔、3为CRP点样孔、4为ICAM-1点样孔、5为OPG点样孔、6为CA19-9点样孔)的排列方式和点样位置在膜上制备具有检测指标涂层的点样孔，封闭；最后干燥，封装后于4℃保存，之后的形状如图2所示；

S12，在固相基质上固定CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗，其中以CRP单抗为例进行说明(其中CRP单抗的制备参见上述实施例中的家兔免疫的制备过程，在此不再赘述；剩余ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗的固定方式参照该过程进行)：

首先将0.01～0.5mg/mL的CRP单抗于50mMpH7.2的PBS缓冲液中，制备用于固定的单抗溶液；

用戊二醛活化硝酸纤维素膜载片上的点样孔后，用100μl先前制备的单抗溶液在点样孔上进行点样，然后盖上盖片，孵育固定5h左右。然后，孵育完成之后用50mMpH7.2的PBS缓冲液洗涤三到四次，去除未结合的抗体和杂质后晾干备用；

为了将戊二醛活化点样孔中要固定CRP单抗的那部分(不与目的蛋白CRP在表面上反应的那部分)封闭，在点样孔上在滴加含有2％BSA的50mM的pH7.2PBS缓冲液溶液；然后盖上盖片孵育2h；用BSA封闭过的载片前后表面用50mM的pH7.2PBS缓冲液溶液洗涤三到四次，晾干备用。

S13，获取待检测的尿液样品，然后与阴性对照和阳性对照用样品稀释液(含有1.5％～2％BSA稳定剂的30～70mM的PBS缓冲液)稀释3倍后，分别加入检测的点样孔中，每个反应孔加样0.1mL，每个样品做3次平行试验，置37℃孵育1小时使充分反应，后弃去孔内溶液，用浓缩洗涤液洗涤3次；

S14，每孔加入酶标工作液(含HRP的酶标二抗)100ul，37℃孵育30分钟，震荡洗涤3次，每次1分钟；

S15，将与酶标工作液配套的显色剂TMB(四甲基联苯胺)底物液加入芯片反应区域上，每孔加20ul，进行化学发光。

S16，用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果，确定这些生物标记蛋白的表达量是否正常。

采用上述实施的过程，对500名受试者(年龄层次58～70)的上述生物标记蛋白进行检测，检测结果统计发现，其中有24名受试者根据上表3的组合类别的方式进行二次判定为疑似胰腺癌患者；在后续的半年内对这24非正常的受试者进一步进行跟踪和再次临床检验和综合症状分析。结果表明，24人中有22人被确诊为胰腺癌患者(其中，6人属于已经扩散的类型，其中有16人属于初期未扩散的类型)，剩余2人认定不属于胰腺癌患者，而是其他干扰病症。

从最终的统计结果看，本发明针对上述标记物的检测试剂盒，其以双抗夹心法为基础，对应构建检测上述生物标记物的亲和抗体进行检测，具有比较高的准确性和敏感性。而且相比目前CA19-9、CEA、CA242胰腺癌检测标记物，能涵盖胰腺癌发病早期的状况而不至于错过治疗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，包括CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗，以及用于形成双抗夹心的酶标二抗。

2.如权利要求1所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP的酶标二抗。

3.如权利要求1或2所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于固定所述CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗的固相基质。

4.如权利要求1或2所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，所述固相基质上具有呈矩阵设置的点样孔，所述CRP单抗、ICAM-1单抗、OPG单抗和CA19-9单抗通过共价交联的方式固定于所述点样孔内。

5.如权利要求1或2所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标显色剂，且该酶标显色剂为TMB。

6.如权利要求1或2所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释缓冲液，且该样品稀释缓冲液为含有1.5％～2％BSA的30～70mM的PBS缓冲液。

7.如权利要求1或2所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括浓缩洗涤液，且该浓缩洗涤液为含有1～2％BSA、0.03～0.07％吐温-20的PBS缓冲液。

8.如权利要求1或2所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，且该阳性对照为人IgG单克隆抗体。

9.一种包括权利要求1至8任一项所述的胰腺癌蛋白生物标记物的检测试剂盒的胰腺癌检测系统。